MicroRNAs no desenvolvimento e doenças renais Ⅱ

Desenvolvimento renal

Orim de mamífero(ou metanefro) é um órgão vital que desempenha um papel crítico noexcreção de resíduos metabólicos,regulação do volume de líquido extracelular, emanutenção de eletrólitoehomeostase ácido-base. Além disso, o rim produz hormônios importantes, comoeritropoetina, calcitriol,renina, eprostaglandinas(48). A capacidade funcional do rim se correlaciona com o número de néfrons funcionais que são formados durante o desenvolvimento renal antes do nascimento, também denominado dotação de néfrons. Cada rim humano contém em média 1,000,000 néfrons, embora esse número varie consideravelmente, com estimativas variando de 200,000 a 2,000,{{8 }} néfrons (49, 50). Comenvelhecimento,perda de reserva funcional de néfronsocorre ao longo do tempo (51, 52); portanto, a baixa dotação de néfrons ao nascer está associada a um risco aumentado de desenvolver hipertensão e doença renal crónica (DRC) mais tarde na vida (53–55). Além disso, o CAKUT, que leva à diminuição da dotação e da função do néfron, é a principal causa de insuficiência renal em crianças, resultando em morbidade e mortalidade significativas associadas ao transplante e à diálise (56, 57). Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao estabelecimento do número de néfrons e à formação normal de néfrons fornece insights sobre novos caminhos para prever, prevenir e tratar a doença renal infantil.

QUANTO TEMPO DEMORA PARA O CISTANCHE FUNCIONAR PARA PACIENTES COM DOENÇAS RENAIS?

Desenvolvimento renal metanéfricocomeça por volta do dia embrionário 10.5 (E10.5) em camundongos e por volta da quinta semana de gestação em humanos (58). Em resposta aos sinais indutivos do mesênquima metanéfrico, o broto ureteral estende-se da extremidade caudal do ducto de Wolff e invade o mesênquima adjacente (Figura 2). Simultaneamente, os morfogênios que emanam do botão uretérico induzem a condensação do mesênquima metanéfrico para formar o mesênquima cap (também denominado progenitores do néfron) ao redor das pontas do botão uretérico. À medida que a nefrogênese progride, o botão ureteral passa por sucessivos ciclos de ramificação, alongamento e diferenciação para gerar os ductos coletores do rim. Uma subpopulação de progenitores de néfrons sofre transição mesenquimal-epitelial para formar vesículas renais, que após polarização e alongamento tornam-se estruturas corporais em forma de vírgula e S. Finalmente, a porção distal do corpo em forma de S se funde com o ducto coletor para formar um néfron funcional (59–61). O corpo em forma de S sofre diferenciação adicional para formar os tipos de células maduras do néfron, além do ducto coletor. As células progenitoras estromais Foxd 1+ são adjacentes aos progenitores do néfron na zona cortical externa ou nefrogênica do rim em desenvolvimento (Figura 2) (62). Acredita-se que os sinais do estroma cortical inibem a expansão das células progenitoras do néfron e estimulam sua diferenciação, já que a ablação do estroma renal resulta em diferenciação prejudicada do progenitor do néfron (63). As células progenitoras Foxd 1+ dão origem a todas as células estromais no rim metanéfrico, incluindo células intersticiais corticais e medulares renais, pericitos, fibroblastos perivasculares, células mesangiais e células musculares lisas vasculares (64, 65). Perturbações em qualquer etapa deste processo podem levar ao CAKUT, a principal causa da DRC infantil (66, 67).

O néfron maduro é composto por um glomérulo que atua como unidade de filtração e um compartimento tubular de sorção posterior que é subdividido em um túbulo contorcido proximal, uma alça de Henle, um túbulo contorcido distal e um ducto coletor (Figura 2). A barreira de filtração do glomérulo (que compreende o endotélio fenestrado, a membrana basal glomerular, os processos dos pés e os diafragmas em fenda dos podócitos) permite a filtração do plasma e pequenos solutos, enquanto retém seletivamente proteínas como albumina e imunoglobulinas no sangue (68, 69). Enquanto isso, o compartimento de reabsorção tubular é responsável pela manutenção da homeostase da água, pela reabsorção de solutos (incluindo sódio, potássio, cálcio, fósforo, magnésio, glicose e muitos outros) e pela excreção de ácidos e outros resíduos.

