3. Resultados

3.1. KRG inibiu a atividade de TYR e suprimiu o conteúdo de melanina no sistema livre de células

A enzima TYR participa da etapa limitante da melanogênese [20,21]. Portanto, para verificar se o KRG foi capaz de suprimir a produção dessa enzima, realizamos um ensaio de TYR de cogumelo livre de células. Como mostrado na Fig. 1A, KRG inibiu potentemente a produção de TYR. Células B16/F10 foram tratadas com KRG e estimuladas com a-MSH para induzir a secreção de melanina, e verificou-se que ela foi eficientemente suprimida por KRG, conforme mostrado na Fig. 1B. O ácido kójico, um conhecido agente clareador, foi usado como controle positivo em ambos os experimentos.

De acordo com estudos relevantes, a cistanche é uma erva comum conhecida como "a erva milagrosa que prolonga a vida". Seu principal componente é o cistanósido, que possui diversos efeitos como antioxidante, anti-inflamatório e promotor da função imunológica. O mecanismo entre cistanche e clareamento da pele reside no efeito antioxidante dos glicosídeos cistanche. A melanina na pele humana é produzida pela oxidação da tirosina catalisada pela tirosinase, e a reação de oxidação requer a participação do oxigênio, de modo que os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importante que afeta a produção de melanina. Cistanche contém cistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo, inibindo assim a produção de melanina.

Clique nos benefícios dos comprimidos Cistanche

Para mais informações:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

3.2. Efeitos do KRG nas expressões de mRNA e proteínas de MITF e TRPs

Os resultados acima mencionados indicaram os efeitos do KRG no conteúdo de TYR e melanina. No entanto, para elucidar o mecanismo de inibição da melanina pelo KRG, avaliamos a transcrição e a tradução de genes relacionados à via da melanogênese: TRP-1 e TRP-2, TYR e fator de transcrição associado à microftalmia (MITF ). Como mostrado na Fig. 2A e B, todos os quatro componentes da via de melanogênese foram fortemente inibidos por KRG. Portanto, o KRG foi confirmado como um agente clareador eficaz no estudo in vitro.

3.3. Efeito da suplementação oral de KRG no peso corporal e ingestão alimentar

A exposição ao UVB artificial induz estresse nos animais, o que pode resultar em perda de apetite; portanto, avaliamos a ingestão dietética e a eficiência dietética de camundongos HRM-2 expostos a UVB por 5 semanas, tratados com protetor solar e KRG administrado por via oral. Conforme mostrado na Fig. 3A, não houve alteração significativa no peso corporal nos grupos normal, UVB de controle ou tratamento. A ingestão de alimentos também foi significativamente aumentada nos grupos de controle positivo e tratados com KRG, conforme mostrado na Fig. 3B. Esses resultados mostram que, embora UVB tenha induzido estresse em camundongos, o tratamento com KRG efetivamente impediu a perda de apetite e peso em camundongos.

3.4. Análise da expressão de genes relacionados a rugas em camundongos HRM-2 irradiados com UVB

Para medir o efeito do KRG na formação de rugas na pele, camundongos HRM-2 foram irradiados com UVB para induzir rugas. Após 5 semanas de irradiação, os tecidos da pele foram isolados e a expressão de genes relacionados a rugas (isto é, IL-1b, MMP-2 e MMP- 9) foi analisada. Conforme mostrado na Fig. 4A e B, a expressão da proteína de MMP-2, conforme determinado por ELISA, e a expressão de mRNA, conforme determinado por PCR em tempo real, foram significativamente menores no grupo de controle positivo e no tratamento com KRG grupos do que aqueles no grupo de controle irradiado com UVB. Os níveis de MMP-9 e IL-1b também diminuíram significativamente nos grupos tratados com KRG em comparação com o grupo de controle irradiado com UVB, conforme mostrado por PCR em tempo real (Fig. 4C e D).

