Muitos estudos confirmaram que as doenças alérgicas são o resultado não apenas da ativação imune inata

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Abstrato:Os mastócitos desempenham um papel muito importante na alergia e inflamação da pele, incluindo dermatite atópica e psoríase. No passado, verificou-se que a referência tem efeitos anti-inflamatórios e antienvelhecimento na pele, mas seu efeito nos mastócitos ainda não foi estudado em detalhes. Neste estudo, usamos mastócitos (células RBL-2H3) e modelos de camundongos para estudar os efeitos antialérgicos e inflamatórios de referência. Primeiro, descobrimos que a referência inibe a degranulação de mastócitos e a expressão de citocinas. Além disso, observamos que quando os mastócitos foram estimulados por A23187/forbol 12-miristato-13-acetato (PMA), a elevação do cálcio intracelular foi inibida por referência. A fosforilação da via MAPK/NF-KB também é reduzida pelo pré-tratamento de referência. Os resultados dos estudos in vivo mostram que a referência pode melhorar a aparência da dermatite e infiltração de mastócitos causada pelo dinitroclorobenzeno (DNCB). Além disso, as expressões das proteínas de barreira na pele também são restauradas.cistanchPor fim, verificou-se que a referência pode reduzir o comportamento de arranhões causado pelo composto 48/80. Em conjunto, nossos resultados indicam que a referência é um produto natural anti-alérgico e anti-inflamatório muito bom. Seu efeito nos mastócitos contribui para seu mecanismo farmacológico.

Palavras-chave:referência; produto natural; mastócitos; dermatite; coceira

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1. Introdução

Muitos estudos confirmaram que as doenças alérgicas são o resultado não apenas da ativação imune inata, mas também da ativação adaptativa. Entre eles, os mastócitos desempenham um papel muito importante em uma variedade de doenças alérgicas, como rinite alérgica, asma e dermatite alérgica. Os mastócitos expressam receptores de IgE (FceRI) em suas membranas celulares, e os receptores de FceRI têm alta afinidade por anticorpos IgE [1,2]. Quando a IgE específica do antígeno se liga ao FceRI, ocorre uma interação e ocorre uma reação alérgica. A agregação de FceRI pode ativar receptores de tirosina quinases, iniciar reações a jusante e promover a fosforilação de várias proteínas-chave (como proteína quinase ativada por mitógeno; MAPKs), levando ao influxo de íons cálcio (Ca2 mais ), que é um evento chave na degranulação de mastócitos [3].cistache AustráliaOs mastócitos ativados degranulam e liberam mediadores químicos. Esses mediadores químicos usados ​​em reações alérgicas podem causar inflamação [4], portanto, o tratamento dos sintomas alérgicos envolve inibidores da degranulação de mastócitos. Portanto, a inibição da degranulação de mastócitos mediada por IgE é frequentemente usada para identificar novos compostos para prevenir e tratar doenças alérgicas. Foi estabelecido que anticorpos e antígenos anti-dinitrofenil (DNP)IgE podem induzir reações de hipersensibilidade cutânea passiva (PCA) como um modelo típico in vivo de hipersensibilidade imediata e como uma droga de pesquisa para o potencial de alergias anti-antigênicas [5,6]. ]. Além disso, a degranulação de mastócitos também pode ser causada por estimulantes não imunológicos, como os compostos 48/80 e A23187. O ionóforo de cálcio A23187 é conhecido há muito tempo por estimular a secreção de mastócitos com a liberação de mediadores pré-formados, como a histamina de seus grânulos, servindo como exemplo [4] O composto 48/80 é um polímero misto de p-metoxi-N-metilfenetilamina reticulado por formaldeído, que é amplamente utilizado para estimulação independente de mastócitos [7,8] Portanto, quantidades apropriadas de composto 48/80 e A23187 têm sido comumente usadas como reagentes para estudar o mecanismo de reações alérgicas. De acordo com avaliações estatísticas, cerca de 15-20 por cento da população sofre de dermatite atópica. Quer sejam crianças ou adultos que sofrem desta doença, sem tratamento adequado, a dermatite atópica pode causar sofrimento psicológico aos pacientes e onerar seus custos familiares e sociais de saúde [9]. Infelizmente, não existe um método de tratamento adequado para curar a dermatite alérgica. As opções de tratamento atuais ainda evitam alérgenos causadores de doenças, e o uso contínuo de esteróides é o padrão ouro de tratamento. Os inevitáveis ​​alérgenos e os efeitos colaterais das drogas levaram ao desenvolvimento urgente de novas drogas terapêuticas. Compostos naturais isolados de ervas e plantas medicinais são fontes potenciais de agentes terapêuticos para prevenir e tratar doenças inflamatórias e melhorar a qualidade de vida de pacientes com distúrbios alérgicos.

