MiR-199-3p melhora a regeneração muscular e melhora a distrofia muscular e muscular envelhecida

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Experimentos de parabiose sugerem que fatores moleculares relacionados ao rejuvenescimento e envelhecimento circulam no sangue. Aqui, mostramos que miR-199-3p, que circula no sangue como um miRNA livre de células, é significativamente diminuído no sangue de camundongos idosos em comparação com camundongos jovens; e miR-199-3p tem a capacidade para aumentar a diferenciação miogênica e regeneração muscular. A administração de mimetizadores de miR-199, que fornecem miR-199-3p, a camundongos idosos resultou em hipertrofia da fibra muscular e atraso na perda de força muscular. A administração sistêmica de mimetizadores de miR-199 a camundongos mdx, um modelo animal bem conhecido de distrofia muscular de Duchenne (DMD), melhorou significativamente a força muscular de camundongos. Em conjunto, o miR-199-3p livre de células no sangue pode ter um efeito antienvelhecimento, como efeito hipertrófico em fibras musculares envelhecidas, e pode ter potencial como um novo RNA terapêutico para DMD, bem como para doenças relacionadas à idade. As descobertas nos fornecem novos insights sobre os miRNAs circulantes no sangue como moléculas relacionadas à idade.

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Funções vitais, como força muscular, funcionamento do sistema nervoso, função respiratória, defesa contra infecções e resistência contra doenças, declinam com o envelhecimento. Doenças e disfunções associadas a esse declínio funcional estão aumentando e se tornando grandes problemas nas sociedades em envelhecimento. Várias mudanças, como alterações metabólicas e de regulação gênica, ocorrem no corpo com o envelhecimentol-3; e estudar tais mudanças pode ajudar a compreender o envelhecimento e fornecer estratégias para lidar com os problemas enfrentados pelas sociedades que envelhecem. Biomoléculas (incluindo genes) relacionadas ao envelhecimento foram identificadas e podem ser úteis na pesquisa do envelhecimento; por exemplo, a expressão de -galactosidase e plolnk4a está associada à senescência celular4-6, e um modelo de camundongo sem o gene klotho é conhecido como um modelo de envelhecimento com vários fenótipos, assemelhando-se ao envelhecimento prematuro humano.

A parabiose é a união entre dois indivíduos que compartilham um sistema vascular comum, podendo ser gerada experimentalmente por cirurgia8. Experimentos com parabiose, em que roedores jovens e idosos foram unidos para compartilhar um sistema vascular comum, mostraram que o processo de envelhecimento em animais jovens foi acelerado, enquanto animais idosos foram rejuvenescidos9-12. Os achados sugerem fortemente que certos fatores relacionados ao rejuvenescimento e envelhecimento estão presentes e circulando com sangue no sistema vascular, porém, tais fatores circulantes ainda não são totalmente compreendidos13.

Cistanche pode anti-envelhecimento

MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes de 21-23-nucleotídeos longos, que são processados ​​a partir de transcritos mais longos (miRNAs primários) por digestão, com um complexo microprocessador no núcleo e Dicer no citoplasma, e incorporados em o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC)14,15.MiRNA em RISC funciona como um mediador no silenciamento de genes, onde a tradução de RNAs mensageiros (mRNAs) com complementaridade parcial ao miRNA é inibida ou mRNAs carregando sequências quase complementares ao miRNA são digerido14,15.Extrato de Cistanche Anti RadiaçãoAssim, os miRNAs desempenham papéis importantes na regulação do gene através da supressão da expressão do gene alvo. Milhares de genes de miRNA foram encontrados em animais e plantas [veja o banco de dados de microRNA (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml]. O perfil de expressão de miRNAs foi examinado, e expressão específica de tecido e estágio de desenvolvimento e expressão associada a doença de miRNAs foram detectadas16-21. A regulação gênica envolvendo miRNAs está intimamente relacionada a várias funções vitais e fenômenos da vida, incluindo doenças14,16,21-24

Os miRNAs estão presentes tanto fora quanto dentro das células25. Por exemplo, os miRNAs estão presentes no sangue como nucleotídeos livres de células e circulam no sistema vascular2627. Esses miRNAs livres de células (cf-miRNAs) são incorporados em pequenas vesículas denominadas vesículas extracelulares ou associadas a proteínas, ganhando proteção contra nucleases extracelulares25,28. A presença de alguns cf-miRNAs pode ser significativa; por exemplo, associações significativas entre cf-miRNAs e certas doenças foram detectadas26,27,29-31. Cf-miRNAs podem refletir mudanças na condição física; assim, tais miRNAs podem ser biomarcadores potenciais para monitoramento de sistemas de manutenção da vida, bem como de doenças.

