Matrix Metaloproteinase 12 é um fator prognóstico independente que prevê a recidiva pós-operatória do carcinoma de células renais convencional - um breve relatório

para mais informações:ali.ma@wecistanche.com

Bence Beres¹· Maria Yusenko²· Lehel Peterf¹· Gyula Kovacs^1,3· Daniel Banyai¹

Abstrato

Finalidade Aproximadamente 15 por cento das placas convencionais clinicamente localizadasrenalcarcinomas celulares(cRCC) desenvolvem metástases dentro de 5 anos de acompanhamento. O cCRC sarcomatoso é um câncer altamente maligno do rim. O objetivo do nosso estudo foi identificar biomarcadores para estimar a progressão pós-operatória de cCRCs.

Métodos A análise global da expressão gênica baseada em microarrays de CCRs com e sem alterações sarcomatosas revelou que uma alta MMP12 (Metaloproteinase de matriz 12)expressão foi associada com histologia sarcomatosa. Além disso, analisamos a expressão de MMP12 usando uma matriz multi-tecido compreendendo 736 pacientes cRCC sem metástase no momento da cirurgia. O tempo médio de seguimento foi de 66±29 meses.

Resultados A imunohistoquímica revelou expressão de MMP12 em 187 de 736 cRCCs com bons dados de acompanhamento. A análise subsequente de Kaplan-Meier revelou que os pacientes com tumores positivos para MMP12 exibiram uma sobrevida livre de tumor significativamente menor (p<0.001). in="" multivariate="" cox="" regression="" analysis,="" a="" weak="" to="" strong="">(Metaloproteinase de matriz 12)expressão indicou um risco 2,4-2,8 vezes maior de recidiva do tumor pós-operatório (p<0.001;><0.003,>

Conclusões MMP12(Metaloproteinase de matriz 12)pode servir como um biomarcador para estimar a recidiva pós-operatória do CCR e como um possível alvo para a terapia com penfuridol.

Palavras-chave convencionaisrenalcarcinoma celular · Sarcomatosorenalcarcinoma celular· MMP12 · Imuno-histoquímica · Prognóstico

1. Introdução

RCCs convencionais (cRCCs) representam 85 por cento de todos osrenalneoplasias [1]. Aproximadamente 20-25 por cento dos pacientes diagnosticados com cCRC já carregam metástases no momento da apresentação. CCRs metastáticos são resistentes à quimioterapia e radioterapia e mostram baixas respostas a terapias direcionadas [2]. Atualmente, o diagnóstico precoce em conjunto com a cirurgia é a melhor opção para tratar o CCRc, enquanto a terapia adjuvante só pode prolongar a vida dos pacientes com doença metastática.

Como resultado do uso generalizado de técnicas de imagem, um número crescente de pacientes é diagnosticado com pequenasrenalmassas confinadas ao rim [3]. O número de pT1a detectado incidentalmente (<4 cm="" in="" diameter)="" and="" pt1b=""><7 cm="" in="" diameter)="" tumours="" is="" increasing="" in="" the="" operation="" statistics="" of="" most="" urological="" centres.="" however,="" approximately="" 15%="" of="" clinically="" localised="" crccs="" operated="" with="" curative="" intent="" will="" develop="" metastases="" within="" 5="" years.="" in="" the="" case="" of="" pt1="" crcc="" confined="" to="" the="" kidney,="" tnm="" classification="" cannot="" be="" used="" to="" estimate="" the="" postoperative="">

É geralmente aceito que o cCRC surge dos túbulos proximais do rim adulto. Durante o desenvolvimento e progressão, a grande maioria dos cCRCs mantém suas características epiteliais. No entanto, as variantes mais agressivas de cCRC sofrem transição epitelial-mesenquimal (EMT) perdendo gradualmente as características epiteliais e ganhando histologia sarcomatosa [4]. Durante a EMT, as células tumorais perdem a expressão de várias proteínas de membrana que desempenham um papel seminal na manutenção e função das células tubulares proximais polarizadas normais. O crescimento invasivo e metastático do cCRC depende não apenas do ganho de uma histologia fibroblasto-like/rabdóide, mas também da capacidade de degradar a membrana basal e modificar a matriz extracelular [5].

