A metformina protege as células epiteliais do cristalino contra a senescência em um modelo de camundongo envelhecido naturalmente

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INTRODUÇÃO

As células epiteliais do cristalino (LECs) formam uma monocamada de células que revestem a cápsula anterior do cristalino e se estendem até o arco do cristalino equatorial [1, 2]. A construção e função normais dos LECs são essenciais para a manutenção da transparência e homeostase metabólica de todo o cristalino[3]. Evidências crescentes indicam que a senescência de LECs pode causar modificação, desnaturação e agregação de proteínas do cristalino, incluindo enzimas e cristalinas, levando à opacificação do cristalino ou mesmo catarata [3-5]. A catarata relacionada à idade (ARC) continua sendo a principal causa de deficiência visual e cegueira, o que afeta gravemente a qualidade de vida dos idosos [6]. Atualmente, não existem estratégias eficazes para a prevenção da progressão da ARC. Portanto, é necessário desenvolver uma intervenção farmacológica que possa melhorar a transparência da lente e retardar a progressão do ARC.

Nas últimas décadas, os cientistas alcançaram um progresso notável na melhoria da saúde e no prolongamento da vida usando várias intervenções genéticas, dietéticas e farmacológicas [7]. A metformina (MET) é um dos agentes antienvelhecimento amplamente estudados. Estudos substanciais sugerem que o MET pode aliviar a senescência e prolongar uma vida útil saudável em vários sistemas de modelos animais. O MET pode não apenas prolongar a vida útil de Caenorhabditis elegans, mas também melhorar sua saúde e vitalidade [8]. O MET pode reduzir o acúmulo de danos ao DNA relacionado à idade e ao estresse oxidativo em células-tronco do intestino médio de Drosophila para prolongar sua vida útil [9]. Estudos anteriores também indicam que a administração crônica de baixa dose de MET melhora a saúde e a vida útil dos camundongos [10]. Além disso, evidências emergentes indicam que quando os pacientes com diabetes são tratados com MET, eles manifestam benefícios de sobrevida, mesmo quando comparados com controles que não têm diabetes [11].

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Além da atividade de promoção do tempo de vida do MET em vários organismos modelo, o MET tem como alvo várias vias de sinalização celular para melhorar as doenças relacionadas à idade. O MET demonstrou modular a autofagia principalmente através da ativação da proteína quinase (AMPK) ativada pelo monofosfato de adenosina (AMP) e prevenir a neurodegeneração e a neuroinflamação para desempenhar um papel neuroprotetor na doença de Parkinson [12]. Da mesma forma, o MET melhora as alterações relacionadas à idade na célula endotelial sinusoidal do fígado através das vias AMPK e óxido nítrico endotelial [13].dosagem de cistanche redditAlém disso, a ativação crônica de AMPK por MET previne a cardiomiopatia por autoregulação da autofagia em camundongos OVE26 com diabetes [14]. Além disso, o MET alivia a deterioração cardiovascular associada à idade, aumentando a autofagia e a restrição calórica [15]. Além disso, o tratamento com MET pode inibir a aterosclerose associada à idade em camundongos e coelhos ApoE-7-induzida por uma dieta rica em gordura, prevenindo significativamente a calcificação da placa aterosclerótica, reduzindo os níveis de proteína C reativa de alta sensibilidade e reprimindo a ativação do via fator nuclear kappa B(NF-kB) nos vasos sanguíneos [16-18].

Com base nessas observações, o presente estudo tentou explorar se a MET pode retardar o envelhecimento da ARC e o mecanismo molecular subjacente. Nossas descobertas são as seguintes: (i) o tratamento crônico com MET de baixa dose atrasou a senescência de LECs em camundongos naturalmente envelhecidos, inibindo assim a opacidade da lente; (i) a via AMPK foi inativada e o fluxo autofágico foi prejudicado em LECs senescentes; (i) ) o tratamento crônico com baixa dose de MET atrasou a senescência de LECs em camundongos naturalmente envelhecidos, ativando a via AMPK e aumentando a autofagia. Nossos achados comprovam o suposto papel antienvelhecimento do MET e fornecem evidências suficientes de que o MET pode vir a ser uma possível opção terapêutica para ARC.

