MicroRNA derivado do exossomo do leite-2478 suprime a melanogênese através da via Akt-GSK3

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In-Seon Bae e Sang Hoon Kim

Abstrato:Os exossomos participam da comunicação intercelular transferindo moléculas das células doadoras para as receptoras. Os exossomos são encontrados em vários fluidos corporais, incluindo sangue, urina, líquido cefalorraquidiano e leite. Os exossomos do leite contêm muitas moléculas de microRNA endógenas. MicroRNAs são pequenos RNAs não codificantes e têm papéis importantes em processos biológicos. As funções biológicas específicas dos exossomos do leite não são bem compreendidas. Neste estudo, investigamos os efeitos deleiteexossomosna produção de melanina em células de melanoma e melanócitos. Nós achamos issoexossomos do leite diminuídosconteúdo de melanina, atividade da tirosinase e expressão de genes relacionados à melanogênese em células de melanoma e melanócitos. O miR específico de bovinos-2478 em exossomos inibiu a produção de melanina. Descobrimos que Rap1a é um gene alvo direto de miR-2478 em células de melanoma e melanócitos. A superexpressão de MiR-2478 diminuiu a expressão de Rap1a, o que levou à diminuição da produção de melanina e à expressão de genes relacionados à melanogênese. A inibição da expressão de Rap1a diminuiumelanogêneseatravés da via de sinal Akt-GSK3. Esses resultados suportam o papel do miR-2478 derivado de milkexossomos como regulador demelanogêneseatravés da segmentação direta de Rap1a. Esses resultados mostram que os exossomos do leite podem ser ingredientes cosmecêuticos úteis para melhorarbranqueamento.

Palavras-chave: melanogênese;exossoma de leite; miR-2478; Rap1a

cistanches de ervasé um ingrediente inibidor de melanina

1. Introdução

Cosmecêutico é uma palavra composta que combina cosméticos e farmacêuticos e refere-se a cosméticos com ingredientes funcionais que têm efeitos médicos [1]. No passado, a pele era melhorada por meio de procedimentos dermatológicos, mas recentemente, o interesse pelos cosmecêuticos aumentou devido ao desejo dos consumidores de obter esses efeitos por meio de cosméticos. 2]. Os cosméticos funcionais incluem produtos que auxiliam no clareamento da pele, evitando a deposição de melanina na pele.

A melanina, importante elemento que determina a cor da pele e dos cabelos, protege a pele dos raios ultravioleta [3]. No entanto, a formação excessiva de melanina causa tom de pele irregular, por exemplo, manchas e sardas [4]. O fator de transcrição da microftalmia (MITF) é um dos principais reguladores do desenvolvimento dos melanócitos. A tirosinase (TYR) é a enzima mais importante na síntese de melanina. O processo de síntese de melanina é induzido pela ativação de TYR via MITF, que é uma importante enzima envolvida na fase inicial do processo de síntese de melanina e utiliza a forma L da tirosina ou DOPA como substrato para formar a melanina [5].

MicroRNAs (miRs) são RNAs não codificantes curtos que participam de muitos processos biológicos controlando a expressão gênica pós-transcricional [6]. Estudos também descobriram o controle da biossíntese de melanina por microRNAs. Por exemplo, foi relatado que miR-143-5p tem como alvo o gene Tak1 e reduz a expressão de MITF, inibindo assim a síntese de melanina [7]. MiR-125b, um regulador negativo demelanogênese, demonstrou regular o gene de pigmentação SH3BP4 [8], e miR-675 em exossomos secretados por queratinócitos inibemelanogênesevisando MITF [9].

Os exossomos são vesículas delimitadas por membrana de 30 a 200 nm e contêm DNA, RNA e peptídeos [10]. Os componentes internos dos exossomos podem transmitir informações com segurança para células adjacentes ou remotas sem serem degradados por enzimas em fluidos biológicos, afetando assim o microambiente ao redor de várias células [11].Exossomos de leitesão vesículas extracelulares derivadas do leite que são estáveis ​​nos processos digestivos humanos [12]. Os exossomos extraídos do leite bovino contêm não apenas várias proteínas, como caseína e lactoglobulina, mas também microRNAs, que atuam como carga [13-15]. O leite bovino contém microRNAs relacionados ao sistema imunológico, como miR-15b, miR-27b, miR-34a e miR-10). Esses microRNAs são especialmente abundantes no colostro [16].

