MicroRNAs moldam a imunidade social: um alvo potencial para o controle biológico do cupim Reticulitermes chinensis

Abstrato

Os insetos eussociais podem empregar várias defesas comportamentais e fisiológicas contra doenças para evitar, resistir e tolerar infecções por patógenos em suas colônias estreitamente relacionadas e compactadas, denominadas imunidade social. Estudos recentes mostraram que várias moléculas servem à imunidade social dos insetos, incluindo odores químicos, venenos de insetos, proteínas relacionadas ao sistema imunológico, etc. No entanto, se e como os microRNAs (miRNAs), cujos precursores são processados ​​pelo Dicer-1, impulsionam a imunidade social a imunidade em colônias de insetos ainda é desconhecida. Aqui, usamos um sistema 'hospedeiro-patógeno' (hospedeiro: Reticulitermes chinensis; patógeno: Metarhizium anisopliae) para explorar o impacto dos miRNAs na imunidade social em colônias de cupins. Descobrimos que o silenciamento de Dicer mediado por RNAi levou à diminuição da concentração de miRNA, inibiu significativamente o metabolismo de carboidratos e energia e afetou outros processos vitais, como a resposta imune e as reações de oxidação-redução, em todo o corpo do cupim . Na defesa comportamental, silenciar Dicer-1 diminuiu significativamente os comportamentos sociais defensivos, como locomoção, preparação, canibalismo e sepultamento em grupos de cupins ao encontrar contaminação por fungos. Na defesa fisiológica, o silenciamento Dicer-1 e a estimulação miR- 71-5 resultaram em diminuição significativa das atividades antifúngicas dos cupins. Além disso, tanto os grupos de cupins Dicer-1-silenciados quanto os tratados com estimulantes miR-71-5 exibiram um alto nível de mortalidade durante a contaminação fúngica. Nossas descobertas demonstraram o importante papel dos miRNAs na formação da imunidade social em colônias de cupins, fornecendo insights necessários para compreender os mecanismos potenciais subjacentes às defesas comportamentais e fisiológicas contra doenças em insetos e, portanto, estabelecendo as bases para o controle de pragas baseado em miRNA.

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Palavras-chave Inseto eusocial · Fungos entomopatogênicos · Defesas contra doenças · Dicer-1 · miR-71-5

Mensagem chave

• Expressões genéticas mediadas por miRNAs relacionadas ao sistema imunológico social.

• Os miRNAs afetaram as defesas comportamentais contra doenças em grupos de cupins.

• Os miRNAs influenciaram a defesa fisiológica contra doenças em cupins.

• Os cupins baseados em miRNA podem ser considerados novos acessos ao controle biológico de pragas.

Introdução

As térmitas são pragas economicamente importantes, custando 30 mil milhões de dólares em todo o mundo e impondo danos globais às culturas, árvores, estruturas de madeira e materiais de celulose. Os pesticidas químicos constituem uma via de controlo eficaz para as pragas de térmitas, mas também criam problemas graves, ameaçando a saúde humana e o ambiente. O controle biológico é uma alternativa valiosa que pode resolver esses problemas. Vários entomopatógenos, como Metarhizium e Beauveria, foram aplicados com sucesso no controle biológico de pragas, o que é razoável e eficaz (Verma et al. 2009; Kumar e Upadhyay 2021). No entanto, o controle biológico de cupins é insatisfatório, principalmente devido às defesas únicas contra doenças nas colônias de cupins. Os cupins, sendo insetos eussociais, desenvolveram defesas comportamentais coletivas e fisiológicas individuais para neutralizar o alto risco de propagação de patógenos infecciosos entre companheiros de ninho próximos e intimamente relacionados (denominado 'imunidade social') (Van Meyel et al. 2018; Liu et al. . 2019a). Está bem documentado que as térmitas utilizam um vasto repertório de defesas comportamentais: a evitação é a primeira linha de defesa e ajuda a evitar que as térmitas entrem em áreas poluídas (Yanagawa et al. 2015); o comportamento de alarme é exibido com rápido movimento oscilatório longitudinal para alertar os companheiros de ninho sobre a presença de patógenos (Rosengaus et al. 1999); a preparação para companheiros de ninho contaminados com patógenos pode remover eficientemente os patógenos das cutículas dos companheiros de ninho (Liu et al. 2019b); comportamentos funerários e canibais limitam a transmissão de patógenos de cadáveres para companheiros de ninho suscetíveis (Sun et al. 2016). Respostas fisiológicas, como respostas imunológicas e reações de oxidação-redução, também servem na defesa contra doenças causadas por cupins. As respostas imunes incluem peptídeos antimicrobianos (AMPs) mediados pela imunidade humoral e fagocitose e encapsulamento mediados pela imunidade celular, que são capazes de inibir a replicação e disseminação de patógenos na cavidade corporal do inseto (Hussain et al. 2013; Liu et al. 2015; López-Uribe e outros 2016; Hong e outros 2018). As reações de oxidação-redução atenuam os danos causados ​​por toxinas e espécies reativas de oxigênio (ROS) durante infecções por patógenos, contribuindo para a tolerância aos insetos (Liu et al. 2015; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). Além disso, estudos anteriores sobre defesas contra doenças causadas por cupins mostraram que alguns simbiontes intestinais eram um componente importante da defesa fisiológica do hospedeiro (Rosengaus et al. 2014). Alguns AMPs poderiam ser empregados como desinfetantes externos na superfície da cutícula e em materiais de ninho quando em conjunto com comportamentos como limpeza e nidificação (Bulmer et al. 2009; Hamilton e Bulmer 2012). Portanto, o enfraquecimento das defesas comportamentais e fisiológicas dos cupins pode ser o passo chave para aumentar o efeito de biocontrole dos cupins.