RESULTADOS

Senescência de LECs foi associada com ARC em camundongos naturalmente envelhecidos

Múltiplos mecanismos potenciais de ARC, incluindo o efeito do envelhecimento, têm sido extensivamente investigados.benefícios do extrato de cistache,No entanto, a associação entre a senescência de LECs e ARC in vivo permanece incerta. Nós hipotetizamos que a senescência de LECs pode resultar em ARC in vivo. Portanto, construímos um modelo de rato de ARC. Nossos resultados revelaram que a transparência da lente em camundongos naturalmente envelhecidos (camundongos mais velhos) foi significativamente diminuída em comparação com o grupo controle (camundongos jovens) (Fig.1a). Conforme mostrado na Fig.1b, a incidência de catarata no grupo naturalmente envelhecido foi de 95,23 por cento. O ensaio de coloração H&E indicou que os LECs no grupo controle eram de forma redonda e organizados regularmente, e a densidade dos LECs normais era relativamente alta, enquanto os LECs dos camundongos naturalmente envelhecidos eram de forma plana e dispostos desigualmente, e a densidade de LECs LECs senescentes foi marcadamente diminuída (Fig.1c). Além disso, a coloração SA- -Gal mostrou que a proporção de LECs senescentes foi elevada em camundongos naturalmente envelhecidos (Fig. 1d). Além disso, analisamos a expressão proteica de marcadores associados à senescência por meio de coloração IHC e análise de Western blot. A coloração IHC revelou que a expressão de p21 e p53 foi aumentada nos LECs de camundongos naturalmente envelhecidos em comparação com camundongos jovens (Fig. 1e, f). Da mesma forma, descobrimos ainda que a expressão proteica de p21 e p53 era maior nas cápsulas do cristalino de camundongos naturalmente envelhecidos do que nas cápsulas do cristalino de camundongos jovens (Fig. 1g). Esses resultados sugeriram que a senescência de LECs foi associada com ARC em camundongos naturalmente envelhecidos.

Cistanche pode anti-envelhecimento

A administração crônica de MET de baixa dose melhorou a transparência da lente e aliviou a senescência de LECs Antes de testarmos o efeito da metformina no ARC, determinamos se a administração crônica de MET de baixa dose é segura para camundongos. Após o tratamento com MET por 10 meses, 28 camundongos (18 no grupo naturalmente envelhecido e 10 no grupo MET) morreram de causas naturais. Descobrimos que os camundongos vivos em ambos os grupos eram saudáveis ​​e não houve diferença significativa nos pesos corporais e pesos dos órgãos entre os dois grupos (Tabela 1). Portanto, esses resultados indicaram que a dosagem de metformina utilizada no estudo era segura para os animais e poderia ser utilizada em experimentos subsequentes.

Subsequentemente, MET crônica de baixa dose foi administrada para avaliar se a MET poderia inibir a opacidade da lente e aliviar a senescência de LECs relacionada à idade em camundongos naturalmente envelhecidos. Como esperado, a transparência da lente no grupo MET foi muito melhor em comparação com a transparência da lente no grupo naturalmente envelhecido (Fig.2a). Além disso, observações morfológicas confirmaram que a lente do grupo MET apresentou redução na opacidade. A incidência de catarata no grupo naturalmente envelhecido foi de 95,23 por cento, enquanto que no grupo MET foi de 19,00 por cento (Fig.2b). O ensaio de coloração H&E revelou que a densidade de LECs no grupo MET foi notavelmente maior do que nos camundongos naturalmente envelhecidos (Fig. 2c). Além disso, os LECs do grupo MET eram de forma relativamente redonda em comparação com os do grupo naturalmente envelhecido (Fig.2c). A coloração SA- -Gal mostrou que a proporção de LECs senescentes foi significativamente diminuída no grupo MET em comparação com o grupo naturalmente envelhecido (Fig.2d). A análise de IHC revelou que a expressão de p21 e p53 foi diminuída mais nos LECs do grupo MET do que no grupo naturalmente envelhecido (Fig.2e, f). Da mesma forma, a análise de Western blot revelou que a expressão proteica de p21 e p53 foi notavelmente diminuída nas cápsulas do cristalino do grupo MET em comparação com as do grupo naturalmente envelhecido (Fig. 2g). Esses resultados significam que a administração crônica de MET de baixa dose pode melhorar a transparência da lente e aliviar a senescência de LECs.

