Meta-análise de resultados de quantificação de NAD(P)(H) exibe variabilidade entre tecidos de mamíferos
Jun 01, 2023
Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NAD plus) desempenha um papel importante no metabolismo energético e nas vias de sinalização que controlam funções celulares cruciais. Oaumento do interesse em NAD mais metabolismoeTerapias de reforço de NAD plusreforçou a necessidade de quantificação precisa de NAD plus. Para examinar as medidas de NAD(P)(H) publicadas em tecidos de mamíferos, realizamos ummeta-análise dos dados existentes. Uma pesquisa no banco de dados Ovid MEDLINE identificou artigos com resultados de quantificação de NAD(P)(H) obtidos de tecidos de mamíferos publicados entre 1961 e 2021. Examinamos 4890 registros e extraímos dados quantitativos, bem como osmétodos de quantificação, condições pré-analíticas e características do sujeito. As concentrações fisiológicas extraídas de NAD(P)(H) emvários tecidosde camundongos, ratos e humanos, revelou uma importante variabilidade entre e intramétodos que se estendeu a publicações recentes. Isso destaca o potencial relativamente baixo para análises experimentais cruzadas para dados quantitativos de NAD(P)(H) e a importância da padronização para métodos de quantificação de NAD(P)(H) eprocedimentos pré-analíticospara futuros estudos pré-clínicos eestudos clínicos.
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O dinucleótido de nicotinamida adenina desempenha um papel duplo como umredução-oxidação (redox)coenzima, em sua forma oxidada (NAD(P) plus ) eformas reduzidas de (NAD(P)H), e como umco-substrato (NAD(P) mais) para enzimas envolvidas na desacilação1, mono e poli-ADP-ribosilação2,3 e a criação de segundos mensageiros baseados em adenina4–7. A relação NAD(P) mais /NAD(P)H é um importante indicador do estado redox intracelular e desempenha um papel crítico na regulação das principais vias metabólicas8,9. Por exemplo, o NAD plus é essencial para a glicólise, juntamente com o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), para fornecer equivalentes redutores durante a geração de trifosfato de adenosina (ATP), principal fonte de energia da célula8,9. Quando o NAD plus é limitado, ele também pode ser regenerado a partir do NADH pela fermentação do piruvato para produzir lactato nas células dos mamíferos, mantendo assim o equilíbrio redox celular25. NAD plus e NADH também podem ser fosforilados a NADP e NADPH, respectivamente, por NAD plus Kinases (NADKs)10,11. O NADPH é essencial para a biossíntese redutora, transdução de sinal, respostas antioxidantes celulares e, particularmente, redução de glutationa12–14. No citosol, o NADP plus é reduzido a NADPH pela glicose-6-fosfato desidrogenase e 6-fosfogluconato desidrogenase da via das pentoses fosfato (PPP), entre outras reações13. Enquanto na mitocôndria, a produção de NADPH é mantida por várias reações, incluindo aquelas dependentes da atividade enzimática nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (NNT) e isocitrato desidrogenases (IDH2)15. Como resultado, o status de NAD(P)(H) demonstrou afetar a sinalização celular e o metabolismo, a homeostase energética, a biogênese mitocondrial, as respostas ao estresse oxidativo e a manutenção e reparo do DNA16–18. Além disso, uma vez que a progressão de doenças relacionadas à idade, como obesidade19, doença hepática gordurosa não alcoólica20,21, neurodegeneração22, doenças mitocondriais23 e cardiovasculares24 e atrofia ou distrofia muscular25, tem sido associada a alterações nos metabólitos relacionados ao NAD plus, abordagens destinados a manter o NAD mais a homeostase estão atualmente sob investigação.