Alguns estudos mostraram que os componentes do leite inibemmelanogêneseem melanócitos; por exemplo, proteínas como -lactoglobulina e κ-caseína no leite regulam a melanogênese [17,18]. O sobrenadante de Lactobacillus helveticus NS8-leite fermentado foi encontrado para inibir danos UV e hiperpigmentação na pele [19]. No entanto, ainda não há relato se os microRNAs do leite bovino estão envolvidos na pele.branqueamento, embora existam 79 microRNAs emexossomos de leite[13]. Portanto, neste estudo, investigamos se os exossomos do leite contendo microRNAs inibem a síntese de melanina em células de melanoma de camundongo e humano e melanócitos.

2. Materiais e métodos

2.1. Cultura de células

Células de melanoma de camundongo B16F10 foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Hyclone, Logan, UT, EUA). Células MNT-1 de melanoma humano foram cultivadas em Meio Essencial Mínimo (MEM, Hyclone). Todos os meios foram suplementados com 10 por cento de soro fetal bovino (FBS, Hyclone, EUA) e 1 por cento de uma solução de penicilina-estreptomicina. Melanócitos epidérmicos humanos normais (NHEM, PromoCell, Heidelberg, Alemanha) na passagem número 5 ou 6 foram mantidos em um meio de crescimento de melanócitos (PromoCell). Essas células foram incubadas a 37 ◦C em uma condição de atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.

2.2. Purificação de Exossomos

O leite comercial (1 mL) foi centrifugado a 2000× g por 10 min, depois o sobrenadante foi centrifugado a 10,000× g por 10 min. O sobrenadante de leite foi passado por um filtro de 0,45 µm e depois por um filtro de 0,2 µm. A solução resultante (300 µL) foi misturada com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 300 µL da solução de precipitação de exossomos Exoquick (Systems Biosciences, Palo Alto, CA, EUA) e incubada por 30 min. A mistura foi centrifugada a 10.000 x g por 30 min para obter um exossoma pellet, que foi ressuspenso em PBS. A distribuição de tamanho dos exossomos foi determinada em um Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments, Almelo, França). Os exossomos foram armazenados a -80 ◦C para uso posterior.

2.3. Microscopia Crioeletrônica

Uma alíquota de 3 µL de suspensão de exossomos frescos foi adsorvida a uma grade revestida de carbono perfurada e descarregada por incandescência (2/2-3 C C-flat; Protochips, Morrisville, NC, EUA), que foi então transferida por 3 s em 4 ◦C e congelado por imersão usando um Vitrobot Mark IV (Thermo FisherScientific, Lafayette, CO, EUA). As grades foram armazenadas em nitrogênio líquido e, em seguida, transferidas para um suporte de amostra criogênica Gatan 626 (Gatan, Pleasanton, CA, EUA). As amostras foram imagedadas com uma ampliação nominal de 29,000× em um microscópio crioeletrônico (FEI Tecnai F20 TEM,FEI, Hillsboro, OR, EUA), equipado com uma pistola de emissão de campo padrão (s-FEG) e uma câmera K2Summit (Gatan) a uma tensão de aceleração de 200 kV.

2.4. Ensaio de Viabilidade Celular (Ensaio WST)

Células de melanoma (B16F10, MNT-1) e melanócitos humanos (NHEM) foram semeados em 4 × 103 células/poço em 96-placas de poço e tratados comexossomos de leite(20 e 50 µg/mL) ou um imitador de microRNA (oligonucleotídeos de fita dupla de RNA) para cada experimento. Nos pontos de tempo indicados, a viabilidade celular foi medida usando o kit de ensaio de viabilidade celular aprimorado EZ-CyTox (Daeil Lab Service, Seul, Coréia) de acordo com as instruções do fabricante. A absorbância foi medida a 450 nm em um espectrofotômetro de microplaca Vmax (Molecular Devices, San Jose, CA, EUA).