A administração crônica de baixa dose de MET atenuou a senescência de LECs em camundongos naturalmente envelhecidos por meio da ativação de AMPK . Considerando essa teoria, avaliamos a expressão da via AMPK em LECs de camundongos. O nível relativo de mRNA de FAS foi reduzido no grupo naturalmente envelhecido e aumentado no grupo MET (Fig. 3a). Conforme mostrado na Fig.3b,c, a expressão de AMPka fosforilada (Thr172) e ACC fosforilada (Ser79) foi reduzida nos LECs de camundongos naturalmente envelhecidos em comparação com os de camundongos jovens. No entanto, a expressão de AMPKa fosforilada (Thr172) e ACC fosforilada (Ser79) foi elevada nas LECs do grupo MET em comparação com as do grupo naturalmente envelhecido. Além disso, a análise de Western blot revelou que a expressão proteica de AMPKa fosforilado (Thr172) e ACC fosforilado (Ser79) foi significativamente regulada negativamente nas cápsulas do cristalino de idosos naturalmente envelhecidos, e os níveis de expressão proteica de AMPKa fosforilado (Thr172) e ACC fosforilado ( Ser79) estavam aumentados nas cápsulas do cristalino do Grupo MET (Fig.3d). Esses dados revelaram que a via AMPK foi inativada nos LECs de camundongos naturalmente envelhecidos. Além disso, a administração crônica de baixa dose de MET atenuou a senescência de LECs em camundongos naturalmente envelhecidos por meio da ativação de AMPK.

A administração crônica de baixa dose de MET restaurou o fluxo autofágico para aliviar a senescência de LECs em camundongos naturalmente envelhecidos. Estudos anteriores indicaram que a autofagia pode desempenhar um papel importante no combate aos efeitos adversos do envelhecimento [21,22]. Para analisar ainda mais as alterações moleculares e celulares no cristalino após o tratamento com MET, determinamos a expressão de LC3 e p62 porque são amplamente aceitos como biomarcadores dos níveis de autofagia. Conforme demonstrado na Fig. 4a, o nível de expressão de mRNA de p62 relativo aumentou significativamente no grupo naturalmente envelhecido em comparação com o do grupo controle; no entanto, o nível relativo de expressão de mRNA de p62 foi substancialmente regulado negativamente no grupo MET em comparação com o grupo naturalmente envelhecido.cistanche genghis khanAlém disso, a coloração IHC revelou que os níveis de proteína 1 de cadeia leve 3(LC3-II/l) associada a microtúbulos e p62 estavam aumentados nos LECs de camundongos naturalmente envelhecidos. Além disso, nossos resultados ilustraram que os níveis de LC3-II/le p62 foram notavelmente diminuídos nos LECs do Grupo MET (Fig. 4b, c). Os níveis de proteína de LC3-ll e p62 foram acentuadamente aumentados nas cápsulas do cristalino do grupo naturalmente envelhecido (Fig.4d). Ao todo, especulamos que o fluxo autofágico foi prejudicado nos LECs de camundongos naturalmente envelhecidos e poderia ser restaurado pela administração crônica de baixa dose de MET para aliviar a senescência de LECs em camundongos naturalmente envelhecidos.

DISCUSSÃO

A catarata não tratada é uma das principais causas de cegueira em todo o mundo, caracterizada pela opacificação do cristalino [23]. Estudos epidemiológicos mostraram que a idade é o fator de risco dominante para a catarata, conhecida como ARC, e o único tratamento é a remoção cirúrgica [24]. Estudos anteriores mostraram que a senescência de LECs é a principal causa de ARC [25]. Até o momento, não houve agentes terapêuticos eficazes para inibir a turvação do cristalino e atenuar a senescência de LECs sem efeitos colaterais indesejáveis. O foco do presente estudo foi avaliar a base biológica molecular para a senescência de LECs e o mecanismo de proteção de LECs normais contra a senescência. Nossos resultados revelaram que a inativação da AMPK e o comprometimento da autofagia foram associados à senescência de LECs e ARC. Além disso, descobrimos que o MET pode proteger os LECs contra a senescência e inibir a turvação do cristalino, ativando a AMPK e aumentando a autofagia.