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A base molecular da imunidade social tem sido relatada em um número crescente de estudos. Várias moléculas, incluindo odores químicos, secreções externas, antibióticos, proteínas imunológicas e quimiorreceptores que servem às defesas comportamentais e fisiológicas dos insetos, foram identificadas por múltiplas técnicas ômicas e cromatografia gasosa/líquida-espectrometria de massa (Seipke et al. 2011; Hussain et al. 2013; Terrapon e outros 2014; Liu e outros 2015; Sun e outros 2016; He e outros 2018). Em grupos de cupins, o odor de mofo proveniente de patógenos induz um melhor comportamento de higiene (Yanagawa et al. 2011). Sinais de morte em cadáveres de cupins induzem canibalismo ou comportamentos funerários (Sun et al. 2016). As secreções externas das glândulas frontais e salivares e a atividade antimicrobiana mediada por microrganismos benéficos ajudam os cupins a se protegerem, aos companheiros de ninho e até mesmo às colônias (Bulmer et al. 2009; Rosengaus et al. 2000, 2014; Chouvenc et al. 2013). Para os mecanismos genéticos e bioquímicos que impulsionam a imunidade social dos insectos, poderiam ser utilizadas tecnologias de RNAi e de edição genética. Em cupins, demonstrou-se que o silenciamento mediado por RNAi dos genes da termicina, da proteína de ligação gram-negativa 2 (GNBP2), da proteína de ligação ao selênio e da transglutaminase (TG) diminui significativamente a atividade antifúngica dos cupins e, portanto, aumenta a mortalidade por infecção (Hamilton e Bulmer 2012; Zhao e outros 2020; Zhou e outros 2021). A isocitrato desidrogenase (IDH) pode influenciar o metabolismo dos cupins, e sua desregulação induz aumento de lesões apoptóticas, levando a altos níveis de infecções e mortalidade (Liu et al. 2020). Além disso, GNBP2 e TG também servem na defesa comportamental de cupins, influenciando comportamentos canibais e de limpeza, respectivamente (Zhao et al. 2020; Esparza-Mora et al. 2020). No entanto, a base molecular da imunidade social ainda não foi claramente compreendida, especialmente o mecanismo molecular que impulsiona os complicados comportamentos sociais em resposta a agentes patogénicos infecciosos. Além disso, o mecanismo genético e bioquímico da imunidade social concentra-se no RNA codificador que conduz a imunidade social dos insetos, mas ainda não está claro se os RNAs não-codificantes, como os miRNAs, participam na regulação da imunidade social dos insetos.

Dicer-1, uma endonuclease RNase III, é essencial para a etapa final da biossíntese de miRNA. Os miRNAs são RNAs não codificantes endógenos, de 18 a 25 nt, que regulam negativamente a expressão gênica no nível pós-transcricional por pareamento de bases entre a região semente nos miRNAs e a região correspondente nos mRNAs alvo (Gomez-Orte e Belles 2009; Wang et al. 2013; Yang e outros 2014; Lucas e outros 2015). Como a produção de miRNA depende do Dicer-1, as funções dos miRNAs na modulação dos processos biológicos dos insetos podem ser estudadas pelas perdas funcionais do Dicer-1. Ao usar mutantes Dicer-1 de moscas-das-frutas, comprovou-se que os miRNAs funcionam na embriogênese e na morfogênese dos neurônios olfativos (Lee et al. 2004; Berdnik et al. 2008). Pelo silenciamento de Dicer mediado por RNAi-1, os pesquisadores verificaram que os miRNAs desempenham um papel fundamental na regulação dos processos de desenvolvimento na metamorfose de insetos, como aqueles em baratas e gafanhotos (Gomez-Orte et al. 2009; Wang et al. 2013). Além disso, os miRNAs também estão envolvidos na modulação do comportamento dos insetos. miR-8 e miR-429 regulam o comportamento de escalada induzido por vírus em lagartas do algodão, controlando diretamente a expressão de BrZ2 (Zhang et al. 2018). miR-133 regula a síntese de dopamina e, portanto, inibe a agregação comportamental nos gafanhotos (Yang et al. 2014). Com base nessas evidências da função dos miRNAs na fisiologia e comportamento dos insetos, nosso objetivo foi determinar o efeito dos miRNAs na fisiologia e no comportamento dos cupins envolvidos na imunidade social usando um sistema 'hospedeiro-patógeno' (hospedeiro: Reticulitermes chinensis; patógeno: Metarhizium anisopliae). Nosso estudo incluiu principalmente três aspectos da pesquisa sobre imunidade social: o efeito dos miRNAs nas (1) moléculas in vivo que impulsionam a imunidade social; (2) a resposta defensiva comportamental, como locomoção em áreas contaminadas por fungos, preparação para companheiros de ninho contaminados por fungos e canibalismo/enterro em cadáveres contaminados por fungos; e (3) a resposta de defesa fisiológica, tal como a atividade antifúngica. Além disso, testamos o efeito da desregulação do miRNA na mortalidade de cupins contaminados por fungos para avaliar o efeito dos miRNAs no controle biológico dos cupins. Nosso estudo revelou o mecanismo potencial subjacente às defesas comportamentais e fisiológicas contra doenças e novos alvos para o controle de pragas.

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material e métodos

Cupins

Todos os cupins experimentais em nosso estudo eram operários do cupim R. chinensis. Eles foram coletados na colina Shizi, na cidade de Wuhan, província de Hubei, China. Os cupins foram criados em recipientes plásticos (40×20×20 cm) contendo pequenos blocos de pinus em laboratório com temperatura de 25±1 grau, 80% de umidade relativa e 24 horas de escuridão.

Entomopatógenos, cupins contaminados e cadáveres

O fungo entomopatogênico M. anisopliae (cepa IBCCM321.93) foi cultivado em ágar batata dextrose (BDA) por 2 semanas a 25±1 grau, 80% de umidade relativa e 24 horas de escuridão. Os conídios fúngicos foram suspensos usando Tween 8 a 1%0 e armazenados a uma temperatura de 4 graus por no máximo 3–4 semanas. Antes de cada experimento, a suspensão de conídios foi testada quanto à germinação. Descobrimos que a suspensão de conídios usada para contaminar cupins tinha uma taxa de germinação superior a 90%. Para preparar cupins contaminados por fungos, os abdômens dos cupins foram contaminados por uma gota de 0,3 μL de suspensão de conídios (108 conídios/mL) usando uma pipeta (0,1–2,5 μL, Transferpette). Em seguida, os cupins contaminados com o fungo foram imediatamente refrigerados a 4 graus por uma hora para inibir seu movimento e precipitar conídios fúngicos em suas cutículas (Liu et al. 2015). Para preparar cadáveres contaminados por fungos, os cupins foram coletados em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e depois congelados em nitrogênio líquido por 20 segundos para matar os cupins. Os cadáveres foram imersos na suspensão de conídios (108 conídios/mL) e depois colocados em placa de Petri estéril com papel filtro úmido por 0 e 2 dias de cultivo (Sun et al. 2016).