2.5. Medição do teor de melanina

Células de melanoma e melanócitos foram tratados comexossomos de leite(20 e 50 µg/mL) por 48 h. Após lavagem duas vezes com PBS gelado, as células foram centrifugadas a 2500 x g por 10 min. Os pellets de células foram ressuspensos a 90 ◦C por 30 min em 1 N NaOH contendo 10 por cento de dimetilsulfóxido. O conteúdo total de melanina foi medido no espectrofotômetro de microplacas Vmax (Molecular Devices) a 405 nm.

2.6. Ensaio de Atividade da Tirosinase

As células do melanoma e os melanócitos foram incubados comexossomos de leitepor 48h. As células foram lavadas duas vezes com PBS e lisadas com PBS contendo 1 por cento de Triton X-100 e 0,1 mMfenilmetanossulfonilfluoreto. Após a centrifugação, o sobrenadante foi coletado e transferido para uma placa de 96-poço. Após a adição de 0,1 ML-3,4-diidroxifenilalanina, as amostras foram incubadas a 37 ◦C por 1 h. A atividade da tirosinase foi medida com base na absorbância em 475 nm usando o espectrofotômetro de microplacas (Molecular Devices).

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2.7. Tecidos da pele humana

Equivalentes epidérmicos contendo melanócitos (MelanoDerm, MEL-300B) foram obtidos da MatTek (Ashland, MA, EUA) e foram mantidos em meio EPI-100-NMM-113-.Exossomos de leiteforam aplicados aos tecidos MelanoDerm nos dias 1, 3, 7, 9 e 12. PBS foi usado como controle negativo. Os tecidos foram fotografados nos dias 3, 7, 9, 12 e 14. A pigmentação foi medida comparando as mudanças no valor L (Adobe PhotoshopCC 2015). Os teores de melanina no tecido da pele humana foram medidos no Dia 14 por um ensaio Solvablemelanin. Resumidamente, os tecidos MelanoDerm foram solubilizados usando Solvable (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) e incubados durante a noite a 60 ◦C. As amostras foram agitadas em vórtex e depois centrifugadas a 16.500 × g por 5 min. O sobrenadante foi transferido para os poços de uma placa 96-poço e lido a 490 nm por um espectrofotômetro.

3. Resultados

3.1. Caracterização dos Exossomos Isolados do Leite

Para investigar as características dos exossomos extraídos do leite de vaca, primeiro medimos o tamanho dos exossomos por espalhamento dinâmico de luz. Como resultado, os exossomos extraídos do leite apresentaram diâmetro de 80 a 190 nm (Figura 1A). Porleiteexossomapurificação, a mistura de sobrenadante Exoquick-leite foi centrifugada para obter um pellet de exossoma de leite. A expressão de CD9, TSG101 e HSP70 como marcadores exossomais foi detectada em pellets, mas essas proteínas não estavam presentes no sobrenadante (Figura 1A). Além disso, a morfologia esférica e o tamanho dos exossomos foram confirmados por microscopia crioeletrônica (Figura 1A). 1B). Exossomos foram encontrados para ter uma forma redonda de até 200 nm de diâmetro. Em seguida, investigamos se os exossomos extraídos do leite eram absorvidos pelas células. Células B16F10 de camundongo foram incubadas comexossomos de leitemarcado com corante fluorescente lipofílico PKH26. Como resultado, observamos que os exossomos marcados estavam presentes no interior das células (Figura S1).

3.2. Atividade de tirosinase e produção de melanina suprimidas por exossomos de leite em células B16F10

Em seguida, examinamos o efeito dos exossomos extraídos na viabilidade celular. Conforme ilustrado na Figura 2A, revelamos que não houve diferença significativa na viabilidade celular, independentemente da concentração do exossomo.