A senescência é um processo biológico fundamental acompanhado por um declínio geral na função do tecido. À medida que a expectativa de vida aumenta, as disfunções relacionadas à idade, como ARC, tornam-se graves para a saúde

questões [26]. A senescência de LECs foi relatada como envolvida na ocorrência e desenvolvimento de ARC [5]. Nossos resultados revelaram que os LECs dos camundongos naturalmente envelhecidos eram de forma plana e dispostos de forma desigual, e a densidade de LECs diminuiu acentuadamente (Fig. 1c, d). Além disso, a expressão de genes associados ao envelhecimento (p21 e p53) foi regulada positivamente nas LECs dos camundongos naturalmente envelhecidos (Fig. 1e, f, g). Nossos resultados implicaram que a senescência de LECs foi associada à ocorrência e desenvolvimento de ARC. Portanto, uma compreensão precisa dos mecanismos moleculares subjacentes à senescência de LECs pode ser necessária para fornecer uma justificativa para novas estratégias de tratamento.

O MET é o medicamento hipoglicemiante oral mais prescrito para diabetes tipo 2 em todo o mundo. Evidências emergentes indicam que o MET tem efeitos benéficos na saúde além daqueles associados à melhora da glicemia [27]. Foi confirmado que os mecanismos da MET são importantes para direcionar vias fundamentais no envelhecimento biológico, como ativar a AMPK, aumentar a autofagia, inibir a inflamação e exercer efeitos antioxidantes [28]. Em humanos, a TEM é utilizada na prática clínica há mais de 60 anos; tem um perfil de segurança elevado e está posicionado de forma única para intervir em várias vias cruciais responsáveis ​​pelo envelhecimento e doenças relacionadas com a idade. No entanto, os efeitos do MET no ARC e o mecanismo regulador desses efeitos nunca foram relatados. Consequentemente, em nosso estudo, a administração crônica de baixa dose de MET em camundongos naturalmente envelhecidos melhorou a transparência da lente (Fig. 2a) e atenuou a senescência de LECs in vivo (Fig. 2).

É amplamente reconhecido que o MET ativa a via AMPK, que é o mecanismo potencial do MET para exercer um efeito antienvelhecimento [29]. AMPK, um sensor de energia celular, desempenha um papel crucial na regulação do balanço energético celular [30]. Vários estudos têm demonstrado que a AMPK atua como integrador e mediador de diversas vias e processos que associam a energética à longevidade. Em nosso estudo, descobrimos que a inativação de AMPK era uma característica de LECs senescentes em camundongos naturalmente envelhecidos (Fig.3). Subsequentemente, MET demonstrou estimular a via AMPK para prevenir a senescência de LECs (Fig.3). Como um ativador de AMPK estabelecido, o papel do MET na prevenção do envelhecimento é geralmente atribuído aos seus efeitos na modulação das vias de sinalização a jusante, como restauração da autofagia, ativação de Sirt1 e Foxo1 e supressão de mTOR [31,32]. Nosso estudo forneceu uma nova linha de evidência enfatizando a importância da função AMPK ativada por MET na prevenção da ocorrência de ARC.

Como mencionado acima, a AMPK se comunica com inúmeras vias e proteínas para exercer um efeito anti-senescência, incluindo o aumento da autofagia. A autofagia, emergindo como um processo central para garantia de longevidade, atraiu amplo interesse como um potencial alvo terapêutico para doenças relacionadas à idade. A autofagia é um processo biológico complexo fluido e com várias etapas. O processo completo de autofagia é chamado de fluxo autofágico, que é amplamente utilizado para refletir o nível de autofagia. Como indicador de autofagia, LC3-Il está fortemente ligado à membrana autofagossômica que é degradada por enzimas lisossomais.extensão de vida de cistacheDa mesma forma, p62, um substrato específico da autofagia, geralmente é degradado no autofagolisossomo, e sua expressão reflete indiretamente o nível de autofagia. No presente estudo, nossos achados implicaram que o nível de autofagia diminuiu distintamente em LECs senescentes (Fig. 4), enquanto o MET reverteu o comprometimento da autofagia relacionado à idade (Fig. 4). O mecanismo molecular antienvelhecimento da MET é atribuído à função primária da AMPK nas células porque geralmente aumenta a autofagia através da ativação da AMPK [33]. Além disso, o MET é mostrado para aumentar a autofagia diretamente, contribuindo assim para a prevenção da senescência [34]. No entanto, estudos mais detalhados são necessários para elucidar os mecanismos subjacentes, provando que o MET aumenta a autofagia por meio de uma via AMPK independente ou dependente.