Aqui, analisamos os padrões globais de expressão gênica de cRCCs e RCCs papilares (pRCC) e daqueles que exibem histologia sarcomatosa e uma progressão rápida. Identificamos MMP12 como o gene mais significativamente superexpresso em cRCCs sarcomatosos. A análise imuno-histoquímica subsequente de uma grande coorte de cRCC revelou que a expressão de MMP12(Metaloproteinase de matriz 12)correlaciona-se significativamente com a recidiva pós-operatória de CCR confinada ao rim no momento da cirurgia.

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2. Materiais e métodos

2.1 Análise de expressão gênica baseada em microarray

Amostras de CCR e amostras de rins normais correspondentes foram coletadas no Departamento de Urologia da Universidade de Heidelberg, Alemanha, no período de 1995-1996. Áreas homogêneas das amostras de tumor foram congeladas em nitrogênio líquido imediatamente após uma operação e armazenadas a -8{11}} graus para análise subsequente. Paralelamente, espécimes tumorais foram fixados em formaldeído a 4% para exame histológico. Para análise de expressão gênica global, selecionamos 17 cRCCs, 18 pRCCs com histologia epitelial. bem como 3 cRCCs e 2 pRCCs com histologia sarcomatosa. O diagnóstico dos tumores foi confirmado geneticamente antes do uso neste estudo. O RNA foi isolado usando um Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). A síntese e hibridação de cDNA subsequentes foram realizadas no Genomics Core Facility do EMBL, Heidelberg, usando uma matriz Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) contendo 54.675 sondas. A normalização foi realizada usando o algoritmo R fornecido pela Bioconductor. Os genes expressos diferencialmente foram identificados usando a Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes. A visualização de genes diferencialmente expressos foi realizada usando o software Multiple Array Viewer (HTTP://www.tm4.org/index.html). Os dados do perfil de expressão são depositados no NCBI Gene Expression Omnibus sob o número de acesso GSEA 11151.

2.2 Pacientes e amostras de tumor

A coorte utilizada foi composta por 736 pacientes submetidos à nefrectomia tumoral radical ou parcial entre 2000 e 2015. O diagnóstico histológico e a classificação TNM foram determinados por um dos autores (GK) de acordo com a classificação de Heidelberg e sistemas TNM aplicando 3 trier grading [6] , 7]. Restringimo-nos à Classificação de Heidelberg porque se baseia em alterações genéticas robustas específicas do tumor e não em características citológicas variáveis. Aproximadamente 70 por cento dos cRCCs eram compostos de células "claras" e o restante de células "eosinofílicas" (anteriormente chamadas de "granulares") ou células claras e eosinofílicas mistas. Os dados sobre seguimento regular e óbito específico do tumor foram obtidos do Registro do Departamento de Urologia. O seguimento foi definido como o tempo desde a operação até o último controle registrado ou morte específica por câncer. Os pacientes que morreram por outras causas que não o CCR não foram incluídos nesta análise. O estadiamento clínico pré-operatório incluiu tomografia computadorizada (TC) de abdome e tórax. Cintilografias ósseas e tomografia computadorizada do cérebro foram obtidas apenas quando indicadas por sinais clínicos. A presença de metástases nodais foi confirmada pelo exame histológico e de metástases à distância pelo exame radiográfico. Os pacientes no pós-operatório foram examinados a cada 6 meses por ultrassonografia abdominal e dosagem de creatinina sérica e TFGe, e a cada 12 meses por tomografia computadorizada.

2.3 Construção de microarray de tecido (TMA)

Áreas tumorais representativas foram identificadas usando lâminas coradas com hematoxilina e eosina e selecionadas para construção de TMA. De tumores com áreas de morfologia diferente ou classificação de 2 a 4 biópsias foram feitas. Biópsias com diâmetro de 0,6 mm foram colocadas em um bloco receptor usando um Manual Tissue Arrayer (MTA1, Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, EUA). Biópsias de rim, cérebro e fígado de fetos e adultos foram incluídas na TMA.