Para investigar as possíveis células da pelebranqueamentoefeito deexossomos de leite, as células foram tratadas com exossomos de leite. Descobrimos que a atividade da tirosinase em células expostas a exossomos do leite em concentrações de 20 ou 50 µg/mL diminuiu 43 por cento e 59 por cento, respectivamente (Figura 2B). Como a redução da atividade da enzima tirosinase pode inibir a biossíntese de melanina, os teores de melanina foram medidos após o tratamento com exossomos de leite. Notamos a inibição da síntese de melanina em células expostas aexossomos de leite(20 ou 50 µg/mL) em 45 por cento e 55 por cento, respectivamente (Figura 2C). Além disso, a expressão do mRNA do MITF diminuiu à medida que a concentração de exossomos do leite aumentou. O nível de mRNA de MITF diminuiu 59 por cento nas células tratadas com 20 µg/mL de exossomos e 84 por cento nas células tratadas com 50 µg/mL de exossomos, respectivamente (Figura 2D). A expressão do mRNA da tirosinase (TYR) também diminuiu em 49% e 76% nas células expostas a essas concentrações de exossomos (Figura 2D). Os níveis de proteína MITF e tirosinase também diminuíram à medida que a concentração de leiteexossomosaumentado (Figura 2E). Esses resultados sugerem que os exossomos do leite inibem a melanogênese em células B16F10 de camundongo.

3.3. O miR específico de bovinos-2478 de exossomos do leite suprime a melanogênese

Para determinar se miR-2478 derivado deexossomos de leiteafetar diretamente a melanogênese, o inibidor de miR-2478 foi transfectado nas células expostas aos exossomos do leite (50 µg/mL). Na presença de exossomos do leite, as células B16F10 transfectadas com o inibidor de miR-2478 mostraram atividade de tirosinase significativamente maior em comparação com o controle (Figura 4A). Os teores de melanina também foram maiores em células tratadas com inibidor de miR-2478 do que em células de controle (Figura 4B). A expressão de mRNA de MITF foi –2.5-vezes maior em células tratadas com inibidor de miR 2478 do que em células de controle, e a expressão de mRNA de TYR foi –2-vezes maior quando miR-2478 foi inibido (Figura 4C ). Os níveis de proteínas MITF e TYR também recuperados nas células expostas aexossomos de leitedepois que essas células foram transfectadas com o inibidor de miR-2478 (Figura 4D). Esses resultados sugeriram que miR-2478 derivado de exossomos do leite suprimiu diretamente a melanogênese em células de melanoma de camundongo.

3.4. Exossomos do leite suprimem a melanogênese através da via Akt-GSK3

A seguir, examinamos comoexossomos de leiteregularmelanogêneseidentificar a via afetada relevante em células de melanoma. Embora não se saiba se Rap1a controla diretamente a melanogênese, foi relatado que Rap1a inibe a fosforilação de células cancerígenas de Akt [20]. Com base nessas informações, investigamos se Rap1a modula a via Akt para promover.

Em relação ao AktmelanogêneseA Akt ativada pela via induz a fosforilação de Gsk3 em Ser9 e assim a inativa; essa alteração inibe a atividade transcricional do MITF e diminui a tirosinase [21,22]. No presente estudo, avaliamos a expressão de Akt e GSK3 em células tratadas com siRNA Rap1a. Nessas células, a ativação da fosforilação de Akt aumentou e a quantidade de pGSK3 também aumentou (Figura 7A). A GSK3 foi inativada pela ativação de Akt de maneira dependente da concentração nas células tratadas com 20 ou 50 µg/mL deexossomos de leite(Figura 7B). Os níveis das proteínas Akt e GSK3 nas células tratadas com o mimetizador miR-2478 foram consistentes com os resultados acima (Figura 7C). Em seguida, testamos se o miR-2478de exossomos do leite afeta a via Akt-GSK3. Na presença de exossomos do leite, a fosforilação das proteínas Akt e GSK3 foi menor nas células tratadas com o inibidor de miR-2478 (Figura 7D). Além disso, o tratamento com o inibidor de AKT GSK690693 aumentou a expressão de genes associados amelanogêneseem células tratadas com exossomos do leite. (Figura 7E). Essas descobertas significaram que miR-2478 emexossomos de leitedownregulateRap1a e suprime a melanogênese através da via Akt-GSK3.