Síntese de dsRNA e simulador de miRNA

O fragmento Dicer-1 (1697 pb; Material suplementar 1-Texto S1) foi amplificado por primers específicos (forward: 5′-CTG CGA CAG ATC ATT GCA CG-3′; reverso: 5′ -CAC TGG CTG TTT TGG CAC TC-3′), e seus produtos de PCR foram purificados usando o AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit (Axygen Scientific, EUA), clonado no vetor pMD 18-T (TaKaRa, Japão) e depois transformada utilizando uma célula quimicamente competente DH5 (Tsingke Biotechnology, China). Uma única colónia de meio de caldo de lisogenia (LB) com ampicilina foi enviada para Tsingke Biotechnology Co. O alinhamento da sequência mostrou que nosso fragmento era Dicer-1. A sequência do promotor T7 (5′-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3′) foi adicionada à extremidade 5′ dos primers de amplificação de Dicer-1 (519 pb; Forward: 5′ -GTG ATG CTG GAG TTG GGT TT-3′; Reverso: 5′-AGA ATG AGT CGC CCA ATG TC-3′) e GFP (467 pb; Avanço: 5′-CTT GAA GTT GAC CTT GAT GCC-3′; Reverso: 5′-TGG TCC CAA TTC TCG TGG AAC- 3′) modelos de dsRNA (Material suplementar 1-Texto S1). Os produtos de PCR dos modelos de dsRNA foram extraídos com hidroxibenzeno/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) (Solarbio, China). O dsRNA foi gerado usando um kit de transcrição T7 RNAi (Vazyme Biotech, China) e depois purificado por hidroxibenzeno / clorofórmio / álcool isoamílico (50:49:1) (Solarbio). Finalmente, o dsRNA foi avaliado por eletroforese em gel de agarose e NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, EUA) e armazenado a 80 graus.

O simulador miR-71-5 era um pequeno RNA de fita dupla projetado de acordo com a sequência miR-71-5 (21 nt, Material suplementar 1-Texto S1). O modelo do simulador miR-71-5 consistia em dois DNAs de fita dupla contendo o promotor T7: um foi gerado pelo oligonucleotídeo A1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAA A -3′) e oligonucleotídeo A2 (5′-TTT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′) usando PCR de touchdown; o outro foi gerado pelo oligonucleotídeo B1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAA A-3′) e oligonucleotídeo B2 (5′-TTT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′) usando PCR de touchdown. Um simulador de controle foi projetado de acordo com a sequência GFP (19 nt, Material suplementar 1-Texto S1). O modelo do simulador de controle também foi adquirido por dois DNAs de fita dupla contendo o promotor T7: um foi gerado pelo oligonucleotídeo C1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG CAA GCT GAC CCT GAA GTT AA{{33} }′) e oligonucleotídeo C2 (5′-TTA ACT TCA GGG TCA GCT TGC CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3′) usando PCR de touchdown; o outro foi gerado pelo oligonucleotídeo D1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACT TCA GGG TCA GCT TGC AA-3′) e oligonucleotídeo D2 (5′-TTG CAA GCT GAC CCT GAA GTT CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3′) usando PCR de touchdown. Os simuladores miR-71-5 e controle foram gerados usando um kit de transcrição T7 RNAi e depois extraídos por hidroxibenzeno/clorofórmio/álcool isoamílico (50:49:1). O extrato foi avaliado por eletroforese em gel de agarose e NanoDrop 2000 e armazenado a -80 graus.

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alimentação de dsRNA

Os cupins passaram fome por 12 horas antes de serem alimentados (Zhou et al. 2008; Hamilton e Bulmer 2012). Um total de 18 cupins foram colocados em uma placa de Petri celular (D =35 mm) com um pedaço de papel filtro (D =18 mm) que foi umedecido com 60 μL de água livre de RNase contendo 80 ug dsDicer-1, 80 ug dsGFP, 60 ug simulador de miRNA ou 60 ug simulador de controle. Para os bioensaios de alimentação de dsRNA Dicer-1, os cupins foram autorizados a ingerir o papel umedecido por 24 horas antes dos experimentos. Os cupins tratados com GFP foram considerados controles. Para bioensaios de alimentação de simuladores de miRNA, os cupins foram autorizados a ingerir o papel umedecido por 48 horas antes dos experimentos. As térmitas tratadas com simulador de controlo foram consideradas como controlos.

RT-qPCR

Cinco ou seis réplicas de três colônias foram utilizadas para expressão gênica usando RT-qPCR. Três cupins por réplica por tratamento foram reunidos para extração de RNA total usando o kit Direct-zol™ RNA Miniprep (Zymo Research, EUA). A pureza e concentração do RNA extraído foram determinadas usando um NanoDrop 2000. O RNA foi convertido em cDNA usando o kit de reagentes PrimeScript™ RT com gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Takara, Japão). O RT-qPCR foi realizado com um sistema de PCR em tempo real QuantStudio™ 3 (Thermo Scientific) usando ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme Biotech). Os primers específicos estão listados no Material Suplementar 2-Tabela S1.

concentração de miRNA

Seis réplicas de três colônias foram usadas para determinar a concentração de miRNAs usando um kit MiPure Cell/Tissue miRNA (Vazyme Biotech, China). Três cupins por réplica por tratamento foram reunidos para miRNAs. A pureza e concentração dos miRNAs extraídos foram determinadas utilizando um NanoDrop 2000.

Sequenciamento de novo e análise de transcriptoma para

Fifteen termites from three colonies per treatment were pooled for total RNA extraction using TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies, USA). The concentration, quality, and integrity of the total RNA were determined using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific). Sequencing libraries were generated using the TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit (Illumina, USA) and sequenced on a HiSeq platform (Illumina) by Shanghai Personal Biotechnology Cp. Ltd. (China). Sequencing data were filtered by Cutadapt (v1.15) software. For the transcriptome sequencing project without a reference genome, Trinity (v2.5.1) software was used to montage clean reads for the transcripts for later analysis. NR (NCBI non-redundant protein sequences), GO (Gene Ontology), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome), Egg NOG (Evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups), and Swiss-Prot databases were used for gene functional annotation. Furthermore, DESeq (1.30.0) was used to analyze the differentially expressed genes under the condition of |log2FoldChange(FC)|>1 e p<0.05. The genes were then mapped to GO terms, and the terms with significant enrichment were calculated by hypergeometric distribution under the condition of p<0.05 to reveal the possible functions of the candidate genes. Additionally, the genes were mapped to KEGG pathways to determine their possible functions. 