2.4 Imuno-histoquímica

Seções de TMA de 4 µm foram desparafinadas em xileno e reidratadas em etanol graduado. Em seguida, a recuperação do antígeno foi realizada fervendo as lâminas em EnVision FLEX Target Retrieval Solution, pH alto (DAKO, Glostrup, Danemark) em 2100-Retriever (Pick-Cell Laboratories, Amsterdam, Holanda). A atividade da peroxidase endógena e a coloração não específica foram bloqueadas usando um Reagente Bloqueador de Peroxidase Envision FLEX (DAKO) por 10 min à temperatura ambiente. As lâminas resultantes foram posteriormente incubadas por uma hora em uma câmara úmida com um anti-MMP12(Metaloproteinase de matriz 12)anticorpo (NBP{{0}}, Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA) na diluição de 1:250. EnVision, seguido por um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rabanete FLEX (DAKO) por 30 min à temperatura ambiente. Como controle negativo, as lâminas foram incubadas apenas com o anticorpo secundário. Os sinais foram visualizados com DAB (3,3'-Diaminobenzidina) (DAKO). Os cortes de tecido foram contracorados com hematoxilina de Mayer (modificação de Lillie, DAKO) e, após 10 s de coloração em solução de hidróxido de amônio, montados em Glicergel (DAKO). As reações imunes foram avaliadas por BB e GK cegos aos dados clínicos. As fotografias foram tiradas usando um microscópio Leitz DMRBE, equipado com uma objetiva HC PLAN APO 20×0,70 e uma câmera Progres C14. Como a porcentagem de células coradas positivamente representava pelo menos 90% das células tumorais em todas as biópsias positivas, não avaliamos o número de células positivas como parâmetro. Classificamos a intensidade da coloração como sem coloração, coloração fraca ou coloração forte (ver Fig. 1 bd).

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2.5 Análise estatística

A análise dos dados foi realizada usando o pacote de software SPSS Statistics versão 20.0 (IBM,35 Armonk, NY, EUA). Correlações entre MMP12(Metaloproteinase de matriz 12)expressão e parâmetros clínico-patológicos foram avaliados pelo teste Qui-quadrado. O efeito das diferentes variáveis ​​(idade, sexo, tamanho do tumor, classificação TNM, grau, estágio e expressão de MMP12) no tempo de sobrevida dos pacientes foi estimado pela análise de Kaplan-Meier. As comparações das curvas de sobrevida foram feitas pelo teste Log-rank. Análises de sobrevida univariada e multivariada foram realizadas usando o modelo de regressão COX. Os pacientes vivos e livres de doença foram censurados. As diferenças foram consideradas signifcativas em p<>

3 Resultados e discussão

Avaliamos os perfis de expressão de 17 cRCCs e 18 pRCCs com histologia epitelial contra os de três cRCCs e dois pRCCs com histologia sarcomatosa. Em seguida, selecionamos 50 genes por Análise de Enriquecimento de Conjuntos de Genes (GSEA) que foram regulados positivamente nos CCRs sarcomatosos. Os resultados dos três genes expressos de forma mais proeminente (MMP12, ANLN e ADAM12) são mostrados na Fig. 1A. MMP12(metaloproteinase de matriz 12)foi superexpresso em quatro cRCCs epiteliais de crescimento agressivo também. Nenhum dos pRCCs exibiu superexpressão de MMP12.

Fig. 1 MMP12(Metaloproteinase de matriz 12)expressão no rim normal erenalcarcinoma celular(RCC). (A) Parte de um mapa de calor mostrando a expressão gênica diferencial em RCC convencional (cRCC), RCC papilar (pRCC) e RCC sarcomatoso (sRCC). A expressão de MMP12, assim como a de ANLN e ADAM12, é regulada positivamente em sRCC (vermelho). Nenhum dos pRCCs, mas 4 cRCCs sem histologia sarcomatosa, exibiram uma alta expressão de MMP12. (B) Imuno-histoquímica da expressão de MMP12. (a) Expressão forte de MMP12 nos túbulos distais (DT) do rim adulto; túbulos proximais (TP) são negativos. (b) Ausência de expressão de MMP12 em um cRCC. (c) Expressão fraca e difusa de MMP12 em um cRCC com histologia epitelial. (d) Expressão forte de MMP12 em um sRCC. (e) Expressão forte de MMP12 citoplasmática em um cRCC rabdóide. (f) cRCC epitelial de crescimento papilar exibindo forte expressão de MMP12 nas regiões basais das células tumorais (setas).