cistanche herbaefeito clareador na pele para anti-oxidação

3.8. Exossomos do leite inibiram a melanogênese em células de melanoma humano, melanócitos e tecidos melanodermais

Dado queexossomos de leiteinibidomelanogêneseem células de camundongos, em seguida determinamos se os exossomos do leite eram igualmente eficazes em células humanas. Primeiro, a viabilidade de células de melanoma humano MNT-1 e melanócitos humanos NHEM foram examinados após incubação com 20 ou 50 ug/mL de exossomos de leite. Conforme apresentado na Figura 8A, não houve diferença na viabilidade. A atividade da tirosinase foi inibida em 43 por cento e 85 por cento, respectivamente, em células MNT-1 expostas a 20 ug/mL ou 50 ug/mL de exossomos de leite (Figura 8B). NHEM também foi reduzido em 34 por cento e 66 por cento, respectivamente, através do tratamento com 20 ug/mL ou 50 ug/mL de exossomos de leite (Figura 8B). Além disso, os teores de melanina foram medidos em células MNT{15}} e NHEM expostas a exossomos do leite. Como resultado, a síntese de melanina em células MNT{16}} expostas a 20 ug/mL ou 50 ug/mL deexossomos de leitefoi inibido em 37 por cento e 58 por cento, respectivamente, e nas células NHEM, o tratamento com exossoma do leite impediu a síntese de melanina em 36 por cento e 62 por cento, respectivamente (Figura 8C). Além disso, o efeito clareador da peleexossomos de leitefoi ainda confirmado usando tecidos de pele humana. Após tratamento com exossomos do leite em tecidos humanos,branqueamento os efeitos foram observados nos dias 3, 9, 12 e 14. Como resultado, descobrimos que a cor da pele nos tecidos expostos ao exossomo do leite parecia ser mais brilhante do que nos tecidos de controle (Figura 8D). O grau de pigmentação foi calculado como o valor L, que é um valor que representa o brilho. A pigmentação progrediu mais lentamente em tecidos de pele tratados com exossoma de leite do que em tecidos de pele de controle (Figura 8D). O grupo experimental tratado comexossomos de leitemostraram um tamanho de partícula de melanina menor e uma baixa quantidade de pigmento de melanina em comparação com o grupo controle (Figura 8E). Como resultado da medição do conteúdo de melanina após 14 dias de leite, os exossomos inibiram a síntese de melanina nos tecidos humanos (Figura 8F). Portanto, concluímos que os exossomos do leite inibemmelanogêneseem células e tecidos humanos.

4. Discussão

Estudos sobre exossomos regulandomelanogêneserelataram que exossomos derivados de queratinócitos têm efeito clareador. Os melanócitos e os queratinócitos circundantes estão funcionalmente ligados para formar unidades de melanina na epiderme da pele [23,24]. Fatores solúveis derivados de queratinócitos regulam a melanogênese dos melanócitos vizinhos. Os exossomos secretados pelos queratinócitos normais promovem a melanogênese pela regulação positiva da expressão demelanogêneseproteínas relacionadas [23-25]. Além disso, em umbranqueamentoestudo usando exossomos extraídos de células, foi relatado recentemente que exossomos extraídos de células-tronco/estromais derivadas de tecido adiposo humano mostraram eficácia de clareamento da pele em células de melanoma de camundongo [26]. Também houve relato de que exossomos extraídos de plantas têm efeito clareador. As vesículas extracelulares extraídas de folhas e caules de plantas de D. morbifera exibiram efeitos anti-melanogênicos em células de melanoma de camundongo e pele humana saudável [27]. Em nosso estudo, o efeito clareador dos exossomos derivados do leite foi investigado.