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Locomoção

Nove réplicas de três colônias foram analisadas para comparar a distância de movimento de cupins Dicer-1-silenciados versus tratados com GFP. Após um dia de alimentação oral de dsDicer-1 ou dsGFP, um cupim por repetição por tratamento foi colocado em uma nova placa de Petri de células (D =90 mm) com um pedaço de papel de filtro umedecido pela suspensão de conídios (108 conídios/mL). Em seguida, utilizamos um marcador preto para traçar o movimento do cupim em uma tampa transparente por 10 segundos. A distância do movimento foi medida em papel quadriculado (1×1 mm).

Asseio

Nove réplicas de três colônias foram analisadas para comparar o número de comportamentos de limpeza entre cupins silenciados por Dicer e cupins tratados com GFP. Após um dia de alimentação oral de dsDicer-1 ou dsGFP, três cupins por repetição por tratamento foram colocados em uma nova placa de petri de células (D =35 mm) com um pedaço de papel de filtro umedecido (D{{ 4}} mm) e depois contaminados com conídios fúngicos (108 conídios/mL). Os comportamentos foram gravados em vídeo por 15 minutos usando uma câmera digital HD (SONY, Japão). Os vídeos foram escaneados a cada 10 segundos para observar se comportamentos de limpeza (bocas de cupins em direção aos corpos dos companheiros de ninho) ocorriam entre cupins contaminados por fungos.

Canibalismo

Nove réplicas de três colônias foram analisadas quanto ao efeito de Dicer{{0}} vs. GFP no comportamento canibal em relação a cadáveres contaminados por fungos. Seis cupins por réplica por tratamento foram colocados em uma placa de petri de células (D=35 mm) com um pedaço de papel de filtro úmido (D=18 mm) contendo dsDicer-1 ou dsGFP. Eles tiveram permissão para um dia de alimentação oral com dsRNA e, em seguida, um cadáver contaminado com fungo incubado por 0 d foi colocado na placa de Petri celular onde os seis cupins tratados foram criados. Depois de um dia de criação juntos, o cadáver contaminado pelo fungo foi completamente comido (pontuação alta no teste=2), comido parcialmente (pontuação baixa no teste=1) ou não comido (sem pontuação no teste{{10 }}) (Material suplementar 1-Fig. S1) pelos seis cupins.

Enterro

Nove réplicas de duas colônias foram analisadas quanto ao efeito de Dicer-1 vs. GFP no comportamento de sepultamento de cadáveres contaminados por fungos. Seis cupins por réplica por tratamento foram colocados em uma placa de petri de células (D=35 mm) com um pedaço de papel de filtro úmido (D=18 mm) contendo dsDicer-1 ou dsGFP. Eles tiveram permissão para um dia de alimentação oral com dsRNA. Em seguida, um cadáver contaminado com fungo foi incubado por 2 dias e solo foi adicionado à placa de Petri na qual os seis cupins tratados foram criados. Após um dia de criação juntos, o cadáver contaminado pelo fungo foi completamente enterrado (pontuação alta no teste=2), parcialmente enterrado (pontuação baixa no teste=1) ou não enterrado (sem pontuação no teste{{10 }}) (Material suplementar 1-Fig. S2) pelos seis cupins.

Atividade antifúngica

Seis réplicas de três colônias foram analisadas quanto ao impacto de Dicer{{0}} e miR-71-5 na capacidade dos cupins de inibir o crescimento de fungos. Cinco cupins por réplica por tratamento foram reunidos e esmagados usando nitrogênio líquido e depois dissolvidos em 100 μL de solução salina a 0,9%. O homogeneizado foi centrifugado a 6000xg por cinco minutos a 4 graus para produzir 80 μL de sobrenadante. Em seguida, o sobrenadante foi centrifugado novamente para produzir 50 μL de sobrenadante. Para atividade antifúngica, uma microplaca de 96-poços foi usada para medir a absorvância de amostras, controles de crescimento e brancos padrão para calcular a redução do crescimento fúngico: (1) 50 μL de dextrose de batata (PD), 2 μL dos conídios fúngicos (108 conídios/mL) e 5 μL do sobrenadante por poço foram misturados para a amostra; (2) 50 μL de dextrose de batata (PD), 2 μL de conídios fúngicos (108conídios/mL) e 5 μL de solução salina a 0,9% por poço foram misturados para o controle do crescimento fúngico; (3) 50 μL de dextrose de batata (PD) e 7 μL de solução salina a 0,9% por poço foram misturados para o branco padrão. Após 24 h de cultivo em agitador de temperatura constante (150 rpm a 25 ± 1 grau), a medição foi realizada em espectrofotômetro de microplacas (600 nm; Thermo Scientific).

Sobrevivência

Para determinar o efeito da alimentação oral de dsDicer-1 na sobrevivência de cupins, cupins de três colônias foram implantados para determinar a sobrevivência de Dicer-1-silenciados (42 cupins no total, 14 cupins por colônia) e GFP- tratados (42 cupins no total, 14 cupins por colônia) cupins durante contaminação fúngica. Para controles, 56 cupins de duas colônias foram implantados para determinar a sobrevivência de cupins Dicer-1-silenciados (28 cupins no total, 14 cupins por colônia) e cupins tratados com GFP (28 cupins no total, 14 cupins por colônia). Ao realizar os experimentos, sete cupins foram criados em uma placa de Petri celular (D =35 mm) com um pedaço de papel filtro (D =18 mm) umedecido com água livre de RNase contendo dsDicer{{17} } ou dsGFP, enquanto os cupins foram contaminados com fungos e depois criados por dez dias para observação diária de sua sobrevivência. Para determinar o efeito da alimentação oral do simulador miR-71-5 na sobrevivência dos cupins, cupins de três colônias foram implantados para determinar a sobrevivência do miR-71-5 (42 cupins no total, 14 cupins por colônia) e controle ( 42 cupins no total, 14 cupins por colônia) cupins tratados com simulador durante contaminação fúngica. Além disso, 56 cupins de duas colônias foram implantados para determinar a sobrevivência de cupins tratados com simulador miR- 71-5 (28 cupins no total, 14 cupins por colônia) e controle (28 cupins no total, 14 cupins por colônia). Ao realizar os experimentos, sete cupins foram criados em uma placa de Petri celular (D=35 mm) com um pedaço de papel filtro (D=18 mm) umedecido com água livre de RNase contendo miR{{35} } simulador ou simulador de controle. Após dois dias de alimentação oral, os cupins foram contaminados com fungos e depois criados por dez dias para observação diária de sua sobrevivência. Os cupins mortos foram removidos a tempo.