MiRNAs no rim em desenvolvimento

Em estudos em camundongos transgênicos condicionais, os miRNAs emergiram como reguladores críticos da morfogênese renal em múltiplas linhagens celulares. Os estudos iniciais que avaliaram um papel funcional dos miRNAs no desenvolvimento renal utilizaram a deleção condicional de Dicer (70) em diferentes linhagens renais. No entanto, Dicer também é conhecido por ter papéis independentes de miRNA (71), o que complicou a interpretação destes modelos. A deleção condicional de Dicer no mesênquima metanéfrico precoce ou nos progenitores de néfrons resulta em apoptose aumentada de progenitores de néfrons, níveis elevados da proteína proapoptótica Bim e cessação prematura da nefrogênese (72-75) (Tabela 1). Curiosamente, a perda da expressão de Bim em progenitores de néfrons deficientes em Dicer diminui a apoptose e restaura parcialmente a formação de néfrons. Dois miRNAs expressos em progenitores de néfrons, miR-17 e miR-106, foram identificados como supressores da expressão BIM (76). Juntas, essas descobertas indicam que os miRNAs controlam o equilíbrio entre sobrevivência e apoptose nos progenitores de néfrons para garantir a formação de um número correto de néfrons ao longo da nefrogênese.

Figura 2. Ilustração esquemática das fases de desenvolvimento do rim metanéfrico. Os sinais do botão ureteral desencadeiam a condensação do mesênquima metanéfrico para formar uma capa de progenitores de néfrons (mesênquima da tampa) ao redor das pontas dos botões uretéricos. O mesênquima da capa sofre uma transição mesenquimal-epitelial para formar vesículas renais, que se desenvolvem sequencialmente em corpos em forma de vírgula e S. Essas estruturas se conectam ao pedúnculo do botão ureteral, que dá origem ao ducto coletor. As células no domínio proximal do corpo em forma de S diferenciam-se em células epiteliais especializadas do corpúsculo renal maduro (ou seja, podócitos e células da cápsula de Bowman), enquanto as células nas porções média e distal se diferenciam nos segmentos tubulares do néfron (túbulos proximais). , alças de Henle e túbulos distais). Criado com BioRender.com.

A deleção condicional de Dicer na linhagem do botão ureteral resulta em um espectro de anormalidades que se assemelham fortemente ao CAKUT, incluindo displasia renal e o desenvolvimento de cistos no ducto coletor (73, 77, 78). A terminação prematura da morfogênese ramificada (em resposta à diminuição da expressão de Wnt11 e c-Ret do botão ureteral) é provavelmente o principal fator que contribui para a displasia renal (73). O início da formação de cistos ocorre por volta de E15.5 e está associado a defeitos no comprimento dos cílios primários, aumento da morte celular por apoptose e proliferação celular excessiva (73). Como Dicer tem importantes papéis independentes de miRNA na célula, a deleção condicional de Dgcr8 tem sido usada para confirmar que os fenótipos observados em modelos condicionais de Dicer-knockout são de fato o resultado da perda de miRNAs. Animais com deleção de Dgcr8 no néfron distal e derivados do ducto coletor desenvolvem hidronefrose e cistos do ducto coletor (79), um fenótipo semelhante ao CAKUT que se assemelha à perda da atividade de Dicer na linhagem do botão ureteral.