3.5. Efeitos do KRG na melanogênese em danos à pele irradiados por UVB

Para confirmar a eficácia de clareamento de KRG, a diferença na formação de melanina nas semanas 1, 3 e 5 de irradiação UVB foi examinada dividindo a pele dorsal de camundongos HRM-2 em esquerda (não tratada) e direita (UVB e seções tratadas com amostras). Conforme mostrado na Fig. 5A, durante a Semana 1 de exposição dos camundongos a UVB com o tratamento de protetor solar e KRG, não houve diminuição significativa na produção de melanina em ambas as doses de KRG. Na semana 3, houve uma pequena diminuição na produção de melanina no grupo de controle positivo tratado com protetor solar e nos grupos KRG em comparação com o grupo de controle irradiado com UVB, conforme mostrado na Fig. 5B. Na semana 5, como mostrado claramente na Fig. 5C, o grupo de controle positivo tratado com protetor solar e ambos os grupos tratados com KRG mostraram uma diminuição significativa na produção de melanina. Esses resultados indicaram que o KRG era um agente de clareamento da pele eficaz.

3.6. Análise dos efeitos do KRG na formação de rugas em camundongos HRM-2

Para determinar os efeitos do KRG na formação e profundidade das rugas, camundongos HRM-2 foram irradiados com UVB para induzir o fotoenvelhecimento, e a profundidade das rugas da pele foi medida usando um analisador 3D, conforme descrito em Materiais e Método seção (2.11), nas Semanas 3, 4 e 5. Conforme mostrado na Fig. 6A e B, o grupo de controle positivo tratado com protetor solar e ambos os grupos tratados com KRG mostraram reduções significativas na formação e profundidade das rugas.

3.7. Efeito do KRG na diminuição da espessura epidérmica e aumento do colágeno

A radiação UV pode aumentar a espessura da epiderme, tornando a pele mais espessa e áspera. Além disso, a exposição contínua ao UVB pode degradar as MMPs e causar perda de colágeno, essencial para a boa saúde da pele [22]. Conforme mostrado na Fig. 7A, a espessura epidérmica induzida por UVB foi fortemente reduzida pelo grupo tratado com protetor solar de controle positivo e por ambos os grupos tratados com KRG. Além disso, na Fig. 7B, é mostrado que a espessura epidérmica, conforme visualizada pela coloração de hematoxilina e eosina, foi diminuída no grupo tratado com protetor solar de controle positivo e em ambos os grupos tratados com KRG. A coloração do tricoma de Masson, realizada para visualizar os componentes da matriz na pele de camundongos HRM-2, revelou intensidade de coloração reduzida no grupo controle irradiado com UVB resultante da degradação das fibras de colágeno; inversamente, em camundongos tratados com protetor solar e ambas as doses de KRG, a intensidade da coloração aumentou dramaticamente em comparação com o grupo de controle UVB (Fig. 7C). Esses resultados mostraram claramente que o KRG é um tratamento seguro e eficaz com efeitos de clareamento da pele e antienvelhecimento.

3.8. Efeitos do creme de ginseng vermelho na pele humana

A elasticidade da pele (também chamada de resiliência) foi medida conforme mostrado na Tabela 1. Um aumento médio na resiliência de 0.03386 foi observado no grupo experimental que recebeu a aplicação do creme contendo 3% de vermelho ginseng. O grupo controle, que recebeu creme sem ginseng, apresentou aumento médio de resiliência de 0,0255.

O teor de óleo no grupo experimental aumentou para 67,8 por cento em comparação com o grupo controle, no qual o teor de óleo foi de 45,6 por cento, conforme mostrado na Tabela 2. Em detalhes, os resultados mostraram que o teor de óleo aumentou 50 por cento em todos grupos experimentais: 46,6% no hemisfério, 25,4% na bochecha esquerda e 32,6% no geral.