Comparados aos exossomos extraídos do plasma sanguíneo ou do fluido de cultura, os exossomos derivados do leite têm as vantagens de não apenas possuir grandes quantidades de exossomos que podem ser extraídos por unidade de volume, mas também um preço baixo [26,27]. Porqueexossomos de leitepossuem composição química semelhante à das membranas celulares, apresentam menor imunogenicidade e citotoxicidade e alta biocompatibilidade [28,29]. Recentemente, quando exossomos de leite foram alimentados a camundongos modelo de colite induzida por DSS (dextrano sulfato de sódio), a expressão das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF diminuiu em comparação com o grupo controle, reduzindo assim a inflamação e melhorando a enterite necrosante [30, 31]. Além disso, a ingestão de exossomos de leite em um modelo de doença de osteoporose em camundongos melhorou a artrite, aumentando a densidade óssea e reduzindo as citocinas pró-inflamatórias [32,33]. Até agora, os efeitos dos exossomos do leite têm sido focados em fenômenos imunológicos que reduzem citocinas pró-inflamatórias e no desenvolvimento ósseo, como o alívio de enterites e melhora da osteoporose. Neste estudo, além do método deexossomos de leite, confirmou-se que, quando aplicado na pele, foi eficaz nabranqueamento. Isso indica que pode ser aplicado para o tratamento de várias doenças, aumentando a atividade fisiológica usando exossomos do leite no futuro.

Embora este estudo tenha sugerido queexossomos de leiteinibirmelanogênese, já se sabe que proteínas do soro de leite como caseína, -lactoglobulina e -lactalbumina têm efeito clareador. -lactoglobulina diminui a atividade da tirosinase em melanócitos humanos [18], e k-caseína inibe a melanogênese em células de melanoma B16 de camundongo [17]. Curiosamente, muitos desses componentes também estão presentes nos exossomos do leite. De acordo com os resultados dos proteômeros dos exossomos do leite, caseína, -lactoglobulina e -lactalbumina são distribuídas nos exossomos [15,34,35]. Os exossomos do leite contêm microRNAs, bem como proteínas. Como resultado de um microarray de miRNA usando exossomos de leite por Izumi e colegas, miR-2478, miR-1777b,miR-1777a, let-7b, e miR{{16) }} foram altamente distribuídos nos exossomos do leite [13]. Neste estudo, com exceção de miR-2478, dentre esses microRNAs, miR-1777b, miR-1777a,let-7b, e miR-1224 mostraram nenhuma diferença na atividade da tirosinase do grupo controle (Figura S2). miR-2478 foi mais abundante emexossomos de leitee diminuição da atividade da tirosinase. No entanto, a expressão dos genes MITF e TYR relacionados ao clareamento diminuiu mais nas células tratadas comexossomos de leitedo que nas células tratadas apenas com a imitação miR-2478. Esses resultados indicam que vários componentes, incluindo microRNAs em milkexossomos, estão envolvidos nabranqueamentoação.

A maioria dos microRNAs nos exossomos do leite exerce funções biológicas inibindo a expressão de genes-alvo nas células receptoras. Neste estudo, miR-2478 também inibiu a síntese de melanina ao direcionar Rap1a como um gene alvo. Apesar de não serem microRNAs derivados do leite, já foram relatados microRNAs que controlam a expressão de genes relacionados ao clareamento. Quando o mimetizador de miR-27a-3p humano foi aplicado a melanócitos de camundongo, ele inibiu a expressão de Wnt3a e, assim, inibiu a síntese de melanina [36], e miR ectópico-218 inibiu a atividade de TYR, reduzindo a expressão de MITF em melanócitos de melanoma murino [37]. miR{10}} promovemelanogêneseatravés da via CREB1/MITF/Rab27a visando Kif5b no melanoma [38]. Existem 79 microRNAs nos exossomos do leite

microRNAs emexossomos de leitederivados de vacas [13]. Portanto, mais pesquisas sobre a atividade fisiológica dos exossomos do leite são necessárias.

5. Conclusões

Nossos achados sugerem queexossomos de leitesão candidatos a agentes anti-melanógenos que diminuem a pigmentação inibindo a expressão de genes relacionados à melanina (Figura 10). Em células de melanoma e melanócitos, os exossomos do leite apresentaram inibição de TYR e redução do teor de melanina em comparação com o controle negativo. Além disso, esses efeitos foram mediados por miR-2478 deexossomos de leite. Portanto, os exossomos do leite podem ser úteis para o desenvolvimento de funçõesbranqueamentocosméticos com baixa citotoxicidade.

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