O presente estudo foi conduzido para examinar associações entre cf-miRNAs e envelhecimento, e cf-miRNAs no sangue de camundongos jovens e idosos foram investigados. Os resultados revelaram mudanças nos cf-miRNAs entre sangue de camundongos jovens e envelhecidos. Entre esses miRNAs, miR-199-3p foi marcadamente diminuído no sangue envelhecido em comparação com o sangue jovem. Curiosamente, miR-19-3p tem a capacidade de aumentar a diferenciação e regeneração muscular, e sua administração a camundongos idosos resultou na expansão da fibra muscular. Quando miR-199-3p foi introduzido em camundongos mdx, um modelo animal de distrofia muscular de Duchenne (DMD), a força muscular de camundongos foi marcadamente melhorada. O presente estudo fornece novos insights sobre cf-miRNAs circulantes no sangue em termos de envelhecimento, capacidade latente e aplicações médicas.

Resultados

Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>23-camundongos C57BL/6J de um mês de idade, usando microarray de DNA para identificar diferenças relacionadas à idade. O perfil de cf-miRNAs exibiu diferenças marcantes entre camundongos jovens e idosos, ou seja, cf-miRNAs que são tendenciosos para sangue de camundongo jovem e envelhecido foram detectados (Tabela 1). Desses miRNAs, miRNAs miogênicos (por exemplo, miR-1 e miR-133)1833 estavam presentes no grupo de miRNA que é abundante em sangue jovem; em outras palavras, os miRNAs miogênicos foram marcadamente menores em sangue envelhecido (Tabela 1).cistanche herbaA diferença nos miRNAs entre sangue jovem e envelhecido foi confirmada pela reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR; Fig. la), e posteriormente reproduzida usando fontes de RNA extraídas de pequenas vesículas, chamadas exossomos, isoladas do plasma ( Fig.1 suplementar).

Experimentos de cultura de células, por outro lado, revelaram que o soro de camundongo jovem tinha a capacidade de induzir a diferenciação miogênica, e a capacidade era mais forte do que a de camundongos idosos (Fig. 1b). O fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I), que é o principal fator capaz de induzir a diferenciação miogênica no sangue34,35, foi examinado; no entanto, nenhuma diferença significativa foi observada entre sangue jovem e envelhecido (Fig. lc). Assim, outros fatores além do IGF-I no sangue jovem podem estar implicados na diferenciação miogênica.

miR-199-3p é capaz de induzir fortemente a diferenciação miogênica. Investigamos os efeitos de miRNAs abundantes no sangue jovem na diferenciação miogênica. MiRNAs sintéticos foram introduzidos em células C2C12, uma linhagem celular de mioblastos de camundongo, e a expressão de marcadores de diferenciação miogênica, os genes da miogenina (Myog) e da cadeia pesada 1 da miosina (Myh1), foi examinada. Os resultados foram inesperados e atraíram nosso interesse: miR-199-3p, que foi previsto como um miRNA negativo devido à pouca informação sobre diferenciação miogênica, induziu marcadamente a expressão de Myog e Myh1 (Fig. 2a, b). Além disso, a indução de miR-199-3p foi mais forte do que a de miRNAs miogênicos convencionais: a expressão da cadeia pesada de miosina na presença de miR-199-3p foi particularmente notável (Fig. 2b, c).

Para esclarecer a relação entre miR-199-3p e diferenciação miogênica, investigamos miR-199-3p celular e extracelular (exossomal) durante a diferenciação miogênica, e também os efeitos de inibidores de miR-199-3p sobre a diferenciação. A expressão de (celular)miR-199-3p endógeno foi regulada positivamente após o início da diferenciação. Exossomal miR-19-3p foi aumentado uma vez e diminuído posteriormente (Fig. 2a suplementar). O tratamento com inibidor suprimiu a expressão de marcadores de diferenciação miogênica, Myog, Myh1 e creatina quinase (Ckm) (Fig. 2b complementar).crescimento do pênis cistancheAssim, os achados sugerem que o miR-199-3p participa da diferenciação miogênica.