A expressão de MP12 foi detectada exclusivamente em células tubulares distais de rins fetais e adultos normais, enquanto as células tubulares proximais foram negativas (Fig. 1B, a). A imuno-histoquímica revelou uma coloração citoplasmática fraca ou forte de MMP12 em 187 dos 736 cRCCs, enquanto 549 cRCCs foram negativos (Fig. 1B, bf). A coloração positiva foi restrita às células tumorais, e nenhuma proteína MMP12 foi detectada no microambiente tumoral, com exceção de alguns macrófagos associados ao tumor. A maioria dos cRCCs positivos fracos exibiu histologia epitelial, enquanto os tumores com um forte MMP12(Metaloproteinase de matriz 12)expressão exibiu características sarcomatosas ou rabdóides (Fig. 1B. d, e). Em vários tumores, um acúmulo de proteína MMP12 foi observado na borda tumor-estroma (Fig. 1B f).

Dos 736 pacientes com CCRc, 426 (58%) eram do sexo masculino e 310 (42%) do sexo feminino. A idade média dos pacientes foi de 60,9±11,2 anos (variação de 23 a 88 anos). O tamanho médio do tumor foi de 49,5±25,3 mm. Durante um acompanhamento médio de 66±29 meses, a recidiva do tumor foi observada em 119 pacientes (16%). Dos 736 tumores, 574 (78 por cento) foram classificados como pT1. A maioria dos cRCCs (510 de 736; 69 por cento) exibiu tumor grau G1. Em relação ao estágio do tumor, 668 (91 por cento) dos casos foram classificados como estágio I ou II. Associações entre MMP12(Metaloproteinase de matriz 12)expressão e parâmetros clínico-patológicos como recidiva e tamanho do tumor pós-operatório, grau, estádio T e estágio do tumor, bem como necrose de coagulação estão descritos na Tabela 1. Todos os parâmetros apresentaram correlação significativa (p<0.001) with="" mmp12="">

A análise de Kaplan-Meier revelou que pacientes com cRCC exibindo uma expressão fraca ou forte de MMP12 tiveram uma sobrevida livre de doença significativamente menor em comparação com aqueles sem expressão de MMP12 (Fig. 2). As taxas de sobrevida global 5-ano para os grupos MMP12 forte, fraco positivo e negativo foram 52,8%, 75,2% e 95,3%, respectivamente. A sobrevida média para pacientes com forte MMP12(Metaloproteinase de matriz 12)coloração foi de 74 (61–87)±7 meses, com uma coloração fraca 105 (85–125) ± 10 meses e com uma coloração negativa 176 (164–188)±6 meses, com sobrevida global de 154 (143–164) ± 5 meses. A análise de regressão de Cox univariada revelou que o tamanho do tumor, grau, classificação T, necrose e positividade de MMP12 foram significativamente associados à progressão do tumor no pós-operatório (todos p<0.001). however,="" in="" multivariate="" cox="" regression="" analysis="" only="" tumour="" grade,="" stage="" and="" mmp12="" positivity="" remained="" as="" independent="" predictors="" of="" relapse.="" in="" this="" correlation,="" a="" weak="" or="" strong="" mmp12="" staining="" indicated="" a="" 2.4–2.8="" times="" higher="" risk="" of="" postoperative="" tumour="" relapse=""><0.001 and=""><0.003, respectively)="" (table="">

Tabela 1 Associação da expressão de MMP12 com parâmetros clínico-patológicos de CCR convencionais sem metástase no momento da operação (n=736)

Fig. 2 Estimativas de Kaplan-Meier de sobrevida livre de recorrência de acordo com imuno-histoquímica em 736 pacientes sem doença metastática no momento da cirurgia. MMP12 fraco ou forte(Metaloproteinase de matriz 12)expressão reflete seu valor prognóstico (p<>

Tabela 2 Análise multivariada: expressão de MMP12(Metaloproteinase de matriz 12)proteína é um fator prognóstico independente que indica risco 2 a 3 vezes maior de recidiva do câncer (p menor ou igual a 0.001; p menor ou igual a 0,003)