Análise estatística

Todas as análises de dados foram realizadas no IBM SPSS, versão 19. O teste Shapiro-Wilk foi utilizado para detectar se os conjuntos de dados eram normalmente distribuídos. Dado que a expressão genética, o canibalismo e os dados de sepultamento estavam distribuídos de forma anormal, foi utilizado o teste de Wilcoxon. Alternativamente, os dados da concentração de miRNA, locomoção, preparação e atividade antifúngica foram distribuídos normalmente, e um teste t pareado foi utilizado. A sobrevivência foi analisada pelo método de Kaplan-Meier para a expectativa de vida nas diferentes condições de tratamento. O nível de significância foi p<0.05 in this study.

Resultados

Perfil de expressão de mRNA de cupins silenciados Dicer-1

Para determinar o efeito do Dicer{{0}} no perfil de expressão gênica dos cupins, foi realizado o sequenciamento de mRNA dos cupins silenciados pelo Dicer-1-. Após 1 dia de alimentação oral de dsDicer-1, expressão de Dicer-1 (Fig. 1A; n=6, p <0,05; teste de Wilcoxon) e, portanto, concentração de miRNA (Fig. 1B; df =5, pág.<0.05; paired t-test) were significantly decreased in termites. A total of 1262 mRNAs were significantly altered in the whole bodies of Dicer-1-silenced termites (upregulated: 562 mRNAs; downregulated: 700 mRNAs; Fig. 1C and Supplementary material 2-Table S2). The differentially expressed genes (DEGs) were mapped to the salivary secretion, glycolysis, citrate cycle, and 29 other KEGG pathways (Fig. 1D–F and Supplementary material 2-Table S3). In addition, the DEGs were clustered into the ATP generation from ADP, structural constituent of the cuticle, defense response, glutathione transferase activity, oxidation–reduction process, and 171 other GO terms (Fig. 2 and Supplementary material 2-Table S4).

Fig. 1 Perfil de expressão gênica em corpos inteiros de cupins licenciados pela Dicer-1-. Uma expressão Dicer-1. Os dados são mostrados como média±SEM. *p<0.05. B The concentration of miRNAs. The data are shown as the mean±SEM. *p<0.05. C The number of diferentially expressed genes (DEGs). D The DEGs mapped to salivary secretion. ATP1B, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta; ATP2B, Plasma membrane calcium-transporting ATPase 1; PKC, Protein kinase C alpha type; CALM, Calmodulin-like protein; LYZ, Lysozyme C. E The DEGs mapped to glycolysis. GPI, Glucose-6-phosphate isomerase; PFKC, ATP-dependent 6-phosphor fructokinase; TIM, Triosephosphate isomerase; GAPDH, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; PGK, Phosphoglycerate kinase; MINPP1, Multiple inositol polyphosphate phosphatase 1; GPMA, 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase; ENO, Enolase. F DEGs mapped to citrate cycle. PCK, phosphoenolpyru vate carboxykinase [GTP]; PYC, pyruvate carboxylase; MDH1, malate dehydrogenase; SUCD, succinate–CoA ligase [ADP-forming]. Red letters indicate upregulation; blue letters indicate downregulation

Figura 2 Mapas de calor de DEGs agrupados em termos GO relacionados à defesa. Uma geração de ATP a partir de ADP. B Constituinte estrutural da cutícula. Resposta de defesa C. Atividade de D glutationa transferase. E Processo de redução de oxidação

Verificação RT-qPCR de DEGs de mRNA-seq

A glicólise, o ciclo do citrato e a geração de ATP a partir do ADP foram relacionados ao metabolismo de carboidratos e energético, no qual oito DEGs (gliceraldeído{{0}}fosfato desidrogenase, 2,3-fosfoglicerato mutase dependente de bifosfoglicerato, enolase, triosefosfato isomerase, 6-fosfofrutoquinase dependente de ATP, fosfoenolpiru vate carboxiquinase [GTP], succinato-CoA ligase [formando ADP] subunidade alfa-2 e malato desidrogenase) foram verificados como significativamente regulados negativamente após Dicer -1 silenciamento (Fig. 3A-H; n=6, p <0,05; teste de Wilcoxon), sugerindo distúrbios da glicólise, do ciclo do citrato, da geração de ATP e, portanto, do metabolismo de carboidratos e energia em todo o corpo de cupins silenciados Dicer-1-. DEGs (defensina e terminicina) nos AMPs codificados pela resposta de defesa. A expressão desses genes foi significativamente aumentada em cupins silenciados Dicer-1-em comparação com cupins tratados com GFP (Fig. 3I, J; n=5 ou 6, p<0.05; Wilcoxon test). In the oxidation–reduction process, cytochrome P450 9e2 and peroxiredoxin-4 were significantly altered after Dicer-1 silencing in termites (Fig. 3K, L; n = 6, p<0.05; Wilcoxon test). These results implied an important effect of Dicer-1 on the immune response and oxidation–reduction reaction in whole-body of the termites. The effect of Dicer‑1 on behavioural disease defences in termite groups 

Para determinar o efeito do Dicer-1 na resposta comportamental à contaminação por fungos, testamos quatro importantes defesas comportamentais, locomoção, preparação, canibalismo e sepultamento, em cupins silenciados pelo Dicer-1-. Nossos resultados mostraram que a locomoção (Fig. 4A, t=7.013, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S3 and Video S1), grooming (Fig. 4B, t=5.949, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S4 and Video S2), cannibalistic (Fig. 4C, n =9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S1 and Video S3) and burial (Fig. 4D; n=9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S2 and Video S4) behaviors were significantly reduced in Dicer-1-silenced termites compared to GFP-treated termites, suggesting an important role of Dicer-1 in driving behavioral disease defenses in termite colonies.