Estudos de dois grupos independentes demonstraram que a ablação de Dicer da linhagem do estroma renal Foxd1+ e seus derivados resulta em um espectro de anomalias renais, com achados consistentes em relação a rins hipoplásicos, número glomerular reduzido, maturação glomerular anormal e alterações vasculares defeituosas. padronização (80, 81). Embora ambos os grupos tenham descrito fenótipos amplamente concordantes usando modelos de camundongos semelhantes, duas diferenças distintas foram observadas. Nakagawa et al. observaram falta da medula interna e da papila, bem como diminuição da zona nefrogênica (80). Em contraste, Phua et al. mostraram uma expansão da população progenitora de néfrons e papila renal preservada (81). Nakagawa et al. propuseram que esses defeitos estão relacionados à interrupção da sinalização da via Wnt, resultando em mudanças na migração e proliferação de células estromais, devido à regulação negativa dos miRNAs das células estromais, miR-214, miR-199a{{7 }}p e miR-199a-3p (80). O estudo de Phua et al. sugeriram que mudanças nos programas apoptóticos (incluindo expressão aumentada dos genes efetores Bim e p53) contribuem para defeitos fenotípicos (81). É concebível que diferenças genéticas de fundo e/ou a eficiência da recombinação mediada por Cre possam ser responsáveis ​​pelas diferenças que estes estudos descrevem. No entanto, os fenótipos descritos são consistentes com os papéis multifacetados conhecidos do estroma renal no desenvolvimento renal, e os mecanismos subjacentes a estes fenótipos são provavelmente complexos, dada a natureza de uma deleção de Dicer. Mais estudos examinando miRNAs específicos em várias subpopulações estromais são necessários para definir melhor os mecanismos regulatórios em jogo.

Trabalhos mais recentes abordaram a questão da função de miRNAs específicos nos progenitores renais e néfrons em desenvolvimento. Usando um modelo de células-tronco embrionárias humanas, Bantounas et al. mostraram que a inibição do cluster miR-199a~214 resulta em glomérulos dismórficos, túbulos proximais aberrantes, diminuição da expressão de WT1 e aumento de capilares intersticiais em organoides semelhantes a rins (82). Curiosamente, a deleção global do miR responsivo à hipóxia -210 resulta em um déficit de néfrons específico do homem (83). Por exemplo, a deleção condicional do cluster miR-17~92 em progenitores de néfrons e seus derivados em camundongos prejudica a proliferação de células progenitoras e reduz o número de néfrons em desenvolvimento. Como resultado, camundongos mutantes desenvolvem proteinúria, fibrose renal e comprometimento da função renal (84). Níveis desregulados do gene alvo miR-17~92, CFTR, estão implicados na proliferação defeituosa de células progenitoras e na redução da dotação de néfrons neste modelo de camundongo (85).

O sequenciamento de RNA pequeno (smRNA-Seq) tem sido cada vez mais utilizado para traçar padrões de expressão de miRNA e para a descoberta de novas espécies de miRNA. smRNA-Seq de células mesenquimais nefrogênicas E15.5 identificou 162 miRNAs anotados que são expressos diferencialmente nesta população de células em comparação com rins inteiros e 49 novas espécies de miRNA (86). Curiosamente, os níveis de miRNAs da família miR-200 foram significativamente reduzidos nos progenitores de néfrons. Dado que os membros da família miR -200 são reguladores chave da transição mesenquimal-epitelial no ducto coletor (87), especulamos que sua expressão pode ser fortemente regulada para garantir a diferenciação epitelial normal dos progenitores do néfron durante o desenvolvimento renal.

Função MiRNA no néfron maduro

Além de sua necessidade durante o desenvolvimento renal, os miRNAs regulam numerosos processos biológicos nas principais linhagens celulares que formam o néfron maduro (69, 88-91). De acordo com isso, a expressão específica do segmento de miRNAs ao longo do néfron foi descrita, incluindo miR-143 e miR-195a no glomérulo, miR-107 e miR{{7} }a no túbulo proximal, miR-193 e miR-378a no ramo ascendente espesso, miR-874 e miR-155 no túbulo contorcido distal, e miR{{ 12}}c no duto coletor (87). Além disso, estudos funcionais em compartimentos do néfron maduro apoiam papéis distintos para os miRNAs.