O teor de umidade diminuiu nos grupos de controle e experimental, conforme mostrado na Tabela 3. Isso foi considerado atribuível à mudança nas condições climáticas entre outubro e novembro na República da Coréia.

A mudança no tom da pele no grupo experimental foi uma diminuição média de 8,24; por outro lado, o grupo controle apresentou um aumento de 2,12 (Tabela 4). Em detalhes, o tom da pele da testa foi aumentado nos grupos controle e experimental. No grupo experimental, o tom da pele diminuiu nas bochechas direita e esquerda; inversamente, no grupo de controle, o tom da pele aumentou tanto na testa quanto na bochecha direita, o que indicava que a pele havia escurecido. Portanto, concluímos que o creme de ginseng diminuiu a tendência da pele a perder a cor; em outras palavras, melhorou o efeito de brilho.

O eritema médio da pele foi reduzido em 33,8 no grupo experimental e 3,6 no grupo controle (Tabela 5). Esses resultados sugerem fortemente os efeitos positivos do extrato de ginseng vermelho na melhoria da condição geral da pele sem induzir efeitos colaterais.

4. Discussão

Os melanócitos são as células produtoras de melanina especializadas encontradas na camada basal da epiderme. Essas células estão envolvidas na produção e transporte de melanina para os queratinócitos vizinhos e na consequente formação de uma camada uniforme de pigmentação da pele. A melanina é um pigmento essencial que tem duas funções. A primeira e mais importante função é pigmentar a pele, e a segunda função é proteger a pele da radiação UV prejudicial, diminuindo o número de espécies reativas de oxigênio [23,24]. Quando a pele é exposta aos raios UV, o hormônio a-MSH é ativado, o que causa a produção de melanina a partir dos melanócitos [25]. Os principais reguladores de todo esse processo de produção de melanina são o MITF, fator de transcrição para a regulação do TYR, e as proteínas relacionadas à tirosina (TRP-1 e TRP-2) [4,26e28]. Esses componentes estão envolvidos na produção de melanina e na pigmentação da pele.

O envelhecimento da pele pode ser amplamente classificado em dois tipos [29]. O envelhecimento intrínseco (ou endógeno) é um fenômeno de envelhecimento inevitável que ocorre com o envelhecimento humano. As características clínicas desse tipo de envelhecimento são relativamente leves e incluem linhas finas, pele seca e elasticidade reduzida [30]. O fotoenvelhecimento (envelhecimento exógeno) refere-se ao fenômeno de envelhecimento observado na pele exposta à luz solar por um longo período. O elemento responsável pelos danos é o UVB da luz solar. Este tipo de fotoenvelhecimento pode ser prevenido pela aplicação de protetor solar comercialmente disponível antes de se expor ao sol e minimizando o tempo de exposição ao sol. As características clínicas do envelhecimento exógeno são deletérias, como pele muito áspera, seca e com elasticidade reduzida e formação de rugas profundas com flacidez cutânea acentuada. A pele fotoenvelhecida também é muito propensa a doenças de pigmentação, como o lentigo solar [31,32].

Além disso, quando a pele é superexposta à luz solar que contém UVB, a quantidade de MMPs extracelulares aumenta, causando degradação das proteínas da matriz, das quais o colágeno é o principal componente [33]. O colágeno é mundialmente aceito como um elemento necessário para a elasticidade da pele, e sua degradação é conhecida por causar a formação de rugas precoces e reduzir a elasticidade da pele. Após a exposição ao UVB, o aumento das MMPs degrada o colágeno e outras proteínas de substrato [34]. Assim, trata-se de um tipo de ferida causada pela radiação solar sobre a pele, e nosso corpo se esforça para cicatrizar as feridas por meio da síntese de novo colágeno. No entanto, como o processo de cicatrização de feridas nem sempre é perfeito, a exposição contínua da pele ao UVB resultará em sintomas clínicos de envelhecimento, incluindo rugas.