Cistanche pode anti-envelhecimento

A referência vem do núcleo de lótus (o embrião da semente) da planta Nelumbo nucifera e é um importante alcalóide bisbenzilisoquinolina. Há evidências de que a referência possui uma ampla gama de propriedades farmacológicas, como efeitos anticancerígenos, antioxidantes, anti-inflamatórios e neuroprotetores, em muitas doenças [10-15].benefícios do cistacheKhan et ai. descobriram que a referência produz efeitos anti-fotoenvelhecimento ao inibir o aumento mediado por UV nos níveis de ROS e malondialdeído (MDA) em queratinócitos e fibroblastos humanos[16,17] dermatite ou outras doenças inflamatórias relacionadas à pele[18]. No entanto, se a referência desempenha um efeito antialérgico da pele em mastócitos ainda permanece incerto. Neste estudo, nosso objetivo foi investigar os efeitos da referência em doenças alérgicas mediadas por mastócitos, usando linhagens de mastócitos humanos (células RBL-2H3) e um composto 48/80-e anafilaxia induzida por DNCB modelo de ratos.

A referência fornecida pelo núcleo de loto (o embrião da semilla) da planta Nelumbo nucifera é um importante alcaloide de bisbencilisoquinolina. Existe evidência de que a referência tem uma ampla gama de propriedades farmacológicas, como efeitos anticancerígenos, antioxidantes, antiinflamatórios e neuroprotetores, em muitas enfermedades [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan et al. encontró que a referência produz efeitos antifotoenvejecimento ao inibir o aumento dos níveis de ROS e malondialdehído (MDA) mediado por UV em queratinocitos e fibroblastos humanos [16,17] Recentemente, descobrimos que a referência tem potencial como medicina alternativa para o tratamento dermatite atópica u outras enfermedades inflamatorias relacionadas com la piel[18]. Sem embargo, sigue se incierto se a referência tem um efeito contra as alergias cutâneas nos mastócitos. Neste estudio, nuestro objetivo fue investigar os efeitos de referencia nas enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, usando linhas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) e um modelo de ratos com anafilaxia inducida por compuesto 48/80 y DNCB .

2. Resultados

2.1.Teste de citotoxicidade de neferina em células de mastro de rato(RBL-2H3)

Como as células de leucemia basofílica de rato (RBL)-2H3, um análogo de mastócitos liberador de histamina, são células adequadas para examinar os efeitos da inflamação mediada por mastócitos [19], usamos essas células para investigar o efeito antialérgico efeitos de referência. Primeiro, testamos se a referência pode produzir citotoxicidade em mastócitos. Quando as células são pré-tratadas com referência de 1 a 30 μM por 24 h, a viabilidade celular das células não será afetada pelo tratamento de referência (Figura 1).

2.2. Neferina reduz o efeito de desgranulação de RBL-2H3 estimulado por diferentes ativadores

As células RBL-2H3 são comumente utilizadas para estudos in vitro de degranulação [20-22]Estimulação das células RBL-2H3 com anti-dinitrofenol (DNP)IgE e albumina sérica humana conjugada com DNP (HSA) desencadeia a degranulação. Além disso, os mastócitos são conhecidos por desgranular em resposta a compostos sintéticos, como o composto 48/80 e o ionóforo de cálcio A23187, e esses compostos têm sido usados ​​como reagentes convenientes para estudos diretos dos mecanismos de respostas alérgicas in vitro [23, 24]. Os resultados mostraram que o citoplasma de RBL-2H3 que não foi ativado pelo ativador continha grânulos secretores limitados.colesterol cistancheO tratamento de referência （10μM） sozinho não afetou a atividade de RBL-2H3 (Figura 2A, B). No entanto, a adição de diferentes ativadores, incluindo composto 48/80, A23187 e anti-DNP/IgE mais DNP/HSA, preencheu claramente o citoplasma com grânulos de secreção. Ao microscópio eletrônico, pode-se observar que há um grande número de grânulos de secreção no citoplasma, e alguns grânulos de secreção até se fundem com a membrana celular, levando à degranulação (Figura 2C-E). Após o pré-tratamento com referência de 10 uM, os grânulos de secreção no citoplasma foram significativamente reduzidos (Figura 2F-H). Esses resultados indicam que a referência pode efetivamente inibir a ativação e desgranulação de RBL-2H3 estimulada pelo ativador.