Projetando mímicas miR-199. Nós projetamos mímicas miR-199 de modo que as mímicas possam produzir miR-199-3p eficientemente como um mediador funcional (fita guia) no silenciamento de genes. Os mimetizadores de miRNA projetados foram selecionados e miR199#4 foi selecionado como um mimetizador de miR-199 competente (Fig. 3 suplementar). Posteriormente, miR199#4 foi usado em experimentos in vivo e in vitro.

Genes alvo de miR-199-3p na diferenciação miogênica. Para identificar genes alvo para miR-199-3p sob diferenciação miogênica, procuramos genes candidatos no banco de dados TargetScan e focamos nos genes Lin28b e Suz12, ambos expressos em mioblastos C2C12. Lin28b e Suz12 possuem sequências de ligação miR-199-3p putativas em sua região 3' não traduzida (UTR; Fig. 3a). Demonstramos que as sequências putativas são sítios de ligação autênticos para miR-19-3p, usando os genes repórteres da Luciferase que transportam as sequências de ligação e as sequências incompatíveis correspondentes (Fig. 3a, b). Os genes Luciferase que carregam as sequências de ligação putativas foram significativamente suprimidos por miR-199-3p [pLin28b-(81), pLin28-(983) e pSuz12-(973)], enquanto que o sequências incompatíveis, que possuem mutações de substituição de base na semente [pLin28b-(81)mut, região, revogou seu efeito de supressão [pSuz12-(973)mut]. pLin28-(983)mut, e quando mimetizadores de miR-199 foram introduzidos em células C2Cl2, a expressão de Lin28b e Suz12 foi suprimida de forma consistente (Fig. 3c). Para avaliar se a supressão de Lin28b e/ ou Suz12 contribui diretamente para a diferenciação miogênica, a inibição específica de Lin28b e Suz12 foi realizada por silenciamento gênico, usando interferência de RNA (RNAi; Fig. 3d, e). Como esperado, a expressão de marcadores de diferenciação miogênica, como Ckm, Myh1 e Myog foi regulada positivamente sob o silenciamento dos genes Lin28b e Suz12 (Fig. 3f, g).

Como Lin28b é uma proteína de ligação a RNA envolvida no processamento de miRNAs3637, investigamos os efeitos de mimetizadores de miR-19 via Lin28b no processamento de miRNA miogênico. O nível de miR-1, um importante miRNA miogênico, foi examinado porque o processamento de seu precursor é regulado por Lin28b37. O miR-1 amadurecido foi significativamente aumentado pelo tratamento de imitação do miR-199 (Fig. 3h), sugerindo que o miR-199-3p pode regular a expressão funcional do miR-1 por meio da supressão de seu alvo Lin28b. Em conjunto, os resultados sugerem que o miR-199-3p está envolvido na diferenciação miogênica por meio da supressão de seus genes-alvo, Lin28b e Suz12.

Aprimoramento da regeneração muscular por miR199#4 em camundongos com lesão muscular.benefícios da salsa cistacheExaminamos os efeitos de um mimetizador de miR-199 (miR199#4) in vivo usando modelos de lesão muscular (Fig. 4a, b). Camundongos C57BL/6J com oito semanas de idade foram injetados com BaClz no tibial anterior (TA) para induzir lesão muscular, e miR19#4 foi administrado nos locais danificados 24h depois. Dois dias após a administração de miR199#4, a expressão de genes marcadores miogênicos foi examinada. A expressão de Myog foi significativamente aumentada e a diferenciação miogênica 1 (Myod1) e o fator miogênico 5 (Myf5) também foram regulados positivamente pela administração de miR199#4 (Fig. 4c). Os dados são consistentes com os resultados in vitro descritos acima (Fig. 2).

A análise imuno-histoquímica dos músculos em regeneração foi realizada 9 dias após a administração de miR199#4. As áreas transversais de fibras musculares em regeneração (miofibras), caracterizadas por núcleos centrais, foram examinadas (Fig. 4b). A área transversal média de miofibras em regeneração tratadas com miR199#4 foi maior do que a de miofibras de controle tratadas com um duplex de RNA de controle não silenciador (nsCont; Fig. 4d), com a diferença aproximando-se da significância estatística. Além da área transversal média, o histograma dividido por tamanho da área transversal mostrou um aumento nas miofibras aumentadas na presença de miR199#4(Fig.4e).