Foi demonstrado que a prevalência de ARC não foi associada ao sexo em populações de origem asiática [35, 36]. Portanto, não consideramos o sexo como um fator que pode afetar a ARC. Nosso estudo deve ser interpretado considerando as limitações mencionadas acima.

CONCLUSÃO

Em resumo, provamos que a inativação da via AMPK e o comprometimento da autofagia relacionado à idade podem contribuir para a senescência de LECs e a ocorrência de ARC. Além disso, os dados de nossos experimentos revelaram que o MET retardou efetivamente a senescência de LECs e a formação de ARC via ativação da via AMPK e aumento da autofagia. Nossos achados são uma linha básica para uma investigação mais aprofundada dos mecanismos moleculares que são úteis no papel do MET durante o processo de envelhecimento da ARC e serão informativos para estudos mais intensivos sobre o desenvolvimento de novas estratégias contra a ocorrência e desenvolvimento de ARC.

MATERIAIS E MÉTODOS Reagentes

MET foi adquirido da Bristol-Myers Squibb Company(China). Anticorpos contra p21 (ab188224), p53 (ab131442), AMPKa fosforilado(p-AMPK)(Thr172)(ab133448), AMPka1(ab32047), -actina (ab8226) e SQSTM1/p62 (3340-1) foram obtidos da Abcam (MA, EUA). Anticorpos contra LC3 (12741) e fosfo-acetil CoA carboxilase (p-ACC) (Ser79) (3661) foram adquiridos da Cell Signaling Technology ( MA, EUA).

Animais e tratamento

Camundongos machos C57BL6J com 3 e 8 meses de idade foram adquiridos de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Pequim, China). Os camundongos foram alojados em condições de temperatura controlada (temperatura, 20-25 graus e umidade relativa, 55±15 por cento) com um ciclo claro/escuro de 12 h, com livre acesso a comida e água. Todos os procedimentos e protocolos realizados em animais foram aprovados pelo comitê de ética da Harbin Medical University.

Os camundongos foram divididos nos três grupos a seguir: (i) grupo de controle com camundongos jovens (3 meses de idade, peso corporal=29,72± 1,66 g, n =40) receberam uma dieta de camundongo purificada padrão e água AD Libitum; Quando os camundongos tinham 10 mês de idade, 120 camundongos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: grupo naturalmente envelhecido e grupo MET. (i) grupo envelhecido naturalmente (camundongos mais velhos, 20 meses de idade, peso corporal=32,98±1,93g, n=60) recebeu uma dieta padrão de camundongo purificada e água ad libitum; (ii) grupo MET ( 20 meses de idade, peso corporal=31.21±2,81 g,n=60) foi mantido em uma dieta padrão de camundongo purificada e água até os camundongos atingirem 10 meses de idade; depois disso, os tratamentos foram iniciados. Os camundongos do grupo MET foram alimentados com uma dieta suplementada com 0,1 por cento de MET (Bristol Myers Squibb, China) e água livremente por 10 meses.

isolamento de lentes e cápsulas de lentes

Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical. O olho inteiro foi excisado imediatamente de todos os animais experimentais e colocado em solução salina estéril. O nervo óptico foi colocado para cima e fixado com pinça. Uma incisão foi então feita no nervo óptico que entra no olho, e a esclera foi puxada para trás para expor a lente.cistache nzPosteriormente, utilizamos pinças para retirar delicadamente os fragmentos do corpo ciliar fixados no plano equatorial do cristalino. Fotos da lente fresca foram tiradas imediatamente, e a lente foi rapidamente fixada com 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente. As cápsulas de lente inteiras foram rapidamente retiradas da lente restante, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a 80 graus C para experimentos subsequentes.