É geralmente aceito que o cCRC surge dos túbulos proximais do rim, que é de origem mesodérmica. Durante o desenvolvimento do rim, as células do blastema sofrem transição mesodérmica para epitelial (MET) para formar células polarizadas do sistema tubular proximal. No CCR sarcomatoso altamente maligno ocorre o processo biológico oposto, ou seja, EMT, resultando não apenas na perda do caráter epitelial polarizado das células tumorais, mas também na perda do contato celular [4]. Alterações simultâneas no microambiente tumoral (TME), incluindo alterações na matriz extracelular (ECM), podem abrir caminho para o crescimento invasivo e metástase [8]. A MEC é composta por proteínas fibrilares e não fibrilares, proteínas extracelulares solúveis, citocinas e enzimas que degradam a MEC, como a MMP12(Metaloproteinase de matriz 12). Durante a metástase, as células tumorais rompem a membrana basal separando-as do TME, invadindo assim o TME e, em seguida, os vasos sanguíneos. Neste processo complexo, fibroblastos associados ao tumor e células imunes desempenham papéis fundamentais na produção de interleucinas, fatores de crescimento e enzimas de degradação da matriz [9]. As células tumorais também podem modificar seu próprio microambiente produzindo fatores de crescimento e enzimas que degradam a matriz, como MMP12. Como as MMPs desempenham um papel importante no crescimento metastático de tumores, elas podem ter importância prognóstica [10]. As MMPs são conhecidas por estarem envolvidas em processos fisiológicos normais, como desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas e remodelação de tecidos, e para apoiar o crescimento invasivo e a disseminação de células cancerígenas [11, 12]. Verificou-se que a expressão de MMP12 está associada à progressão de vários tipos de câncer [13-16]. Além de seu papel na eliminação de barreiras físicas, a MMP12 pode gerar fatores pró-angiogênicos, como o VEGF, para formar novos vasos sanguíneos necessários para o crescimento do tumor [8]. Por outro lado, descobriu-se que MMP12 pode ter um efeito anti-tumorigênico através da hidrólise do plasminogênio para formar o potente inibidor da angiogênese angiostatina [17-19]. Portanto, a MMP12 pode ter efeitos tumorigênicos e antitumorigênicos, dependendo do tipo de tecido envolvido.

Aqui, mostramos que MMP12 atua como um fator pró-tumorigênico em cRCC. MMP12(metaloproteinase de matriz 12)A expressão correlaciona-se significativamente com a ocorrência de recidiva do CCR no pós-operatório. A expressão de MMP12 pode ser empregada para a identificação de pacientes com alto risco de progressão tumoral, para monitoramento pós-operatório próximo e para aplicação de terapia direcionada o mais precocemente possível. Recentemente, foi demonstrado que a alta expressão de MMP12 pode estar associada à progressão do adenocarcinoma de pulmão e que o tratamento com penfuridol pode restringir a migração e o crescimento metastático de células tumorais que expressam MMP12 [20]. Sugerimos que MMP12(Metaloproteinase de matriz 12)também pode servir como alvo terapêutico para o penfuridol no CCR.

Contribuição dos autores GK concebeu e supervisionou o projeto e construiu o TMA. BB realizou a coloração IHC e com a ajuda de GK analisou os resultados. MY realizou a análise estatística. BB, PL e DB escreveram o primeiro rascunho e GK revisou o artigo. Todos os autores leram e concordaram com a versão submetida do manuscrito.

Financiamento Financiamento de acesso aberto fornecido pela Universidade de Pécs. Este estudo foi financiado por uma bolsa da Faculdade de Medicina da Universidade de Pecs, Hungria (PTE-AOK-KA-2018/41) para DB

Disponibilidade de dados Os dados completos serão disponibilizados pelo autor correspondente mediante solicitação razoável.

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Declarações

Declaração do conselho de revisão institucional A coleta e o uso de todas as amostras de tecido para este estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Pecs, Hungria (nº 5343/2014).

Declaração de consentimento informado O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes envolvidos neste estudo.

Conflito de interesse Os autores declaram não ter conflito de interesse.

Acesso Aberto Este artigo está licenciado sob uma Licença Creative Commons Atribuição 4.0 Licença Internacional, que permite o uso, compartilhamento, adaptação, distribuição e reprodução em qualquer meio ou formato, desde que você dê os devidos créditos ao autor original( s) e a fonte, fornecer um link para a licença Creative Commons e indicar se foram feitas alterações. As imagens ou outros materiais de terceiros neste artigo estão incluídos na licença Creative Commons do artigo, salvo indicação em contrário em uma linha de crédito para o material. Se o material não estiver incluído na licença Creative Commons do artigo e seu uso pretendido não for permitido por regulamentação legal ou exceder o uso permitido, você precisará obter permissão diretamente do detentor dos direitos autorais. Para visualizar uma cópia desta licença, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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