Camundongos sem Dicer ou Drosha nos podócitos exibem proteinúria acentuada, glomeruloesclerose e rápida progressão para insuficiência renal, secundária à ruptura da barreira de filtração glomerular (90-93). Análises in silico revelaram que vários transcritos regulados positivamente em glomérulos mutantes contêm sequências alvo para membros da família miR-30. Como todos os quatro membros da família miR-30 (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d e miR-30c{ {9}}) são normalmente altamente expressos em podócitos, esses miRNAs podem ser responsáveis ​​pelas anormalidades podocitárias e pela ruptura da barreira de filtração glomerular em camundongos mutantes (91).

Surpreendentemente, a deleção de Dicer dos túbulos proximais de mamíferos pós-natais não afeta o desenvolvimento, a histologia ou a função renal, mas protege contra lesão de isquemia/reperfusão renal. Camundongos mutantes apresentam melhor função renal, redução da lesão renal, menor apoptose tubular e melhor sobrevivência em comparação com seus irmãos de ninhada WT (94). Isto provavelmente reflete a "soma" do efeito da deleção de múltiplos miRNAs no túbulo proximal, já que outro trabalho demonstrou desde então que a expressão de miRNAs específicos é protetora na lesão de isquemia/reperfusão renal (por exemplo, miR-16 e miR-21; enquanto outros são prejudiciais (por exemplo, miR-182; ref. 97).

Embora os miRNAs pareçam ser dispensáveis ​​para a função do túbulo proximal, eles são essenciais para os néfrons distais e para a homeostase do ducto coletor (79, 88, 98). A coleta de inativação específica do ducto de Dicer e outros genes críticos associados à biogênese do miRNA (incluindo Dgcr8, Ago1, 2, 3 e 4) causa insuficiência renal em camundongos adultos devido à fibrose tubulointersticial progressiva e à inflamação intersticial (88). Isso é precedido por uma transição epitelial-mesenquimal parcial (EMT) das células do ducto coletor e pela regulação negativa dos membros da família miR-200, que inibem a EMT (88). Da mesma forma, a ablação de Dicer ou Dgcr8 do néfron distal e dos derivados do botão ureteral, respectivamente, resulta em anormalidades renais e insuficiência renal (78, 98), que estão, em última análise, associadas à regulação negativa dos membros da família miR -200 (98). O aumento da expressão do gene alvo miR-200 Pkd1 nesses camundongos mutantes interrompe a tubulogênese e produz estruturas semelhantes a cistos (98). Essas diferenças na necessidade de miRNAs funcionais nos túbulos proximais e no néfron / ducto coletor distal podem ser explicadas pela distribuição segmentar dos miRNAs ao longo do comprimento do néfron e do ducto coletor nos rins WT (88).

A deleção de Dicer nas células secretoras de renina no aparelho justaglomerular resulta em um déficit de células justaglomerulares, redução dos níveis circulantes de renina com conseqüente redução na pressão arterial, redução da função renal, padrão listrado de fibrose intersticial e anormalidades vasculares (89). A redução nas células justaglomerulares sugere uma necessidade de miRNAs maduros na manutenção do seu fenótipo. Mais tarde, miR-330 e miR-125b-5p foram identificados como potenciais candidatos que inibem ou promovem, respectivamente, o fenótipo do músculo liso das células justaglomerulares (99).

Outras áreas ativas de pesquisa sobre miRNAs na lesão renal aguda (8–10), doença renal policística (11) e transplante renal (10) foram abordadas de forma abrangente em outras revisões recentes.