Hematoxilina e eosina (H&E)

A lente fresca foi imediatamente fixada com paraformaldeído a 4 por cento à temperatura ambiente e embebida em parafina. Para exame histológico, os tecidos foram cortados em fatias de 4-μm. Após a desparafinização e reidratação, as seções de parafina preparadas foram coradas com solução de hematoxilina (H) por 8 minutos, seguidas de 5 mergulhos em 1% de etanol ácido (1% de HCI em 70% de etanol)

e enxaguar com água destilada. Posteriormente, os cortes foram corados com solução de eosina (E) por 3 min, seguido de desidratação com álcool graduado e clareamento com xileno. As alterações morfológicas foram observadas ao microscópio (Nikon, Eclipse, Japão).

Ensaio da -galactosidase (SA- -Gal) associada à senescência A atividade da -galactosidase (SA- -Gal) associada à senescência foi medida usando um kit de coloração SA- -Gal (Sigma, CS{ {12}}030). De acordo com as instruções do fabricante, as seções de tecido, após uma série de tratamentos, foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 5 min (três vezes) e depois incubadas em solução de coloração SA{10}}gal (pH 6,0) a 37 graus sem CO2 por 24 h. As imagens foram capturadas em microscópio de luz (Nikon, Eclipse, Japão). A porcentagem de células positivas para SA- -gal foi estimada como o número médio de células positivas/o número médio de células totais.

Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (gRT-PCR) O RNA total das cápsulas do cristalino de camundongos foi extraído usando o reagente TRlzol. A transcrição reversa foi realizada com o ExScript RT Reagent Kit (Invitrogen). A análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) foi realizada usando um SYBR Green Supermix

kit (Takara, Tóquio, Japão), com -actina como controle endógeno. As transcrições foram investigadas para vários genes-alvo, incluindo FAS (forward, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'e reverse,5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (forward,5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} e reverso, 5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') e -actina (para frente, 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3' e reverso,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. O relativo os níveis de cada expressão gênica foram

método. normalizado para -actina e calculado usando a coloração 2-△△ct r Imuno-histoquímica (IHC) Um total de 5 seções representativas de cada uma das 10 lentes selecionadas por grupo foram usadas para análise imuno-histoquímica (IHC) para avaliar a expressão de p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 e p62. Depois que as amostras preparadas foram incubadas a 6{17}} graus por 2 h, elas foram passadas por séries de xileno e álcool graduado para desparafinização. Posteriormente, as amostras foram fervidas em 0,1 M de ácido cítrico (pH 6,1) por 30 min e resfriadas à temperatura ambiente. Após três lavagens com PBS, as amostras foram embebidas em 0,3% HO, para inibir a atividade da peroxidase endógena. Subsequentemente, os anticorpos primários foram adicionados e resfriados a 4 graus C, durante a noite. Os anticorpos secundários correspondentes foram incubados por 1 h a 37 graus C. Após a lavagem com PBS, as amostras foram incubadas em diaminobenzidina (DAB) até que a intensidade de coloração desejada se desenvolvesse. As imagens das células imunocoradas foram capturadas usando o microscópio Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, Japão).

Análise de Western Blot

A proteína total de cápsulas de lentes de camundongos foi extraída usando tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) com coquetel de inibidores de protease (Pierce, EUA), e um kit de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Fisher Scientific, EUA) foi usado para quantificar a concentração de proteína . A proteína total (40 ug) foi analisada usando eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e transferida eletroforeticamente para membranas de filtro de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Alemanha). As membranas foram incubadas durante a noite com um anticorpo primário a 4 graus C. No dia seguinte, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários correspondentes por 1 h a 37 graus C. As bandas imunorreativas foram visualizadas usando o método de substrato quimioluminescente com um Super Signal West Pico (Pierce Biotechnology, EUA). Três experimentos independentes foram realizados.

Análise estatística

Os dados foram expressos como média±desvio padrão (DP). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 7.0 e Microsoft Excel. A proteína foi quantificada usando o software Image J. O teste t de Student e a análise de variância (ANOVA) foram utilizados para calcular a significância estatística dos dados experimentais. Diferenças com um valor P<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

DISPONIBILIDADE DE DADOS

Os conjuntos de dados usados ​​e analisados ​​durante o estudo atual estão incluídos neste artigo publicado.

Este artigo foi extraído de www.nature.com/cddiscovery