Efeito hipertrófico do miR199#4 em fibras musculares envelhecidas. Examinamos os efeitos do miR199#4 em camundongos idosos (~ 24 meses de idade). Camundongos idosos exibiram uma diminuição significativa no miR-199-3p muscular (Fig. 5a), como no cf-miR-19-3p circulante, em comparação com camundongos jovens. Administramos miR199#4 aos músculos TA de camundongos idosos e, 2 dias depois, os músculos TA foram examinados por análise imuno-histoquímica (Fig. 5b). A área transversal média das miofibras tratadas com miR199#4 foi significativamente maior do que a das miofibras de controle tratadas com nsCont (Fig. 5c). Consistente com isso, a análise do histograma dividido por tamanho revelou um aumento acentuado nas miofibras aumentadas na presença de miR199#4 (Fig. 5d).

Como o cf-miR-199-3p circulante no sangue é reduzido em camundongos envelhecidos, introduzimos miR199#4 no sangue circulante de camundongos envelhecidos através do vão da cauda. Após a administração intravenosa de miR19#4, a área transversal das miofibras foi examinada e analisada, conforme descrito acima. Os resultados, conforme mostrado na Fig. 5e, são consistentes com os resultados da administração local de miR199#4 a músculos envelhecidos (Fig. 5c, d).

Deve-se notar que há uma diferença nas fibras musculares aumentadas entre o modelo de lesão muscular e camundongos idosos. Núcleos centrais são vistos em fibras musculares em regeneração (Fig. 4b), mas tais miofibras dificilmente foram detectadas em camundongos idosos tratados com miR199#4 (Fig. 5b). Isso sugere que as fibras musculares preexistentes podem se tornar aumentadas em camundongos idosos após o tratamento com miR199#4. Nós hipotetizamos que outro mecanismo diferente da regeneração muscular pode estar envolvido no aumento da miofibra em camundongos idosos e propusemos o envolvimento da via de atrofia muscular.dosagem de cistanche tubulosa redditOs genes Atroginl e MuRFI estão intimamente relacionados à atrofia muscular38, e seus níveis de expressão são significativamente elevados em músculos envelhecidos em comparação com músculos jovens (Fig. 6a). Examinamos o nível de Atroginl e MuRFI em músculos de camundongos idosos após administração sistêmica de miR199#4. Atroginl e MuRFI foram marcadamente reduzidos em vários músculos pela administração de miR19#4 (Fig. 6b), sugerindo que a supressão da via de atrofia muscular por miR199#4 pode causar expansão de miofibra em camundongos idosos.

MiR199#4 atrasa a perda de força muscular em camundongos idosos. O efeito de miR199#4 na função muscular em camundongos idosos é de interesse. O teste de força de preensão foi realizado em camundongos idosos antes e após a administração sistêmica de miR199#4. O experimento foi realizado de maneira duplo-cego; a injeção de RNA e o teste de 100% de aderência foram realizados por diferentes experimentadores sem compartilhar informações. Camundongos C57BL/6 ({10}}semana de idade) machos foram testados para aderência e, 1 semana depois, foram injetados por via intravenosa com miR199#4 e nsCont e testados novamente. A mudança na força muscular após a injeção de miR199#4 foi que MiR199#4 melhora a força muscular de camundongos mdx. Como o miR199#4 tem um impacto positivo nos músculos, realizamos um experimento para avaliar o efeito da administração do miR199#4 em camundongos mdx, um modelo animal bem conhecido de DMD32. Camundongos mdx de oito semanas de idade foram injetados por via intravenosa com miR199#4(1,6 mg/kg) duas vezes (intervalo de 1 semana), e o teste de aderência foi realizado 1 semana após a última administração. O experimento foi realizado de maneira duplo-cego como mostrado na Fig.7. Os resultados (Fig. 8a) mostram uma melhora significativa na força muscular em camundongos mdx tratados com miR199#4 em comparação com camundongos mdx tratados com nsCont. Além disso, diminuições significativas na atividade da creatina quinase (CK) e miR livre de células-1 foram observadas no sangue de camundongos mdx tratados com miR199#4 (Fig. 8b, c), que são possíveis sinais da doença melhoria.