Além das transições redox comuns, o NADP plus pode ser consumido pela troca de seu grupo nicotinamida com ácido nicotínico em uma reação catalisada por cADPR sintases, como CD38, para formar o segundo mensageiro NAADP, que está envolvido na mobilização de cálcio, secreção hormonal e células imunes proliferação6,7,26. O NAD plus também pode ser consumido ao atuar como co-substrato para formar a nicotinamida (NAM), que pode ser usada como substrato para regenerar o NAD plus por meio da via de recuperação do NAM. NAM também pode ser metilado para formar 1-metil NAM (meNAM), que pode ser ainda mais oxidado para os produtos de degradação N1-metil-2-piridona-5-carboxamida (2py) e N1-metil-4-piridona-3-carboxamida (4py). Por fim, os catabólitos metilados podem ser eliminados do corpo pela urina27,28. O pool de NAD plus também pode ser reduzido pelo consumo de NADP plus por meio de uma reação de troca de bases para a formação do segundo mensageiro NAADP14. Manter o pool de NAD plus, portanto, requer a biossíntese através da via Preiss-Handler (começando com a niacina (NA; ácido nicotínico) comum da molécula de vitamina B3), a via de biossíntese de novo (começando com o aminoácido triptofano (Trp)) ou regeneração da conversão de NAM através da via de salvamento para NMN e depois para NAD plus. Finalmente, a via de resgate também é importante para a biossíntese de NAD plus a partir do ribosídeo de nicotinamida (NR), uma forma alternativa de vitamina B3 encontrada nos alimentos, seguindo sua fosforilação pela quinase de ribosídeo de nicotinamida em NMN e, em seguida, conversão em NAD plus pela via de resgate .
Portanto, entender a dinâmica do NAD mais metaboloma tornou-se essencial e, em última análise, requer uma quantificação rigorosa de metabólitos para entender melhor o fluxo de NAD mais metabólitos durante a fisiologia normal, ou com progressão da doença ou envelhecimento saudável. Uma imagem clara dessas mudanças é essencial para vincular as alterações no NAD mais o metaboloma às reações enzimáticas ou redox a jusante, que são a chave para as mudanças nos fenótipos dos tecidos. Dada a quantidade substancial de dados quantitativos relatados anteriormente sobre NAD mais metabólitos em mamíferos, incluindo um número crescente de relatórios em humanos, é essencial e oportuno resumir essas mudanças durante a saúde e a doença. Numerosos estudos examinaram os componentes do NAD mais o metaboloma em roedores e humanos em diferentes estados metabólicos, idades e doenças, mas dependem de diferentes métodos para preparação ou quantificação de amostras. A preparação da amostra é importante para metabólitos envolvidos em reações redox devido ao potencial de degradação e interconversões sob certas condições29,30. Para a quantificação, acredita-se que a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC–MS) e a espectrometria de ressonância magnética (MRS) sejam métodos sensíveis e específicos31–33, enquanto os ensaios de ciclagem enzimática são os mais comuns. Os métodos quantitativos de LC–MS requerem uma inclusão abrangente de controles de qualidade para metabólitos individuais sendo medidos e para o efeito de matriz geral das amostras, um efeito que explica as respostas variadas de espectrometria de massa para um determinado analito quando medido em diferentes soluções. Sem esses controles, LC-MS é, na melhor das hipóteses, semiquantitativo. Neste estudo, identificamos uma variabilidade considerável nas medidas de NAD(P)(H) em estudos com roedores e humanos, enfatizando a necessidade de métodos adequados de relatório e processamento padronizado de amostras e protocolos analíticos. No geral, conjuntos de dados NAD(P)(H) comparáveis entre os estudos são necessários para uma interpretação significativa dos dados existentes e futuros no campo de NAD mais biologia.
Resultados
Meta‑análise de métodos comuns de quantificação, juntamente com espécies, sexo e tecidos estudados.
Historicamente, os primeiros métodos usados para a quantificação de NAD(P)(H) dependiam das propriedades espectrofotométricas ou fluorométricas desses metabólitos34,35. Mais recentemente, os métodos de ciclagem enzimática acoplados à detecção espectrofotométrica ou fluorométrica são mais comumente usados para distinguir os níveis de coenzima NAD(P)(H)36–38. A crescente necessidade de alta sensibilidade e resolução na quantificação dessas coenzimas, juntamente com a necessidade de medir outros metabólitos relacionados ao NAD plus, levou ao uso de técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e LC-MS. Dessas abordagens, LC-MS tornou-se o método preferido, pois a espectrometria de massa combinada com a cromatografia líquida permite a identificação específica de compostos eluídos, juntamente com o benefício adicional de incluir metabólitos de isótopos NAD(P)(H) como pico interno de qualidade controles. Apesar de suas vantagens em relação aos ensaios espectrofotométricos ou fluorométricos clássicos, HPLC e LC-MS permanecem caros e demorados, o que explica por que os ensaios de ciclagem enzimática persistem em estudos recentes.
Usando uma abordagem sistemática, dos 241 estudos elegíveis (Material Suplementar 2), 205 estudos que incluíram uma meta-análise quantitativa das concentrações de NAD(P)(H) em camundongos, ratos e tecidos humanos foram selecionados para análise posterior. Desses estudos, 46,7 por cento usaram ensaios de ciclagem enzimática, dos quais incluíram detecção colorimétrica (40,9 por cento) ou fluorométrica (5,8 por cento), enquanto 17,8 por cento usaram métodos de HPLC (juntamente com detectores de UV ou fluorescência) e 13,2 por cento usaram ensaios de LC-MS ( Fig. 1a). A maioria dos estudos não incluiu uma descrição detalhada dos procedimentos de extração do metabólito. No entanto, os procedimentos de extração comumente usados consistiam em tampões de extração com ou sem surfactantes (Triton®, Tris, brometo de Dodecil trimetil amônio) ou solventes orgânicos polares, como acetonitrila, metanol, etanol ou clorofórmio. Estudos anteriores mostraram que a inativação enzimática e condições ótimas de pH e temperatura foram eficientes em preservar a estabilidade das diferentes formas de NAD(P)(H)30,39,40. Quando divulgado, as amostras foram processadas em condições de baixa temperatura e nenhum aditivo redox foi mencionado nos estudos incluídos. As reações redox foram limitadas pela inativação das enzimas nas amostras antes das medições dos metabólitos NAD(P)(H), geralmente por precipitação com solventes como etanol, metanol, acetonitrila ou ácido perclórico (PCA). No entanto, o uso de PCA era raro devido à natureza ácido-lábil das formas reduzidas (isto é, NADH e NADPH), bem como à necessidade de uma etapa adicional de neutralização. Assim, entre os estudos que relatam o uso de PCA durante a extração do metabólito (5,4 por cento), 3,7 por cento relataram apenas resultados de NAD(P) plus ou usaram um segundo método de extração não ácido para quantificação adequada de NAD(P)H. Apenas 1,7% dos estudos relataram resultados de NADH, NAD(H) total e/ou NAD mais /NADH usando apenas a extração de PCA. O viés potencial desses estudos não pôde ser analisado devido aos dados limitados.
Comparações dos níveis fisiológicos médios de NAD(P)(H) em tecidos para roedores e humanos.
Para ajudar a identificar os níveis fisiológicos médios esperados de NAD(P)(H) para os tecidos de camundongos, ratos e humanos mais comumente estudados, compilamos dados de todas as coortes de controle e de tipo selvagem de cada um dos estudos incluídos (Material Suplementar 2 ). Especificamente, registramos os níveis médios de NAD(P)(H) normalizados para o peso do tecido ou, no caso do sangue, o volume. Os dados de estudos que normalizaram os níveis de metabólitos para o conteúdo de proteína foram incluídos em nosso conjunto de dados compilado (Material Suplementar 2), mas não foram usados para análise posterior devido ao baixo número de resultados relatados. Além disso, quando possível, calculamos as razões NAD(P) mais /NAD(P)H, como um reflexo do estado redox, bem como os níveis totais de NAD(P)(H) (NAD(P) mais mais NAD (P)(H)), que são saídas de relatórios comuns para correções de NAD(P)(H). Os dados extraídos também incluíram as espécies, linhagens, idade, sexo, método de quantificação, dieta e horário de alimentação, tipo de amostra, método de coleta de amostra e tempo de colheita (pré ou post mortem).
A metanálise dos dados de NAD(H) identificou as concentrações fisiológicas médias para NAD plus e NADH em tecidos de camundongo (Fig. 2a,b, Fig. Complementar 1a,b) e rato (Fig. 2a,b), de animais menores de 14 meses para camundongos e 18 meses para ratos. A faixa extraída de valores fisiológicos de razão NAD mais /NADH e níveis totais de NAD(H) (NAD mais mais NADH) foram plotados para camundongos (Fig. 2c,d) e ratos (Fig. 2c,d suplementar). Ao contrário dos estudos com camundongos, a maioria dos dados relatados em ratos não incluía a idade dos animais; no entanto, optamos por incluir esses dados desde que o estudo não classificasse suas coortes como idosas. Dos tecidos mais proeminentemente estudados, esta meta-análise mostra que o nível médio de NAD mais para o fígado (596 nmol/g, n=26) é maior do que todos os outros tecidos em camundongos, enquanto surpreendentemente o músculo esquelético (162,8 nmol /g, n=9) apresenta um dos valores medianos mais baixos por grama de tecido (Fig. 2a). Esses resultados podem implicar uma eficiência reduzida na extração de NAD mais metabólitos, devido à natureza altamente fibrosa do músculo ou que existem diferenças importantes no metabolismo de NAD mais metabólito quando comparado a outros tecidos altamente metabólicos, como fígado e rim.
Apesar de poucos estudos quantitativos de envelhecimento, os níveis de NAD plus de camundongos idosos foram, em média, reduzidos no fígado, músculo e epitélio pigmentado da retina (RPE), quando comparados com seus coortes jovens e em comparação com a média de todos os estudos realizados com camundongos mais jovens de 14 meses de idade (Suplemento Fig. 3). Uma meta-análise de NADH e a relação NAD mais /NADH em animais idosos não foi possível, pois apenas um desses estudos quantitativos realizou essas medições.
Esses dados demonstram a falta de dados quantitativos de NAD(H) em animais idosos.
Para os dados recuperados de estudos com seres humanos saudáveis, as faixas etárias variaram muito entre os estudos (de 15 a 92,3 anos) e, na maioria dos casos, os dados não foram estratificados nessas idades. Os tecidos humanos mais comumente medidos incluíam músculo esquelético e componentes do sangue, devido à sua natureza menos invasiva de coleta (Fig. 3a-d). Os resultados de outros tecidos humanos (n= 1–2) são exibidos na Fig. 4 complementar. Esta análise exibiu uma concentração mediana de NAD mais de 44,62 nmol/ml (n=23) em sangue total, com NAD mais concentrações relatadas para glóbulos vermelhos em 46,96 nmol/ml (n=7) (Fig. 3a; Tabela suplementar 1). No entanto, os níveis de NAD plus no plasma sanguíneo foram substancialmente mais baixos com uma mediana de 0,37 nmol/ml (n=8) (Fig. 3a). A mediana dos níveis de NAD mais encontrados no músculo esquelético de humanos foi de 191,9 (n=4) nmol/g em preparações musculares úmidas versus 1713 (n=3) nmol/g em preparações liofilizadas, uma temperatura baixa processo de desidratação que provavelmente concentra metabólitos (Fig. 3a). Nos tecidos mais comumente investigados para medições de NADH, os níveis médios em glóbulos vermelhos humanos, plasma e músculo esquelético liofilizado foram de 1,75 nmol/ml (n =7), 0,39 nmol/ml (n=8) e 136,8 nmol/g (n=6), respectivamente (Fig. 3b). As proporções medianas correspondentes de NAD mais /NADH foram 23,65 (n=8), 1,57 (n=7) e 12,7 (n=3) (Fig. 3c). Curiosamente, a proporção mediana de NAD mais /NADH para glóbulos vermelhos (23,65) e músculo esquelético liofilizado (12,7) (Fig. 3c) foi várias vezes maior do que a maioria dos tecidos de camundongos e ratos (Fig. 2c e Suplementar Fig. 2c) , indicando um estado redox altamente oxidativo com abundância de NAD plus disponível nesses tecidos humanos. No caso do tecido muscular, isso pode ter implicações ao considerar o potencial translacional de estudos com roedores que identificaram os benefícios de aumentar os níveis de NAD plus no músculo. No entanto, uma proporção elevada de NAD mais /NADH no músculo também pode ser o resultado de procedimentos de congelamento de amostra atrasados em um ambiente clínico, o que pode levar a alterações não fisiológicas no status redox da amostra.
Os níveis fisiológicos de NADP(H) em tecidos de roedores foram compilados, sendo a medição mais comum no fígado. O fígado de camundongo exibiu um valor médio de 124,2 nmol/g de NADP mais (n=13) e 140,2 nmol/g de NADPH (n=4) (Fig. 4a,b ), enquanto o fígado de rato mostrou uma mediana de 95,11 nmol/g de NADP plus (n=10) e 240,7 nmol/g de NADPH (n=9) (Fig. Complementar 5a,b). A mediana da relação NADP mais /NADPH, derivada de estudos que mediram ambos os metabólitos, foi inferior a 1 na maioria dos tecidos de camundongos e ratos (Fig. 4c, Fig. 5c suplementar). Os níveis médios totais de NADP(H) (NADP mais NADPH) no fígado de camundongos e ratos foram 244,4 (n=3) (Fig. 4d) e 342,1 (n=9) (Fig. 5d suplementar) , respectivamente. Em humanos, as medidas mais comuns de NADP(H) foram realizadas em glóbulos vermelhos mostrando uma mediana de 33,2 nmol/ml para NADP plus (n=14) e 22,4 nmol/ml para NADPH (n{{30} }) de estudos não correspondentes, com uma razão mediana de NADP mais /NADPH de 1,27 e uma mediana de NADP(H) total de 52,0 nmol/ml de estudos que mediram ambos os metabólitos (n=11) (Fig. 4e– h). No geral, a quantidade de dados disponíveis para NADP(H) é escassa em todas as espécies, levando a uma menor confiança nos valores médios de cada tecido.
Análise de viés e variabilidade em métodos de quantificação de NAD(P)(H).
Dado que a maioria dos estudos incluídos nesta meta-análise examinou os níveis de NAD plus em amostras de fígado de roedores (Fig. 1c,e), usamos os níveis fisiológicos de NAD plus de fígado de camundongo e rato para identificar qualquer viés potencial nos resultados que correspondem ao método de quantificação (Fig. 5a,b). A idade média dos camundongos incluídos nesta análise foi de 17,9 semanas (Intervalo: 2–55 semanas), com 6 estudos não divulgando a idade dos animais. Para ratos, a maioria dos estudos não divulgou a idade dos animais, exceto três que variaram de 2 dias a 8 meses. Nenhum dos estudos relatou o uso de animais velhos. No fígado de camundongos, a grande variedade de concentrações relatadas para NAD plus estendeu-se de 1,8 a 1132 nmol/g do fígado com um valor médio de 596.0 (n=26) (Fig. 5a) , enquanto as concentrações de NADH variaram de 0,9 a 109 nmol/g de tecido com um valor médio de 66,43 (n=6) (Fig. 6a complementar). É importante ressaltar que um coeficiente de variação de 52,5 por cento e 76,5 por cento foi calculado para os resultados fisiológicos médios de NAD plus e NADH no fígado de camundongo, respectivamente, medidos por métodos de quantificação múltipla, mostrando a extensão da variabilidade entre os estudos. Conforme previsto a partir desses resultados, a proporção média de NAD mais /NADH no fígado de camundongo (3,41 mais /- 3,16 SD, n=19) demonstrou uma faixa igualmente grande de variabilidade com um CV de 92,7 por cento (Fig. complementar. 6c) . Variabilidade semelhante nas medidas de NAD plus e NADH também foram observadas no fígado de rato (CV=42,6 por cento para NAD plus e CV=44,4 por cento para NADH). As concentrações correspondentes para NAD plus e NADH no fígado de rato variaram de 159 a 796 (n=16) e 65 a 265 (n=12) nmol/g, respectivamente (Fig. 5b, Fig. Complementar. 6b ), enquanto as razões NAD mais /NADH exibiram um CV de 50,1 por cento (Média: 3,219 mais /− 1,612 SD, n=23) (Fig. 6d complementar). Os valores médios e desvios padrão para NAD plus , NADH, NAD(H) total e os dados da razão NAD plus /NADH no fígado de camundongos e ratos, agrupados por método de quantificação, são mostrados na Tabela Suplementar 2. Com relação aos níveis de NADP(H) e Na relação NADP plus/NADPH, observou-se variabilidade semelhante nos tecidos hepáticos. Os níveis de NADP plus variaram de 50.4 a 247,4 nmol/g de tecido para camundongos (Fig. 8a complementar) e de 45,7 a 171 nmol/g de tecido para ratos (Fig. 8b complementar), enquanto os níveis de NADPH variou de 28 a 236,9 nmol/g de tecido para camundongos (Fig. Complementar 8c) e de 90 a 409 nmol/g de tecido para ratos (Fig. Complementar 8d). Por fim, a razão NADP mais/NADPH variou de 0,12 a 0,55 no fígado de camundongo (Fig. 8e complementar) e de 0,12 a 1,44 no fígado de rato (Fig. 8f complementar).
na maior faixa de resultados (1,8 a 1132,3 nmol/g). Mesmo os estudos de LC-MS mais recentes examinados exemplificaram a faixa desses valores de NAD plus, incluindo valores de 1,8 nmol/g41 e 33,8 nmol/g42 e valores muito mais altos de 946,3 nmol/g43 e 1132,3 nmol/g44. Além disso, a grande variedade de valores de LC-MS NAD plus não parecia correlacionar-se com estudos que excluíam padrões internos marcados com isótopos (Fig. 5a), um método usado para melhorar a identificação do metabólito e a precisão do valor quantificado . No entanto, os dois estudos de LC-MS identificados que se basearam apenas em uma curva padrão externa para NAD mais quantificação, em vez de incluir um controle interno, foram em média inferiores à média para todas as medidas (Fig. 5a). Além disso, os estudos usando normalização de padrão interno usaram diferentes tipos de padrões internos, como a inclusão de um único metabólito de referência marcado45,46 ou extratos de metabólitos marcados de levedura43,44 ou culturas de células41. Curiosamente, esses estudos que usaram padrões derivados de extrato de cultura de células ou leveduras forneceram as medidas derivadas de LC-MS mais altas ou mais baixas para os níveis de NAD plus no fígado. Isso potencialmente enfatiza como os extratos celulares de padrões ricos em isótopos podem contribuir para a variabilidade nas medições de NAD plus, pois o efeito de matriz da levedura padrão adicionada ou extrato celular pode interferir na eficiência da ionização e, consequentemente, nas concentrações medidas dos metabólitos alvo.
As limitações desta análise de viés de quantificação e variabilidade incluem possíveis diferenças no ambiente, antecedentes genéticos, sacrifício, sexo e idade. Todos os dados para esta análise vieram de animais em dieta alimentar, mas podem diferir quanto ao tipo. Após o sacrifício, há diferenças relatadas no estado alimentado ou em jejum do animal e na hora do dia para o sacrifício. Além disso, embora a maioria dos estudos com camundongos tenha sido realizada em um fundo C57BL/6, houve uma gama maior de fundos usados para ratos em todos os estudos (Wistar: 38 por cento, Albino Wistar: 25 por cento e 6 por cento para Hooded Wistar, Sprague-Dawley, ratos Holtzman, ACI, Long-Evans e Zucker). Nos estudos de fígado de camundongos, não houve diferenças estatísticas entre os valores masculinos ou femininos para os níveis de NAD plus, NADH ou NAD(H) total ou para a relação NAD plus /NADH (Fig. 7 complementar). No entanto, não podemos tirar conclusões devido ao número limitado de coortes femininas.
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