2.3. Neferina inibe PMA/A23187-elevação de cálcio intracelular induzida em RBL-2H3

Os íons cálcio desempenham o papel de mensageiro secundário no processo de ativação celular. A23187 é a maneira mais eficaz de aumentar a penetração de íons de cálcio através das membranas celulares e estimular a ativação de mastócitos. Acetato de miristato de forbol (PMA) pode ativar a proteína quinase Cand e aumentar os íons de cálcio intracelular para aumentar o efeito de A23187. O aumento dos íons cálcio nos mastócitos também tem sido considerado um fator importante na indução da ativação dos mastócitos, de modo que afeta a degranulação dos mastócitos e libera mais citocinas e quimiocinas inflamatórias.efeitos colaterais de cistanche deserticola,Portanto, este estudo procurou explorar se a referência pode inibir a concentração de íons cálcio no RBL-2H3 quando inibe a inflamação. O grupo experimental foi dividido em com ou sem pré-tratamento de referência por 20 min, e 1 mM de CaClz e PMA/A23187 foram adicionados para estimular e ativar RBL-2H3. Os resultados experimentais mostraram que o tratamento de RBL-2H3 apenas com diferentes concentrações de referência não afetou o aumento da concentração de íons cálcio intracelular. No grupo de influxo de Ca2t induzido por PMA/A23187-, a concentração de íons cálcio intracelular aumentou significativamente. As células RBL-2H3 foram pré-tratadas por 20 min com referência （3 μM e 10 μM）, e a concentração de íons de cálcio foi significativamente reduzida (Figura 3).

2.4. Neferina reduziu a expressão de mRNA de citocinas pró-inflamatórias em PMA/A23187 estimulado por RBL-2H3

A resposta imune da pele aumentará o número de mastócitos no corpo, e os mastócitos produzirão citocinas pró-inflamatórias e acelerarão o progresso da doença. Citocinas pró-inflamatórias, especialmente TNF-a, IL-6, IL-1 e IL-8, não apenas induzem inflamação, mas também causam infiltração de leucócitos, formação de granulomas e fibrose tecidual. O PMA/A23187 atua nos mastócitos e os induz a produzir IL-16, IL-6, TSLP e TNF- , causando inflamação relacionada à alergia. Portanto, pré-tratamos RBL-2H3 com referência por 20 min e estimulamos com PMA/A23187 por 6 h para detectar se a referência pode regular negativamente a expressão de mRNA de IL-1 , IL{{ 19}}, TSLP e TNF-a. Os resultados mostraram que no grupo tratado apenas com referência, a expressão de mRNA de citocinas não foi afetada, e a expressão de mRNA no grupo que induziu inflamação por PMA/A23187 aumentou significativamente. No grupo tratado com referência, observou-se que os níveis de expressão de mRNA de IL-1 , IL-6, TSLP e TNF-a foram significativamente suprimidos (Figura 4).

2.5. Neferina Inibe PMA/A23187-Fosforilação Induzida da Via MAPK em RBL-2H3

Estudos anteriores apontaram que os mastócitos precisam liberar íons de cálcio intracelular para ativar a MAPK. Além disso, a via de sinalização da MAPK regula a expressão de monócitos, linfócitos T, linfócitos B, citocinas e quimiocinas e induz a autoimunidade. Este mecanismo é semelhante à via de ativação do PMA/A23187. Neste estudo, exploramos se a referência pode participar na regulação das vias MAPK. Tratamos diferentes concentrações de referência (1,3 e 10 uM) com RBL-2H3 por 20 min e depois estimulamos com PMA/A23187 por 30 min para induzir inflamação. Os resultados mostraram que quando RBL-2H3 foi tratado apenas com diferentes concentrações de referência, a ativação das proteínas p38, JNK e ERK não foi afetada. No grupo tratado apenas com PMA/A23187, descobrimos que as proteínas p38, JNK e ERK foram ativadas e têm fosforilação significativa. No grupo pré-tratado com referência, observou-se que para maiores concentrações de referência, a fosforilação das proteínas p38, JNK e ERK foi significativamente reduzida (Figura 5A-C).

2.6. A Neferina Inibe PMA/A23187-Fosforilação Induzida da Via NF-B em RBL-2H3

A expressão de citocinas pró-inflamatórias depende da ativação do fator de transcrição NF-kB nos mastócitos. Quando a proteína IKB foi fosforilada e degradada, o NF-kB foi liberado e migrou para o núcleo, ligando-se aos seus correspondentes elementos responsivos ao DNA e promovendo a transcrição de mediadores pró-inflamatórios. Muitas citocinas e quimiocinas foram produzidas, que regulam a resposta imune, diferenciação e inflamação. Portanto, exploramos se o pré-tratamento com referência afeta a fosforilação de proteínas induzida por PMA/A23187. Tratamos diferentes concentrações de referência（1,3 e 10 μM） para RBL-2H3. Após 20 min, PMA/A23187 estimulou RBL-2H3 por 1 h ou 2 h para induzir inflamação. Os resultados mostraram que o tratamento de RBL-2H3 com diferentes concentrações de referência isoladamente não afetou a fosforilação de IKBa e NF-KB. Quando PMA/A23187 foi usado para estimulação, observou-se um aumento significativo na fosforilação de IkBo e NF-KB. No grupo pré-tratado com referência, verificou-se que a fosforilação de IkBa (Figura 6A) e NF-KB (Figura 6B) foi significativamente reduzida.