Figura 3 Verificação por RT-qPCR de DEGs de mRNA-seq. A – H Genes associados ao metabolismo de carboidratos e energia. I – J Genes associados à resposta imune. K – L Genes associados a reações de oxidação-redução. Os dados são mostrados como média±SEM. *p<0.05

O efeito do Dicer-1 e do miR-71-5 nas habilidades antifúngicas em cupins

Para determinar o efeito dos miRNAs na resposta fisiológica à contaminação fúngica, testamos as atividades antifúngicas totais dos cupins{{0}silenciados por Dicer. Nossos resultados mostraram que a atividade antifúngica diminuiu significativamente (Fig. 5A; t=−3,046, df=5, p<0.05; paired t-test) in Dicer-1-silenced termites. Furthermore, miR-71-5 was selected for further testing to determine its role in physiological defense, which was chosen according to the comparative profiling of miRNAs and mRNAs in fungus-contaminated versus naive termites and miRNA-mRNA analysis (data unpublished). We found that the antifungal activity (Fig. 5B; t=−4.000, df=5, p<0.05; paired t-test) was significantly reduced in termites treated with miR-71-5 simulants compared to those treated with simulant controls. These results suggested that miRNAs played an important role in driving physiological disease defenses in termites.

Figura 4 Efeito da desregulação do miRNA nos comportamentos sociais defensivos em grupos de cupins. Comportamentos A de locomoção, preparação B, canibalismo C e enterro D de grupos de cupins Dicer-1-silenciados versus grupos de cupins tratados com GFP. Os dados são mostrados como média±SEM. *p<0.05, **p<0.01

Figura 5 Efeito da desregulação do miRNA na defesa fisiológica em cupins. Atividade antifúngica de cupins Dicer-1-silenciados versus cupins tratados com GFP. B Atividade antifúngica do miR-71-5 versus cupins tratados com simulador de controle. Os dados são mostrados como média±SEM. *p<0.05

Dicer‑1 e miR‑71‑5 influenciaram a sobrevivência de cupins contaminados por fungos

Como os simuladores dsDicer-1 e miR-71-5 levaram à redução da atividade antifúngica dos cupins, testamos seu potencial para o controle biológico dos cupins. Descobrimos que os cupins silenciados Dicer-1-contaminados com fungos exibiram uma sobrevivência significativamente menor em comparação com outros cupins tratados (fungo dsDicer-1+ vs. fungo dsGFP+: χ2=81.839, p.<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsDicer-1+Tween 80: χ2=63.070, p<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsGFP+Tween 80: χ2=65.474, p<0.001). GFP-treated termites contaminated with fungus showed significantly decreased survival compared to the termites without fungal contamination (dsGFP+fungus versus dsDicer-1+Tween 80: χ2=58.636, p<0.001; dsGFP+fungus versus dsGFP+Tween 80: χ2=68.849, p<0.001). There was no significant difference between dsDicer-1- and dsGFP-treated termites without fungal contamination (χ2=2.037, p=0.154) (Fig. 6A). Additionally, the survival of fungus-contaminated termites treated with the miR- 71-5 simulant was signifcantly decreased compared to that of other treated termites (miR-71-5+fungus vs. control+fungus: χ2=63.593, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. miR- 71–5+Tween 80: χ2=60.585, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. control+Tween 80: χ2=67.129, p<0.001). The survival of fungus-contaminated termites treated with the simulant control was significantly decreased compared to that of the termites without fungal contamination (control+fungus vs. miR-71-5+Tween 80: χ2=61.065, p<0.001; control+fungus vs. control+Tween 80: χ2=68.064, p<0.001). There was no significant difference in survival between termites treated with the miR-71-5 simulant and simulant control without fungal contamination (miR-71-5+Tween 80 vs. control+Tween 80: χ2=1.000, p=0.317) (Fig. 6B). These results suggested a good effect of miRNAs coupled with entomopathogens in biologically controlling termites.

Discussão

Os miRNAs desempenham múltiplas funções, como regular o metabolismo de carboidratos e energia, a resposta imunológica, reações de oxidação-redução e outros processos vitais em corpos inteiros dos cupins. Como esperado, a ingestão de dsDicer-1 em cupins levou ao silenciamento de Dicer-1 e depois reduziu a concentração de miRNA, sugerindo a indução bem-sucedida da desregulação do miRNA. A análise de transcrição mostrou que o silenciamento Dicer-1 estava associado a 32 vias KEGG e 175 termos GO. Em colônias de insetos sociais, a secreção salivar pode funcionar como um desinfetante externo e operar em conjunto com o comportamento social, como trofalaxia, preparação e nidificação para cuidar da prole, companheiros de ninho e colônias (Bulmer et al. 2009; Hamilton et al. 2011 ;Hamilton e Bulmer 2012). A glicólise, o ciclo do citrato e a geração de ATP a partir do ADP estão envolvidos no metabolismo de carboidratos e energia. Como o aumento das respostas imunitárias e a realização de comportamentos sociais são energeticamente dispendiosos, os distúrbios do metabolismo dos hidratos de carbono e da energia têm impactos negativos nestes processos (Liu et al. 2020; Hassan et al. 2021a, b; Xu et al. 2021a, b). O constituinte estrutural da cutícula associa-se às cutículas dos insetos, formando a primeira barreira para evitar que patógenos invadam a hemocele (Syazwan et al. 2021). Vários DEGs envolvidos na resposta de defesa, atividade da glutationa transferase e processo de oxidação-redução são capazes de codificar peptídeos antimicrobianos (AMPs), proteínas de desintoxicação e enzimas antioxidantes para aumentar a resistência e tolerância de insetos contra patógenos (Liu et al. 2015, 2019a). Estas funções relacionadas com a defesa são susceptíveis de contribuir para a imunidade social em colónias de térmitas. O restante das vias KEGG e termos GO estavam envolvidos no sistema nervoso, sistema digestivo, longevidade, desenvolvimento, etc. (Material suplementar 2-Tabela S3 e S4). Além disso, alguns dos DEGs (por exemplo, genes do metabolismo de carboidratos e energia) em cupins silenciados Dicer-1 eram de micróbios (Material suplementar 2-Tabela S2), que eram possivelmente os simbiontes intestinais e podem ser componentes importantes participando dos processos de vida dos anfitriões. Portanto, é provável que os miRNAs tenham um impacto global em todo o corpo do cupim.