Como reagente de liberação de drogas, o atelocolágeno é viscoso e difícil de manusear, e os camundongos tratados com atelocolágeno parecem sofrer efeitos negativos devido ao veículo. Assim, procuramos alternativas ao atelocolágeno para melhorar nosso sistema de entrega de drogas (DDS) e encontramos lipossomas catiônicos DC-CHOL/DOPE como um novo reagente DDS que é igual ou superior ao atelocolágeno (Fig. 4 suplementar). A distribuição da droga de miR199#4 com os lipossomas catiônicos mostrou que o miR19#4 administrado foi entregue ao músculo e consistentemente absorvido em grandes quantidades no fígado (Fig. 5 Complementar). O miR199#4 extracelular entregue ao músculo pode funcionar como um mediador no silenciamento gênico e contribuir para a regulação gênica envolvida na melhora da força muscular.

Tentamos identificar biomoléculas relacionadas à melhora após a administração de miR199#4. Vários polipeptídeos relacionados à DMD foram examinados por Western blotting; no entanto, sinais distintos relacionados à melhora não foram detectados neste estudo (Fig. 6 Suplementar). Discutiremos mais esse ponto na seção a seguir.

Discussão

As biomoléculas mudam qualitativa e quantitativamente com o envelhecimento--3. Capturar tais mudanças e estudá-las são vitais para a compreensão do envelhecimento e podem revelar estratégias para lidar com os problemas das sociedades em envelhecimento. Estudos de parabiose em que animais jovens e idosos são unidos para compartilhar um sistema vascular comum forneceram informações importantes sobre envelhecimento e rejuvenescimento9-l2. Os resultados sugerem fortemente que existem fatores de rejuvenescimento e envelhecimento no sangue circulante jovem e idoso, respectivamente. Estudos anteriores relataram várias moléculas como candidatas relacionadas ao rejuvenescimento e envelhecimento, mas os resultados são controversos3.

Nossos experimentos de cultura de células in vitro usando soros jovens e envelhecidos são semelhantes aos experimentos de parabiose (Fig. lb), e encontramos miR-199-3p, que muda com a idade, no sangue circulante; o miRNA foi identificado para diminuir significativamente no sangue envelhecido (Tabela 1 e Fig. la). Além disso, a expressão de miR muscular (celular)-199-3p diminui acentuadamente em músculos envelhecidos em comparação com músculos jovens (Fig. 5a); assim, cf-miR-199-3p no sangue pode se correlacionar com miR-199-3p muscular. A diminuição da expressão de miR-199-3p com o envelhecimento também é observada em células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea de macaco rhesus39. Portanto, a expressão de miR{10}}p celular pode estar sob controle relacionado à idade. Em contraste com miR-19-3p, a expressão de miRNAs miogênicos celulares, como miR-1 e miR-133, permanece inalterada em músculos jovens e idosos (Fig. 5a), mas o nível de seus miRNAs extracelulares no sangue é marcadamente reduzido em camundongos idosos (Fig. la). A diferença entre miR-199-3p e miRNAs miogênicos (miR-1 e-133) pode refletir a diferença no processamento de cf-miRNA e/ou no controle relacionado à idade de cf-miRNAs entre eles . Para elucidar essa diferença, mais estudos precisam ser realizados no futuro.

Estudos anteriores sugeriram que o miR-199-3p participa de várias funções celulares e fenômenos vitais por meio da supressão de seus genes-alvo; por exemplo, o miRNA pode promover a proliferação e migração de células de ponta endotelial e modular o início da puberdade, respectivamente, através da regulação negativa do gene de semaforina -3A40 alvo e através da supressão de genes alvo (Cdc42, Map3k2, Map3k4 e Taok1) envolvido na via p38MAPK41. O presente estudo descobriu que miR-19-3p está envolvido na diferenciação miogênica através da supressão de seus genes alvo, Lin28b e Suz12 (Fig. 3). Lin28b é uma proteína de ligação a RNA e inibe a maturação de miRNAs, incluindo miR-1, que é um miRNA músculo-específico e promove miogênese37. A supressão de Lin28b pelo miR-19-3p causa um aumento no miR maduro-1 (Fig. 3), o que pode permitir que a diferenciação miogênica continue.