2.7.Efeito da Neferina na Dermatite Atópica Induzida por 2,4-Dinitroclorobenzeno(DNCB)

Um modelo animal para pesquisa de doenças, o DNCB é um irritante representativo que causa dermatite atópica[25]. Nosso experimento usa 1% de dinitroclorobenzeno (DNCB) dissolvido em 75% de álcool para induzir o primeiro estágio de resposta de sensibilização. Referência (3mg/kg e 10 mg/kg) e dexametasona (Dexa,{{10}},2 mg/kg) dissolvidos em DMSO foram administrados por via intraperitoneal no quinto dia por dez dias . Nos 8º, 1º e 14º dias, 0,5 por cento de DNCB foi aplicado como o segundo estágio de indução da inflamação. Os camundongos foram divididos em quatro grupos – grupo controle, grupo DNCB, grupo tratado de referência e grupo tratado com dexametasona – e então, após comparação entre os grupos, as diferenças foram observadas. Observamos que o DNCB induziu uma reação inflamatória da pele atópica na pele de camundongos. Após a aplicação do DNCB, verificou-se que a pele dos camundongos aumentou a vermelhidão e a descamação. Tudo isso se deve à proliferação anormal de queratinócitos, infiltração e agregação de células imunes. O grupo tratado com referência 3 mg/kg e dexametasona 0,2 mg/kg por quatro dias teve a vermelhidão aliviada. Continuamos a observar a condição da pele dorsal dos camundongos até o dia 15. Comparado com o grupo controle, o grupo DNCB tinha condições de pele severamente vermelhas e inchadas, e havia caspa e feridas que pareciam ser causadas por coceira e dor . Podemos encontrar uma tendência de diminuição do grau após tratamentos de referência e dexametasona (Figura 7A). A coloração com azul de toluidina foi usada para observar o número de mastócitos agregados. Os mastócitos pareciam roxos quando observados ao microscópio. Pode ser demonstrado quantitativamente que muitos mastócitos infiltrados e acumulados na derme no grupo experimental DNCB, aumentaram significativamente em relação ao grupo controle. No grupo tratado com referência e dexametasona, houve diminuição da infiltração, agregação e número de mastócitos (Figura 7B, C).

2.8. Neferina Melhora a Expressão de mRNA de Moléculas Relacionadas à Barreira após Tratamento de DNCB

A inflamação relacionada à pele causada pela DA pode causar função anormal da barreira da pele. Se a barreira da pele estiver defeituosa, é mais fácil para os antígenos ou irritantes penetrarem na epiderme da pele e entrarem no corpo para induzir reações relacionadas ao sistema imunológico. Ao mesmo tempo, a produção de proteínas de diferenciação, incluindo filagrina, loricrina e involucrina, será suprimida. Portanto, restaurar a barreira da pele danificada é muito importante para prevenir e tratar a DA [26]. Em nosso estudo, utilizamos referências para intervir no modelo animal de dermatite atópica induzida por DNCB. Após o sacrifício dos camundongos, o tecido da pele dorsal foi aterrado para análise de RI-qPCR para avaliar se a referência pode melhorar a redução da expressão de mRNA em filagrina, loricrina e involucrina após o tratamento de DNCB. Os resultados mostraram que o grupo experimental DNCB reduziu significativamente a expressão de mRNA de filagrina, loricrina e involucrina em comparação com o grupo controle. A expressão de mRNA de filagrina, loricrina e involucrina foi significativamente aumentada no grupo tratado com referência e dexametasona em comparação ao grupo DNCB (Figura 8).

Provamos ainda que a referência tem um efeito anti-alérgico de arranhões. Usamos um agente de degranulação de mastócitos, composto 48/80, para induzir o comportamento de coçar em camundongos BALB/c. Conforme mostrado na Figura 9, descobrimos que o tratamento de referência inibiu o comportamento de coçar causado pelo composto 48/80（50 ug/sítio）. A administração repetida de doses mais baixas e mais altas de referência (3 e 10 mg/kg) por 5 dias consecutivos reduziu significativamente o número de arranhões causados ​​pelo composto 48/80.