Fig. 6 Efeito da disregulação do miRNA na sobrevivência de grupos de cupins contaminados por fungos. A Survival of Dicer- 1-silenciados versus cupins tratados com GFP com ou sem contaminação fúngica; B Sobrevivência de miR-71-5 versus cupins tratados com simulador de controle com ou sem contaminação fúngica. Letras diferentes indicam diferenças significativas, p<0.05

O metabolismo de carboidratos e energia, a resposta imune e as reações de oxidação-redução são importantes para os miRNAs na condução da imunidade social. O comportamento animal é um processo dependente de energia e, portanto, alguns inibidores de energia fazem com que os animais se movam lentamente e até morram (Davidson 1930; Schuler e Casida 2001). Em colônias de cupins, distúrbios da glicólise ou do ciclo do citrato resultam na diminuição dos níveis de ATP e inibem o comportamento de locomoção (Hassan et al. 2021a, b; Xu et al. 2021a, b). Os distúrbios do ciclo do citrato também reduzem a atividade antifúngica dos cupins, levando ao aumento da infecção e da mortalidade (Liu et al. 2020). Além disso, como foi relatado que os simbiontes nos intestinos dos cupins participam das defesas contra doenças do hospedeiro, fornecendo enzimas (Rosengaus et al. 2014) e metabólitos (Inagaki e Matsuura 2018), os distúrbios metabólicos nos simbiontes intestinais provavelmente reduziriam a imunocompetência derivada do simbionte. e, portanto, diminuição das defesas contra doenças de cupins. Em nosso estudo, verificou-se que oito genes metabólicos estavam significativamente regulados negativamente, sugerindo distúrbios da glicólise e do ciclo do citrato em todo o corpo dos cupins silenciados por Dicer. Sugerimos que o metabolismo energético e de carboidratos mediado por miRNA era um importante mecanismo bioquímico na condução da imunidade social e que a interrupção desse processo provavelmente diminuiria as defesas comportamentais e fisiológicas contra doenças em colônias de cupins. O sistema imunológico dos insetos induz um grande número de moléculas efetoras para combater patógenos in vivo. As defensinas são AMPs compactos, ricos em cisteína e resistentes à protease, com atividade de amplo espectro contra bactérias, fungos e outros parasitas (Weber 2021). A termicina é uma defensina antifúngica específica para cupins, cujo silenciamento resulta na diminuição da atividade antifúngica e, portanto, no aumento da mortalidade de cupins contaminados por fungos (Hamilton e Bulmer 2012). A desintoxicação de insetos e os sistemas antioxidantes geralmente funcionam em conjunto com o sistema imunológico, o que reduz efetivamente o risco de toxinas e ERO durante as interações hospedeiro-patógeno (Syazwan et al. 2021). As monooxigenases do citocromo P450 são responsáveis ​​por catalisar a oxidação e o metabolismo de toxinas patogênicas e produzir radicais livres ou ROS (Shankar e Mehendale 2014). A família das peroxirredoxinas inclui enzimas antioxidantes que catalisam a redução de ERO (Xu et al. 2021a; b). Nossos resultados verificaram que o silenciamento Dicer-1 alterou significativamente a expressão gênica de defensina, tricina, citocromo P450 9e2 e peroxirredoxina-4, indicando que os miRNAs desempenharam papéis importantes na regulação da resposta imune e reações de oxidação-redução em todo o corpo do cupim. Portanto, sugerimos que o metabolismo de carboidratos e energia, a resposta imune e as reações de oxidação-redução podem participar do mecanismo de condução da imunidade social em forma de miRNA, e sua interrupção pode impactar negativamente a imunidade social em colônias de cupins.

cistanche tubulosa – melhora o sistema imunológico

Na verdade, a desregulação do miRNA tem impactos negativos no movimento e, portanto, na defesa comportamental em colônias de cupins. Ao contrário dos insetos solitários, os insetos sociais desenvolveram um rico repertório de defesas comportamentais, detectando coletivamente a presença de patógenos, limitando a propagação de patógenos e reduzindo o risco de infecção dos indivíduos (Van Meyel et al. 2018; Liu et al. 2019a). As operárias mais velhas realizam tarefas perigosas fora do ninho e são facilmente contaminadas. Quando estão contaminados, os companheiros de ninho tendem a se unir e cuidar das operárias contaminadas (Liu et al. 2019b). Tanto as operárias contaminadas quanto seus cuidadores aumentam a distância do resto das companheiras de ninho ingênuas. As operárias enfermeiras levam as crias para as profundezas da colónia para aumentar a distância das operárias contaminadas (Stroeymeyt et al. 2018). Estes resultados mostram que um aumento na distância física entre os membros da colónia é uma estratégia eficaz para limitar a transmissão de patógenos [denominada 'imunidade organizacional' (Liu et al. 2019a)], e a locomoção deve ser um comportamento social importante, uma vez que ajusta adaptativamente o distância entre indivíduos contaminados e companheiros de ninho ingênuos. Hassan e colegas descobriram que os cupins melhoraram significativamente sua locomoção durante a contaminação por fungos, demonstrando ainda mais a locomoção em resposta a patógenos (Hassan et al. 2021a, b). Além disso, comportamentos de preparação, canibalismo e sepultamento são bem conhecidos no manejo de indivíduos e cadáveres contaminados em colônias de insetos sociais. Em cupins contaminados com fungos, o comportamento de limpeza ocorre imediatamente, antes da germinação (Liu et al. 2019b). Em contraste, o comportamento canibal só ocorre depois que os indivíduos contaminados ficam visivelmente doentes (Davis et al. 2018). Para o manejo de cadáveres, cadáveres frescos são frequentemente considerados recompensas nutricionais e induzem ao canibalismo ao produzirem um sinal de morte precoce. Em contraste, os cadáveres em decomposição são considerados riscos de infecção e induzem o sepultamento ao produzirem indícios de morte tardia (Sun et al. 2016). Aqui, descobrimos que o silenciamento de Dicer inibiu significativamente a locomoção e outros movimentos, como comportamentos de preparação, canibalismo e enterro, sugerindo que a desregulação do miRNA exibiu um efeito geral no movimento dos cupins e, consequentemente, afetou as defesas comportamentais contra patógenos, patógeno- companheiros de ninho contaminados e cadáveres contaminados por patógenos em colônias de cupins. Para o mecanismo de condução, o metabolismo energético e de carboidratos mediado por miRNA pode ser considerado um dos fatores bioquímicos mais importantes (ver a discussão acima). Portanto, os miRNAs poderiam moldar as defesas comportamentais dos cupins.