Suzl2 é uma subunidade central do complexo repressivo polycomb 2 (PRC2), que participa da repressão da cromatina42. A regulação do gene de PRC2 está envolvida na manutenção de células-tronco, desenvolvimento embrionário, proliferação e diferenciação celular, incluindo diferenciação miogênica de tais loci em miotubos diferenciados43. O silenciamento do gene contra Suz12 por RNAi causa o aumento da expressão do gene miogênico (Fig. 3). A supressão do potenciador da proteína homóloga 2 de zeste (Ezh2), outra subunidade central de PRC2, também causa diferenciação miogênica44. Esses achados sugerem que a inibição da formação de PRC2 devido à supressão de suas subunidades centrais pode desencadear a criação de um estado genômico para diferenciação muscular. Assim, a supressão de Suz12 por miR-199-3p pode induzir a diferenciação miogênica. Tomados em conjunto, miR-19-3p pode desempenhar um papel importante na diferenciação miogênica através da inibição de duas vias independentes envolvendo Lin28b e Suzl2, que estão envolvidas na manutenção do estado indiferenciado dos mioblastos.

O efeito de miR-199-3p na diferenciação miogênica também foi demonstrado in vivo (Fig. 4). O dano muscular desencadeia a proliferação e diferenciação celular devido à regeneração muscular. A introdução de miR199#4, que fornece miR-199-3p, para locais danificados, melhorou a regeneração muscular e expandiu as miofibras de regeneração (Fig. 4). A expressão do gene miogênico foi consistentemente regulada positivamente sob o tratamento com miR199#4 (Fig. 4). Do ponto de vista prático, o miR199#4 pode ser eficaz e útil para tratamentos cirúrgicos.

Quando miR199#4 foi administrado a camundongos idosos sem miR-199-3p circulante no sangue, os camundongos exibiram miofibras marcadamente expandidas (Fig. 5) e perda retardada de força muscular com o envelhecimento (Fig. 7). As miofibras expandidas em camundongos idosos diferem das miofibras em regeneração, que são aumentadas na presença de miR199#4; o primeiro é derivado de miofibras preexistentes, e o último é de neo-miofibras (miofibras recém-nascidas). Assim, existem mecanismos diferentes e independentes nos aumentos das fibras musculares. Nosso estudo sugere que (i) no primeiro caso, a inibição da atrofia muscular devido à supressão de Atroginl e MuRFI pelo tratamento com miR199#4 provoca aumento de miofibras envelhecidas e (ii) no último caso, supressão de genes alvo, Lin28b e Suz12, provoca aumento das miofibras em regeneração. Ao todo, diferentes (múltiplos) genes regulados por miR-19-3p podem estar envolvidos na hipertrofia muscular em diferentes situações. As descobertas também sugerem que o miR-199-3p pode ter pelo menos um efeito antienvelhecimento no músculo, e que o miR199#4, que fornece miR-199-3p, pode ter potencial como um novo medicamento de RNA para doenças musculares relacionadas à idade, como a sarcopenia.

Com base na alta eficácia do miR199#4 nos músculos, administramos miR199#4 a camundongos mdx, um modelo bem conhecido de DMD, e obtivemos resultados notáveis: a administração sistêmica de miR199#4 melhorou a força muscular nos camundongos em ~ 20% ( Fig.8a). Para entender o mecanismo de recuperação da força muscular, tentamos identificar biomoléculas que foram melhoradas (ou influenciadas) pelo miR-199-3p. No entanto, com exceção das melhorias de CK no sangue e cf-miR-1 (Fig. 8b, c), não conseguimos detectar tais melhorias no nível molecular. Essa dificuldade na detecção pode ser devido à população de células complexa, que consiste em uma mistura de células musculares em regeneração e ruptura em camundongos mdx. Mesmo que o miR199#4 resulte na melhoria, o alto ruído de fundo causado pela população de células complexa mascararia a evidência da melhoria. Para resolver esse problema, estudos mais extensos usando uma população de células musculares homogêneas derivadas de camundongos mdx ou com foco em vários tecidos, incluindo o músculo, precisam ser realizados.