MiRNAs em doenças renais pediátricas Nesta seção, fornecemos uma visão geral do papel dos miRNAs nas doenças renais do desenvolvimento, incluindo tumores CAKUT e Wilms. Os CAKUT estão entre as formas mais frequentes de malformações ao nascimento, afetando aproximadamente 3 a 7 em cada 1.000 nascidos vivos (100). A interrupção do desenvolvimento renal e do trato urinário inferior leva a um amplo espectro de manifestações clínicas observadas no CAKUT, incluindo anomalias renais (isto é, agenesia renal, hipoplasia e displasia renal e rins displásicos multicísticos), anomalias ureteropélvicas (isto é, obstrução da junção ureteropélvica), sistema coletor duplex e anomalias da bexiga e da uretra (101–103). Essa heterogeneidade fenotípica é provavelmente devida a interações complexas entre fatores genéticos, epigenéticos e/ou ambientais pré-natais que afetam o desenvolvimento dos rins e do trato urinário inferior, resultando em CAKUT (101). A maior parte do nosso conhecimento atual sobre a patogênese do CAKUT surgiu de modelos de camundongos e formas sindrômicas de CAKUT. Estes estudos levaram à identificação de vários genes CAKUT, muitos dos quais estão implicados no desenvolvimento renal inicial, incluindo PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 e outros (101, 104, 105). No entanto, mutações únicas ou variantes do número de cópias em genes codificadores de proteínas não explicam a maioria dos casos de CAKUT (~80%) (101, 106).

Como mencionado acima, a depleção de miRNAs maduros de diferentes linhagens celulares do rim em desenvolvimento em modelos de camundongos resulta em anormalidades renais que imitam o CAKUT humano (73, 74, 78, 79). Além disso, deleções germinativas de MIR17HG, que codifica o cluster miR-17~92, causam a síndrome de Feingold tipo 2 em humanos (107). Embora um fenótipo renal em pacientes com síndrome de Feingold tipo 2 com mutações MIR17HG permaneça indefinido, uma incidência de 18% de CAKUT foi relatada em casos de síndrome de Feingold associados a mutações MYCN (108, 109). Juntas, estas observações sugerem que mutações em miRNAs expressos durante o desenvolvimento renal podem causar CAKUT em humanos, particularmente porque muitos miRNAs são altamente conservados entre camundongos e humanos.

Para testar esta hipótese, um estudo investigou 1.248 pacientes com CAKUT não sindrômico de 980 famílias e procurou mutações em 96 regiões de haste-alça de 73 genes de miRNA de desenvolvimento renal (106). Dentro desta coorte, foram identificados 31 indivíduos com 17 variantes diferentes de nucleotídeo único afetando 16 genes de miRNA diferentes. Entre estas, duas novas variantes em miRNAs foram consideradas potencialmente patogênicas. MIR19B1 (um membro do cluster miR-17~92) foi associado à presença de agenesia renal direita, e MIR99A foi associado a refluxo vesicoureteral grave e ptose renal. Este número surpreendentemente baixo de variantes patogênicas candidatas deve-se em parte às limitações deste estudo, já que a análise considerou apenas mutações em genes de miRNA que foram incluídos na abordagem do gene candidato e não detectou variações no número de cópias e grandes rearranjos de DNA (106) .

Em uma abordagem alternativa, segmentos de ureter de pacientes com uma variedade de CAKUT foram analisados ​​quanto à expressão diferencial de transcritos via microarray, quanto à presença de alvos de miRNA previstos bioinformaticamente e miRNAs maduros via qPCR (110). Usando esta abordagem multifacetada, sete miRNAs foram identificados com papéis potenciais no CAKUT e, entre eles, o has-miR-144 foi significativamente aumentado em pacientes com CAKUT. A análise de ontologia genética indicou que os genes-alvo has-miR -144 previstos contribuem para os processos biológicos envolvidos no desenvolvimento de CAKUT, incluindo o desenvolvimento do tubo (22 genes-alvo), desenvolvimento do sistema urogenital (18 genes-alvo), desenvolvimento renal (14 genes-alvo) e desenvolvimento de órgãos embrionários (18 genes-alvo) (110).

Mais estudos são necessários para definir os mecanismos moleculares subjacentes aos papéis patogênicos dos miRNAs no CAKUT. As descobertas de tais estudos serão críticas para melhorar o tratamento de pacientes com CAKUT e prevenir sua progressão para DRC, fornecendo aconselhamento genético apropriado para pacientes e suas famílias e desenvolvendo novas estratégias terapêuticas.