A desregulação do miRNA também teve impactos negativos nas defesas fisiológicas dos cupins. As térmitas normalmente aumentam a sua capacidade antifúngica através da regulação positiva de genes imunitários para melhorar as suas defesas fisiológicas (Liu et al. 2015). As substâncias antifúngicas derivadas do simbionte intestinal proporcionam aos cupins a capacidade de inibir o crescimento de fungos para aumentar suas defesas fisiológicas (Rosengaus et al. 2014). Portanto, a atividade antifúngica total foi um indicador eficaz das defesas fisiológicas dos cupins contra doenças. Estudos recentes mostraram que não apenas os genes imunológicos, mas também o metabolismo de carboidratos e os genes antioxidantes foram relatados como componentes importantes que afetam a atividade antifúngica dos cupins (Liu et al. 2020; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). Os cupins defaunados eram mais vulneráveis ​​à contaminação fúngica (Rosengaus et al. 2014). Embora tenha aumentado as expressões de genes imunológicos, como defensina e tricina, a desregulação do miRNA mediada por Dicer diminuiu a expressão do metabolismo de carboidratos e genes antioxidantes em cupins ou simbiontes intestinais e, portanto, reduziu significativamente a atividade antifúngica total dos cupins. Além disso, os cupins tratados com o simulador miR-71-5 também exibiram uma diminuição na atividade antifúngica total, sugerindo ainda o impacto negativo da desregulação do miRNA nas defesas fisiológicas dos cupins. Além disso, os grupos de cupins alimentados com o simulador dsDicer-1 ou miR-71-5 eram mais vulneráveis ​​à contaminação por fungos, mostrando um aumento na mortalidade por infecção. Portanto, os miRNAs poderiam moldar a imunidade social, impulsionando as defesas comportamentais e fisiológicas contra doenças em colônias de cupins.

Fig. 7 Mecanismos potenciais subjacentes à imunidade social em colónias de térmitas e novos alvos para o controlo biológico de pragas. Os miRNAs afetam amplamente todo o corpo dos cupins, incluindo o metabolismo de carboidratos e energia A, resposta imune B, reações de oxidação-redução de C, etc. D Foi relatado que o metabolismo de carboidratos e energia desempenha papéis importantes na regulação do comportamento e da atividade antifúngica em cupins. Portanto, o metabolismo energético e de carboidratos mediado por miRNA provavelmente seria um dos fatores genéticos e bioquímicos que impulsionam as defesas comportamentais (como locomoção, higiene, canibalismo e sepultamento) e fisiológicas (atividade antifúngica) em colônias de cupins. E A resposta imune ajudou os cupins a inibir a replicação e disseminação de patógenos na cavidade corporal. A reação de oxidação-redução protegeu os cupins dos danos causados ​​por toxinas e ROS das interações "hospedeiro-patógeno". Portanto, a resposta imune mediada por miRNA e a reação de oxidação-redução desempenham um papel importante na condução da defesa fisiológica contra doenças em cupins. Os miRNAs F moldaram a imunidade social, impulsionando defesas comportamentais e fisiológicas contra doenças em colônias de cupins. Ao direcionar os miRNAs, poderíamos aumentar artificialmente a suscetibilidade das colônias de cupins aos entomopatógenos e, consequentemente, melhorar o controle biológico dos cupins.

Até onde sabemos, este é o primeiro relato do mecanismo potencial dos miRNAs subjacentes à imunidade social em colônias de cupins. Os miRNAs podem afetar a secreção salivar, o metabolismo de carboidratos e energia, a geração de cutículas, respostas imunológicas, reações de oxidação-redução, etc. Entre eles, o metabolismo de carboidratos e energia é provavelmente um fator bioquímico importante na condução de defesas comportamentais, como locomoção, higiene, canibalismo, e sepultamento em colônias de cupins. Além disso, o metabolismo de carboidratos e energia, a resposta imune e as reações de oxidação-redução provavelmente participam na condução das defesas fisiológicas dos cupins, como a atividade antifúngica.

Portanto, a imunidade social em forma de miRNA pode influenciar a suscetibilidade das colônias de cupins a fungos entomopatogênicos; portanto, os miRNAs podem ser alvos eficazes para o controle biológico de cupins (Fig. 7). Numerosos estudos provaram que o silenciamento de genes alvo mediado por RNAi pode levar à morte de insetos, com potencial considerável para o controle de pragas de insetos. No controle de pragas de cupins, Zhou et al. (2008) primeiro direcionaram os genes da endoglucanase e dos hexâmeros através da alimentação com dsRNA, demonstrando a viabilidade de termiticidas baseados em RNAi. Para aumentar o efeito letal em colônias de cupins, têm sido empregados termiticidas à base de RNAi acoplados a fungos entomopatogênicos infecciosos. O silenciamento de tricina, GNBP2, TG, IDH e outros genes codificadores mediado por RNAi, juntamente com Metarhizium, poderia aumentar significativamente a suscetibilidade dos companheiros de ninho a conídios fúngicos transferidos socialmente e, portanto, levar a um aumento na taxa de mortalidade por infecção (Hamilton e Bulmer 2012; Liu et al 2020; Zhao e outros 2020; Zhou e outros 2021). Em nosso estudo, demonstramos a viabilidade de direcionar pequenos RNAs não codificantes através da alimentação para otimizar o controle biológico de cupins usando Metarhizium. Em comparação com dsRNAs direcionados especificamente a um gene, os miRNAs foram capazes de atingir vários genes com funções iguais ou diferentes, tendo, portanto, um impacto de amplo espectro nos processos vitais dos cupins. Portanto, ao direcionar os miRNAs, os grupos de cupins exibiram defesas comportamentais e fisiológicas diminuídas contra doenças, tanto no nível do grupo quanto no individual, sugerindo uma inibição de amplo espectro da imunidade social dos cupins. Ao visar os miRNAs, os grupos de cupins exibiram consequentemente um alto nível de mortalidade durante a contaminação fúngica, sugerindo que os miRNAs poderiam ser empregados como termicidas para melhorar o controle biológico dos cupins, diminuindo sua imunidade social. Portanto, os miRNAs podem ser considerados potenciais novos alvos para o controle de pragas de insetos.

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