Embora o mecanismo molecular da recuperação da força muscular pelo miR199#4 permaneça desconhecido, a dose de miR19#4 para melhora da força muscular é digna de nota. Duas vezes a administração de ~1,6 mg/kg miR199#4 melhorou a força muscular em camundongos mdx. A dose efetiva parece ser menor do que a de oligonucleotídeos antisense para salto de exon contra genes mutantes de distrofina in vivo{10}}. A razão pela qual o miR199#4 é capaz de melhorar a força muscular em doses tão baixas pode ser devido ao seu mecanismo de ação diferente em comparação com os oligonucleotídeos antisense. O mecanismo de ação do miR19#4 é o silenciamento catalítico do gene. Em contraste, o mecanismo dos oligonucleótidos anti-sentido baseia-se na hibridação física. Portanto, diferenças nas doses apropriadas para mostrar a eficácia do medicamento podem ser atribuídas aos diferentes mecanismos de ação.

O mecanismo pelo qual órgãos, tecidos ou células liberam miRNAs no sangue circulante ainda não é totalmente compreendido, e a regulação relacionada à idade na liberação de tais miRNAs também não é clara. O presente estudo mostrou que cf-miR-NAs miogênicos, incluindo cf-miR-199-3p circulam com o sangue no sistema vascular e diminuem com o envelhecimento. Tais cf-miRNAs podem estar presentes em exossomos, ou seja, são miRNAs exossomais.

Os miRNAs miogênicos participam da diferenciação miogênica, regeneração muscular e manutenção da homeostase muscular33. Estudos anteriores relataram que miRNAs miogênicos, como miR-1 e miR-133, aumentaram no sangue em resposta ao exercício físico4849. Com base nesses relatórios, camundongos jovens ativos podem liberar mais miRNAs miogênicos no sangue do que camundongos idosos de movimento lento, e esses miRNAs extracelulares, incluindo cf-miR-199-3p, podem contribuir para manter a homeostase muscular em camundongos jovens por meio de ação autócrina . No entanto, o nível de miRNA extracelular (exossomal) nem sempre se correlaciona com o nível de miRNA celular, e foram observadas diferenças em miRNAs miogênicos e miR-199-3p entre camundongos jovens e idosos (Figs. la e 5a) e durante diferenciação miogênica (Fig. 2a suplementar). Assim, como outra possibilidade, é concebível que a regulação relacionada à idade e à diferenciação da formação de exossomos possa afetar a produção de cf-miRNA; especificamente, pode haver diferenças na formação de exossomos entre camundongos jovens e idosos. No contexto dessas hipóteses, mais estudos são necessários para elucidar a liberação relacionada à idade de miRNAs miogênicos no sangue.

Além do mecanismo de liberação, quando cf-miRNAs miogênicos jovens contendo cf-miR-199-3p fluem para o sistema circulatório envelhecido a partir de um sistema vascular jovem por parabiose, os cf-miRNAs podem desencadear a ativação muscular e a inibição do músculo atrofia no lado envelhecido; este conceito é apoiado por evidências de camundongos idosos injetados intravenosamente com miR19#4 neste estudo (Figs. 5-7). Cf-miRNAs no sangue podem estar relacionados à função homeostática relacionada à idade e podem representar homeostase alterada. Quando tais cf-miRNAs estão presentes ectopicamente, por exemplo, quando cf-miRNAs no sangue jovem são transferidos para o sistema circulatório envelhecido, alguns cf-miRNAs podem apresentar efeitos rejuvenescedores no lado envelhecido, ou seja, podem produzir efeitos antienvelhecimento. Em contraste, cf-miRNAs em sangue envelhecido podem representar homeostase alterada com o envelhecimento. Quando esses cf-miRNAs são transferidos para o sistema circulante do sangue jovem, alguns cf-miRNAs podem desencadear deterioração relacionada ao envelhecimento e podem causar envelhecimento prematuro no lado jovem. Cf-miRNAs que são significativamente aumentados no sangue envelhecido representam candidatos que exigirão análise mecanística detalhada para entender e prevenir o envelhecimento.

Em conclusão, nosso estudo atual forneceu novos insights sobre cf-miRNAs como moléculas relacionadas à idade e revelou uma nova direção de pesquisa para esclarecer a relação entre envelhecimento e RNAs funcionais livres de células, incluindo cf-miRNAs.

Este artigo é extraído de BIOLOGIA DA COMUNICAÇÃO|(2021) 4:427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio