A melatonina impede a infiltração de linfócitos T nos rins de ratos hipertensos, induzida por uma dieta rica em sal, impedindo a expressão de quimiocinas ligante CXCR3
Mar 14, 2022
Para mais informações:ali.ma@wecistanche.com
Ariel Bier1, Rawan Khashab2, Yehonatan Sharabi1,2,3, Ehud Grossman1,2,3e Avshalom Leibowitz1,2,3,*
1Medicina D, Centro Médico Chaim Sheba, Tel-Hashomer 5262000, Israel; arielbier@gmail.com (AB);Yehonatan.Sharabi@sheba.health.gov.il (YS); Ehud.Grossman@sheba.health.gov.il (EG)2 Hypertension Unit, the Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel;rawankhasbab@gmail.com3Faculdade de Medicina Sackler, Universidade de Tel-Aviv, Tel-Aviv 6997801, Israel*
Resumo: Em um estudo anterior, demonstramos quemelatoninaimpederimdano em um modelo de hipertensão induzida por sal, diminuindo o estresse oxidativo. Nossa hipótese é que esse efeito envolve as propriedades imunomoduladoras da melatonina. Ratos sensíveis ao sal (DSS) do Estudo Dahl in vivo foram alimentados com ração normal, uma dieta rica em sal (HSD) ou um HSD emelatonina(30 mg/kg/dia) em sua água durante oito semanas.Rinsforam colhidos para isolamento imediato de linfócitos e caracterização por citometria de fluxo (CD3 mais CD4 mais e CD3 mais CD8 mais) e para quimioatraente de linfócitos (principalmente CXCLquimiocinas) estudos de expressão gênica. Estudo in vitro-rato, células mesangiais (RMC) foram cultivadas em meio com alto teor de sal sem e commelatonina. Um HSD foi associado com infiltração renal significativa de linfócitos T CD4 plus e CD8 plus em comparação com o controle. A melatonina reduziu significativamente a infiltração de linfócitos renais. Um HSD aumentou significativamente a expressão de mRNA de CXCLquimiocinas.Adicionar melatonina ao HSD aboliu este efeito. O tratamento das células RMC com sal aumentou a expressão de CXCL10 e CXCL11, mas não de CXCL9. Adicionandomelatoninaaos meios de cultura impediram esse aumento. O tratamento de ratos alimentados com HSD com melatonina diminuiu a expressão de mRNA do quimioatrativo de linfócitos renais e está associado à redução significativa da infiltração de linfócitos T renais. O sal pode ter um efeito direto nas células renais produtoras de quimiocinas, que é atenuada pelo tratamento com melatonina.
Palavras-chave:melatonina; sal; linfócitos T; hipertensão;rim; CXCL 9; CXCL 10; CXCL 11
1. Introdução
A hipertensão arterial (HA) é o principal fator de risco cardiovascular modificável. Devido ao envelhecimento da população, a prevalência de hipertensão está aumentando constantemente, atingindo até 30 por cento em idades avançadas [1]. Apesar das várias opções terapêuticas médicas, o controle mundial da HAS é precário. As consequências da HAS não controlada são devastadoras, gerando um enorme impacto negativo na saúde pública [2].
Vários fatores comportamentais, ambientais e genéticos estão envolvidos na patogênese da hipertensão. O alto teor de sal nas dietas ocidentais tem sido apontado como um dos principais contribuintes para a hipertensão e está associado ao aumento da morbidade e mortalidade. Diretrizes e iniciativas publicitárias recomendam a redução do consumo de sal para a população em geral. No entanto, nem todos os indivíduos podem se beneficiar dessa restrição, pois a fisiopatologia que conecta a sensibilidade ao sal à hipertensão não é totalmente compreendida e precisa de melhor compreensão mecanística [3]. Assim, novas estratégias são cruciais para melhor compreensão e controle da HAS, tornando a necessidade de novos paradigmas de pesquisa.
A inflamação e o estresse oxidativo estão envolvidos na patogênese da hipertensão essencial. Ao pesquisar os gatilhos que iniciam e continuam esses processos, muitos modelos experimentais de HTN sugerem o envolvimento da resposta imune adaptativa [4].
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As pistas que ligam a imunidade adaptativa à HAS já existiam desde a década de 1960. Entretanto, só recentemente, com uma melhor compreensão do sistema imunológico, avanços podem ser alcançados nessa direção. Um estudo pioneiro de Guzik et al. demonstraram que a hipertensão do sal de angiotensina (Ang) II ou de deoxicorticosterona (DOC) estava embotada em camundongos rag1−/−, que são deficientes em linfócitos T e B, e a transferência adotiva de T, mas não de células B, poderia restaurar a resposta da PA [5]. Desde este artigo, vários componentes da imunidade adotiva foram considerados relevantes para a patogênese da hipertensão na maioria dos modelos animais comuns. O papel das células T no modelo HTN induzido por sal também tem sido extensivamente estudado. Estudos in vitro mostram que o sal pode empurrar a diferenciação de células T virgens em células TH17 [6]. Numerosos trabalhos in vivo nos modelos de hipertensão induzida por dieta rica em sal (HSD), como em ratos Dhal sensíveis ao sal (DSS), mostram extensa infiltração de células T renais [7-9].
Entre os muitos processos fisiológicos,de melatoninao envolvimento com a regulação da pressão arterial é um tanto intuitivo. O padrão circadiano da pressão arterial encorajou extensa pesquisa sobre melatonina e hipertensão. Muitos trabalhos no passado, em humanos e em modelos experimentais, relacionaram baixos níveis de melatonina à hipertensão [10]. Existem alguns dados clínicos sugerindo que a suplementação de melatonina pode tratar a hipertensão, principalmente para pacientes com hipertensão noturna [11]. A inconsistência desses dados, no entanto, levanta questões sobre se as propriedades não circadianas da melatonina também estão envolvidas na regulação da pressão arterial.
As propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes da melatonina sugeriram que a melatonina interage com o sistema imunológico. Dados emergentes têm implicado o papel da sinalização da melatonina no desenvolvimento, ativação, diferenciação e memória das células T. Há evidências de quemelatoninamembrana e receptores nucleares estão presentes em células T [12,13].Melatoninaafeta a produção de muitas citocinas envolvidas na resposta imune, como o interferon (IFN) – que é um regulador pivô da resposta Th1 [14].
O estresse oxidativo e a resposta das células T, de acordo com alguns pesquisadores, trabalham em conjunto promovendo o desenvolvimento de hipertensão e lesão hipertensiva do órgão [15]. Em nosso trabalho anterior, demonstramos quemelatoninadiminui o estresse oxidativo local (renal) e previne fibrose renal induzida por sal e proteinúria em um modelo de rato hipertenso sensível ao sal (o modelo DSS) [16]. Uma vez que o estresse oxidativo tem um papel fundamental na resposta imune adaptativa associada à HTN, nós hipotetizamos que as propriedades imunomoduladoras da melatonina são responsáveis por seu papel protetor na HTN induzida por HSD.
O objetivo deste estudo é avaliar semelatoninadiminui a resposta de células T induzida por sal e elucidar os mecanismos responsáveis por esse efeito.
2. Materiais e métodos
2.1. Animais e Protocolo de Estudo
O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética animal institucional do centro médico Sheba em Israel. Seu estado de saúde foi monitorado medindo o peso corporal e uma observação geral diária do movimento e das condições de saúde de cada animal. alojados em uma instalação de animais em gaiolas regulares (dois ratos por gaiola) a 22 ◦C com um ciclo de 14 horas de luz/10 horas de escuridão. Os ratos foram mantidos em uma dieta normal de sal e receberam água da torneira para beber ad libitum por um período de aclimatação de cinco dias. Os ratos foram então divididos em três grupos (n=8), de acordo com a dieta, durante um período de 8 semanas. De acordo com o comitê de ética, os animais que apresentassem sinais de doença e sofrimento deveriam ser sacrificados.
O grupo controle foi alimentado com uma dieta padrão para ratos (2018 SC; Teklad Envigo, Madison, WI, EUA) e água da torneira; o grupo da dieta rica em sal (HSD) foi alimentado com uma dieta rica em sal (4 por cento ) (TD.120485; Teklad Envigo, Madison, WI, EUA) e água da torneira, e omelatoninagrupo foi alimentado com a mesma dieta de sal enriquecido (4 por cento) com melatonina (M5250; Sigma, Rehovot, Israel) (30 mg/kg/dia) em sua água potável. O peso corporal e o consumo de água foram aferidos periodicamente. A quantidade correta de melatonina foi dissolvida nas necessidades de água de cada gaiola para fornecer a dose correta para cada animal. O dia zero é definido como o dia de início do consumo de HSD e melatonina. Ao final do estudo, os ratos foram sacrificados por anestesia profunda com 3% de isoflurano (profundidade da anestesia confirmada por compressão da pata traseira) e arinsforam colhidos. Ambos os rins foram removidos e hemiseccionados. Os rins foram retirados para análise por citometria de fluxo, exceto por várias porções que foram rapidamente removidas e congeladas em N2 líquido e armazenadas a -80 ◦C. Tecidos congelados foram usados para extração de RNA.
Sintomas da doença renal de Cistanche
2.2. PCR de transcrição reversa quantitativa em tempo real
Os níveis de expressão de mRNA dos genes foram verificados norimtecido por transcriptase reversa quantitativa em tempo real-PCR (qRT-PCR). O RNA total foi extraído do tecido renal usando um kit de RNA NucleoSpin (MACHERY-NAGEL, Düren, Alemanha). A transcrição reversa foi realizada usando um kit de transcrição reversa de cDNAR de alta capacidade da Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As reações qRT-PCR foram realizadas usando o Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) e o sistema Applied Biosystems 7500 PCR em tempo real. As condições de ciclagem foram: uma primeira etapa única de 95 ◦C por 0.20 min e depois 40 ciclos de estágio de fusão por 3 s a 95 ◦C e uma etapa estendida de 30 s a 60 ◦C. Ao final dos 40 ciclos, foi realizada uma etapa de curva de fusão. O mRNA da subunidade lateral do caule da proteína ribossomal P0 (Rplp0) foi usado como controle interno. Os primers estão listados na Tabela 1.
Tabela 1. Lista de primers de ratos usados neste estudo.
2.3. Isolamento de células T dos rins
Após a remoção da cápsula renal, os doisrinsforam picados e provocados com o êmbolo de uma seringa de 2 mL através de um filtro de células de 100 µm em RPMI 1640 contendo 2 mL de glutamina, 10 por cento de FBS, 10 ug/mL de DNase 1 (Stem Cells technologies, Cambridge, MA , EUA) e 0,1 por cento de colagenase tipo IV (CLS 4, Worthington Decatur, AL, EUA). A solução foi incubada por 25 min a 37 ◦C. A solução de lavagem (DPBS/2 por cento FBS/2 mM EDTA) foi então adicionada ao homogeneizado de rim para atingir 45 mL e foi filtrada através de um filtro de células de 70 µm. A solução foi centrifugada a 400 x g/7 min. e o sedimento foi suspenso em 5 mL de solução de lavagem e filtrado em peneira de células de 40 µm e centrifugado a 400 x g/7 min. O pellet foi ressuspenso em 3 ml de FBS (10 mM EDTA) e colocado sobre Histopaque-1083 (Sigma, Rehovot, Israel) e centrifugado a 20 ◦C a 400× g/30 min com o freio desligado. A camada de células mononucleares que repousa acima do Histopaque foi removida, lavada duas vezes com solução de lavagem e suspensa em 5 mL de solução de lavagem para análise de citometria de fluxo.
2.4. Citometria de fluxo
De cada grupo,rinsde 5-7 ratos foram analisados. Para cada amostra, foram retiradas 1 × 106 células. As células mononucleares isoladas foram incubadas com marcadores extracelulares: anti-CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-0030-82, RRID:AB_465493) e seu controle isotípico (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-4742-41, RRID :AB_10753770), anti-CD4 (Thermo FisherScientific Cat# 17-0040-80, RRID:AB_1210581) e seu controle de isotipo (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-4724-81, RRID: AB_470188), anti-CD8 (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0084-82, RRID:AB_10548361) e seu controle de isotipo (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-4714-80,RRID: AB_657914). Todas as células foram analisadas por citometria de fluxo (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, RRID: SCR_000401) usando o software FlowJo (FlowJo, RRID: SCR-008520).
Função do rim Cistanche
2.5. Cultura de células
A linhagem celular mesangial de rato, RMC (ATCC Cat# CRL{{0}}, RRID: CVCL_0506), foi obtida da ATCC®. A célula foi cultivada em meio Eagle modificado de Dulbecco (01-055-1A, indústrias biológicas, Beit HaEmek, Israel) com 4 mM de L-glutamina ajustada para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e 4,5 g/L de glicose e suplementada com 0,4 mg/mLG418 e 15 por cento de soro fetal bovino. A melatonina foi obtida da Sigma (M5250 Rehovot, Israel). A 250 mMmelatoninaestoque foi feito em etanol. As células foram cultivadas em condições normais ou com alto teor de sal (adicionando 80 mM de NaCl ao meio) sem ou com melatonina (0,5 mM). O tratamento com melatonina foi cronometrado 45 min antes de adicionar NaCl ao meio. Todos os experimentos foram em placas de 6 poços com 3 × 105 células por poço e foram realizados por 6 ensaios independentes.
2.6. Análise estatística
Os dados são apresentados como média ± SEM As análises estatísticas foram realizadas usando IBMSPSS Statistics, RRID: SCR_019096. A análise de variância unidirecional (ANOVA) e o método posthoc de Tukey examinaram as diferenças entre os grupos. Os dados de qPCR em tempo real foram analisados usando DataAssist, RRID: SCR_014969.
3. Resultados
3.1. A melatonina protege os ratos que consomem um HSD
A idade dos ratos durante este estudo foi de 4 a 13 semanas. Nesta idade, o bem-estar dos ratos é indicado pelo ganho de peso que foi exibido pelo grupo controle [17]. No entanto, o grupo HSD atingiu um platô no dia 30 e a adição demelatoninaao HSD melhorou esse fenômeno (Figura 1A). O grupo HSD apresentou uma alta taxa de mortalidade, onde 50 por cento dos ratos morreram ou tiveram uma condição clínica que exigiu a eutanásia de acordo com as regras do comitê de ética animal, durante o período experimental. Suplementos de melatonina preveniram significativamente a mortalidade dos ratos, onde apenas um em cada oito ratos morreu no dia 58, ao final do período experimental (Figura 1B).
Figura 1.Melatoninamelhora da pressão arterial e sobrevida em HSD. Ratos DSS foram tratados por 9 semanas com HSD com e sem melatonina. Uma dieta rica em sal reduziu o peso corporal a partir do dia 36 e a melatonina moderou esse efeito (A). A HSD aumentou a taxa de mortalidade a partir do dia 40. O tratamento de fedrats HSD com melatonina melhora sua sobrevivência. (B). (n=8) *-p Menor ou igual a 0,05 sal e sal mais melatonina versus controle. #-p Sal menor ou igual a 0,05 versus controle e sal mais melatonina. HSD – dieta rica em sal.
3.2. A melatonina previne a infiltração de células T do rim induzida por HSD
Isolamos as células dorime bloqueou-os para o marcador de células T, CD3. As células CD3 plus foram fechadas para CD4 e CD8. Tanto CD3 mais CD4 plus quanto CD3 mais CD8 plus foram significativamente maiores no HSD (5,18 ± 1,62 e 4,6 ± 0,75 por cento, respectivamente) em comparação com o controle (0,16 ± {{18} }.{{20}}2 e 0,95 ± 0,15 por cento , respectivamente) emelatoninaa suplementação ao HSD reduziu as células CD3 mais CD4 plus e CD3 mais CD8 plus de volta aos níveis de controle (0,68 ± 0,21 e 1,37 ± 0,45, respectivamente) (Figura 2A-D).
Figura 2. A melatonina impede a infiltração de células T norim. As células T foram isoladas de rins de ratos e foram fechadas para CD3. As células CD3-positivas foram fechadas para CD4 e CD8. A melatonina (C) reduziu tanto CD3 mais CD4 mais quanto CD3 mais CD8 mais em comparação com HSD sem melatonina (B) sem diferença do grupo controle (A). A análise para todos os ratos é mostrada em (D) (n=7–8). HSD – dieta rica em sal. *-p Menor ou igual a 0.05 versus controle. #-p Menor ou igual a 0,05 versus sal mais melatonina.
3.3. A melatonina reduz certas quimiocinas renais que foram reguladas positivamente no HSD
O recrutamento de células T para tecidos inflamatórios é regulado pela expressão local de quimiocinas. Nós, portanto, medimos a expressão de duas famílias de quimiocinas no ratorins: a família de ligantes de quimiocinas (motivo CXC) (CXCL) e a família de ligantes de quimiocinas (C-Cmotif) (CCL).
Para a família CXCL, CXCL 9, 10 e 11 que atraem células T para seu tecido alvo usando o receptor CXCR3 nas células T, foram significativamente regulados em ratos HSD. A suplementação demelatoninapara o HSD reduziu sua expressão de volta aos níveis de controle. O mesmo padrão foi detectado para CXCL 1 e 16. No entanto, para CXCL12, nenhuma regulação positiva foi detectada no HSD (Figura 3A).
Para a família CCL, CCL 2, 4, 12, 17, 19 e CX3CL1 não apresentaram regulação positiva em HSD. CCL3 foi superregulada em HSD, mas nenhuma mudança significativa foi detectada com a adição de melatonina à dieta. Para CCL7, uma regulação positiva significativa no HSD e uma regulação negativa significativa com a adição demelatoninaao HSD foi detectado (Figura 3B).
Figura 3. Superregulação derinsquimiocinasem HSD com e sem melatonina. A expressão da família de ligantes de quimiocina (motivo CXC) (CXCL) (A), família de ligantes de quimiocina (motivo CC) e CX3CL1 (B) foi determinada nos ratos. (n=7–8) *-p Menor ou igual a 0.05 versus controle. #-p Menor ou igual a 0,05 versus sal mais melatonação. HSD – dieta rica em sal.
3.4. O efeito direto da melatonina na linha celular mesangial RMC
Em seguida, nos concentramos em CXCL9, 10 e 11, que atraem células T ligando-se ao receptor CXCR3. Determinamos a expressão dessesquimiocinasem células RMC que são uma linha celular mesangial de rato.
Nós tratamos as células com 80 mM NaCl sem e com 0,5 mMmelatonina. Essa concentração de NaCl aumentou significativamente a expressão de CXCR10 em 2,4 ± 0.26-vez em comparação com o controle, e a adição de 0,5 mM de melatonina diminuiu significativamente esta expressão para 1,4 ± 0.{{10}}vez em comparação com o controle (Figura 4A). Para CXCL11, 80 mM NaCl aumentou significativamente a expressão em 3 ± 0.48-vezes em comparação com o controle, e a adição de 0,5 mM de melatonina diminuiu significativamente essa expressão para 1,8 ± 0.{{22 }} vezes comparado ao controle (Figura 4B). CXCL9 não foi detectado em células RMC.
Figura 4. O sal aumentou a expressão de CXCL10 e CXCL11 em uma linhagem de células mesangiais onde o tratamento com melatonina diminuiu sua expressão. RMC (linha de células mesangiais de ratos) foram tratadas com sal 80 mM com e sem melatonina 0,5 mM. CXCL10 (A) e CXCL11 (B) foram regulados positivamente por tratamento com sal e a adição demelatoninareduzir essa regulação. Os gráficos apresentam 6 ensaios independentes. *-p Menor ou igual a 0.001 versus controle #-p Menor ou igual a 0.005 versus sal 80 mM e melatonina 0,5 mM. $-p Menor ou igual a 0,05 versus sal 80 mM e melatonina 0,5 mM.
4. Discussão
O efeito benéfico demelatoninasobre hipertensão foi demonstrado em estudos anteriores e foi sugerido como um possível curso de ação para hipertensão resistente ao tratamento [18]. Em nosso primeiro estudo, focamos no estresse oxidativo e revelamos que a melatonina reduz o estresse oxidativo induzido por HSD. No presente estudo, focamos no efeito imune adaptativo e mostramos que a melatonina melhora a sobrevida de ratos alimentados com HSD. Este efeito está associado a uma redução das células T que infiltram o rim e à regulação negativa derimexpressão de quimiocinas.
Dados históricos demonstram que ratos DSS que consomem HSD desenvolvem hipertensão grave e apresentam taxas de mortalidade mais altas [19]. O próprio Dahl relatou ao estabelecer o modelo que quando os ratos DSS foram colocados em um HSD (8% NaCl) no desmame (21-23 dias de idade), eles desenvolveram rapidamente HTN e todos morreram na 16ª semana de alimentação com sal [20]. Posteriormente, após algumas modificações da cepa, Rapp et al. relataram que todos os ratos estavam mortos dentro de oito semanas do HSD (8 por cento de NaCl) [21]. Os ratos do nosso estudo apresentaram alta taxa de mortalidade, mas não chegaram a 100%, provavelmente devido ao menor percentual (4%) de sal na dieta. Apesar disso, é óbvio quemelatoninaa suplementação preveniu significativamente a mortalidade de ratos.
O ganho de peso é um marcador do bem-estar dos ratos na idade de 4 a 13 semanas. Os ratos DSS são originários de Sprague Dawley, que é uma cepa bem caracterizada. Na idade dos ratos que usamos em nossos experimentos, supõe-se que os ratos ganhem peso consistentemente [22]. Em muitos estudos com animais, a redução de peso é considerada um dos "pontos finais" dos experimentos [23]. A partir de vários estudos, fica claro que um HSD em ratos DSS resulta em menores taxas de ganho de peso em comparação com controles [24,25]. Em concordância com esses estudos, também observamos diferenças de peso entre os grupos. Aqui, os ratos não ganharam peso após quatro semanas de HSD. A melatonina também interrompeu esse efeito do HSD, pois os ratos que foram tratados com melatonina continuaram a ganhar peso, embora menos do que os controles.
A habilidade demelatoninapara reduzir a pressão arterial em modelos animais foi descoberto no final dos anos setenta do século 20 [26-28]. Desde então, foi relatado em vários outros modelos, como que uma dieta rica em frutose induz síndrome metabólica em ratos espontaneamente hipertensos [29,30]. Nossos estudos neste campo são os primeiros a mostrar que a melatonina desempenha um papel na hipertensão induzida pelo sal, prevenindo danos nos órgãos e reduzindo a mortalidade.
Neste estudo, mostramos que um HSD induz a infiltração de linfócitos T para orim, um processo que foi descrito em ratos DSS principalmente pelo grupo de Mattson [31-33]. O papel central desse processo de infiltração no modelo DSS foi demonstrado por um estudo recente que observou que ratos DSS com deficiência de células T são protegidos A hipertensão induzida por um HSD e uma transferência de esplenócitos exacerba a hipertensão sensível ao sal [34].
A melatonina pode afetar as células T em vários aspectos (para revisão, consulte [35]). Este estudo mostrou pela primeira vez quemelatoninareduz a atração de células T CD4 plus e CD8 plus para orimem HSD. Este efeito da melatonina pode ser o mecanismo subjacente ao seu efeito benéfico neste modelo.
A capacidade da melatonina de reduzir a infiltração de células T foi descrita no modelo experimental de camundongos de encefalomielite autoimune (EAE). Na EAE, a melatonina mostrou reduzir a infiltração de células T CD4 plus e células Th17 no SNC [36,37].
A atração de células T para um tecido específico é regulada principalmente por altas concentrações locais dequimiocinasque são citocinas quimiotáticas que controlam os padrões migratórios e o posicionamento das células imunes. Duas grandes famílias de quimiocinas que induzem a infiltração de células T são as famílias de quimiocinas do ligante do motivo CXC (CXCL) e do ligante do motivo CC (CCL) [38].
Cistanche para melhorar a disfunção renal
Em nosso estudo, não encontramos um padrão constante na resposta da família CCL a um HSD e amelatonina. Fora dos novequimiocinasnesta família, apenas CCL7 e CLL21 foram observados aumentando sua expressão devido à HSD, e a suplementação de melatonina a reduziu. Um HSD aumentou a expressão de CCL3, mas nenhuma redução foi detectada nos ratos tratados com melatonina. Um estudo recente no mesmo modelo mostrou que um HSD regula positivamente o CCL2 norimusando o método RNA-Seq [39]. No entanto, este estudo testou os níveis nos dias 3 e 21 após o início da dieta. Em nosso estudo, testamos os níveis após oito semanas. É possível que a expressão de quimiocinas mude durante o período HSD.
Por outro lado, os níveis da maioria da família CXCL, incluindo CXCL 1, 9, 10, 11 e 16, aumentaram nos ratos tratados com HSD emelatoninaa suplementação aboliu esse incremento. Apenas CXCL12 não apresentou aumento na resposta ao HSD.
CXCL9, CXCL10 e CXCL11, denominados "ligantes do receptor 3 de quimiocina CXC induzíveis por interferon", são induzidos por IFN- e são os ligantes do receptor 3 de quimiocina CXC (CXCR3). Estudos in vivo demonstraram sua importância na ativação e recrutamento de linfócitos T para o órgão alvo [40-42]. Youn et al. mostraram, em pacientes hipertensos humanos, infiltração renal de células T e níveis circulantes elevados de todos os três CXCR3quimiocinas, sugerindo que CXCR3 e seus ligantes são relevantes para células T envolvidas na hipertensão humana [43]. Outro estudo demonstrou que o CXCL10 está elevado em pacientes hipertensos, e seus níveis estão correlacionados com seus valores de pressão arterial [44].
Devido a esses estudos, nos concentramos em CXCL9, CXCL10 e CXCL11. Cultivamos a linhagem de células mesangiais de rato e as tratamos com NaCl 80 mM e melatonina 0,5 mM. Descobrimos que CXCL 10 e 11 são regulados positivamente nas células e a melatonina suprime essa elevação. Nossos resultados indicam que o efeito do sal na elevação da CXCL 10 e 11, e o efeito oposto damelatonina, foram ambos detectados diretamente em células mesangiais. Em contraste, CXCL9 não foi detectado nestas células.
Nosso estudo tem limitações. Em nossos resultados FACS, muitos dos CD3 plus foram duplamente negativos para CD4 e CD8. Os mesmos resultados foram vistos no estudo de Mattson de 2010 [31]. No entanto, em estudos mais recentes do grupo de Mattson, as células CD3 mais CD4-CD8-foram muito poucas [32,33,45,46]. A diminuição significativa das células CD3 duplamente negativas pode ser resultado da adição do marcador CD45 e da análise apenas das células CD45 positivas, o que foi feito nos estudos posteriores de Mattson. É possível que a grande população do CD3 plus CD4-CD8- seja um artefato. No entanto, nenhum artefato é conhecido para a população de células CD3 plus CD4 plus e CD3 plus CD8 plus.
5. Conclusões
Em conclusão, uma dieta rica em sal está associada à infiltração de células T norinsde ratos DSS. O sal também aumentou a expressão de quimioatraentes específicos de células T no rim. Tratamento commelatonina(30 mg/kg/dia) aboliu esses efeitos (melatoninareduz a infiltração de células T induzida por HSD nos rins juntamente com uma redução na expressão de quimiocina ligante CXCL3).
Nosso estudo in vitro demonstra que o sal e a melatonina podem regular a expressão quimioatrativa, afetando diretamenterimcélulas.
Contribuições dos Autores: Conceptualization, AL; análise formal, AB e RK; investigação, RK;metodologia, AB e AL; redação – rascunho original, AB e AL; redação—revisão e edição, YSand EG Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento: Esta pesquisa não recebeu financiamento externo.
Declaração do Conselho de Revisão Institucional: O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética animal institucional do centro médico Sheba, protocolo nº 1219/19/ANIM e protocolo do Ministério da Saúde nº 16418.
Termo de Consentimento Informado: Não aplicável.
Declaração de disponibilidade de dados: Os dados apresentados neste estudo estão disponíveis mediante solicitação do autor correspondente.
Agradecimentos: Os autores agradecem a Zehava Shabtai por seu excelente suporte técnico e a Michael Kanovsky por seus serviços editoriais.
Conflitos de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesse.
Referências
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