Embora os melanócitos liberem um grande número de componentes solúveis, a prostaglandina E2, a prostaglandina F2a, o hormônio adrenocorticotrófico e o NO são considerados reguladores da melanogênese [35-38]. No entanto, os efeitos das citocinas no processo de melanogênese são bastante complicados. Por exemplo, entre a família IL, IL-1a/1b e fatores estimuladores de colônias de granulócitos-macrófagos estão envolvidos na estimulação da melanogênese; no entanto, IL-6, fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-b1) e fator de necrose tecidual a (TNF-a) suprimem a produção de melanina. Nossos resultados mostraram que IL-1b aumentou no grupo de controle irradiado com UVB, mas diminuiu significativamente com o tratamento com KRG. Em conclusão, KRG e creme KRG exibiram potentes propriedades anti-melanogênicas e de clareamento da pele e podem ser desenvolvidos em um agente cosmético disponível comercialmente

Conflitos de interesse

Agradecimentos

Apêndice A. Dados suplementares

Referências

[1] Brenner M, Audiência VJ. O papel protetor da melanina contra danos UV na pele humana. Photochem Photobiol 2008;84:539e49.

[2] Kim DS, Jeong YM, Park IK, Hahn HG, Lee HK, Kwon SB, Jeong JH, Yang SJ, Sohn UD, Park KC. Um novo 2-imino-1,3-derivado de tiazolina, KHG22394, inibe a síntese de melanina em células de melanoma B16 de camundongo. Biol Pharm Bull 2007;30:180e3.

[3] Kim DS, Kim SY, Park SH, Choi YG, Kwon SB, Kim MK, Na JI, Youn SW, Park KC. Efeitos inibitórios do 4-n-butil resorcinol na atividade da tirosinase e síntese de melanina. Biol Pharm Bull 2005;28:2216e9.

[4] Kim HR, Kim H, Jung BJ, You GE, Jang S, Chung DK. Ácido lipoteicóico isolado de Lactobacillus plantarum inibe a melanogênese em células de melanoma de camundongo B16F10. Mol Cells 2015;38:163e70.

[5] Goldstein B. Ginseng: sua história, dispersão e tradição popular. Am J Chin Med (Gard City NY) 1975;3:223e34.

[6] Chevallier A. Enciclopédia de plantas medicinais. São Leonardo. Nova Gales do Sul: Dorling Kindersley pty limitada; 1996.

[7] Kim BM, Kim DH, Park JH, Na HK, Surh YJ. Ginsenoside Rg3 induz apoptose de células de câncer de mama humano (MDA-MB-231). J Câncer Anterior 2013;18:177e85.

[8] Kim EK, Lee JH, Cho SH, Shen GN, Jin LG, Myung CS, Oh HJ, Kim DH, Yun JD, Roh SS. Preparação de Panax ginseng preto por novos métodos e sua atividade antitumoral. The Korea Journal of Herbology 2008;23:85e92.

[9] Saba E, Jeong DH, Roh SS, Kim SH, Kim SD, Kim HK, Rhee MH. Os extratos de Chong-Myung-Tang enriquecidos com ginseng preto melhoram o comportamento de aprendizado espacial em ratos e provocam efeitos anti-inflamatórios in vitro. J Ginseng Res 2017;41:151e 8.

[10] Saba E, Kim SH, Kim SD, Park SJ, Kwak DM, Oh JH, Park CK, Rhee MH. Alívio de complicações diabéticas por extrato de ginseng vermelho enriquecido com ginsenoside Rg3- em LDLe/camundongos alimentados com dieta ocidental. J Ginseng Res 2017;42:352e5.

[11] Saba E, Son Y, Jeon BR, Kim SE, Lee IK, Yun BS, Rhee MH. Ácido acetil eburicoico de laetiporus sulfurous var. miniaturas suprime a inflamação em macrófagos murinos RAW 264.7 células. Mycobiology 2015;43:131e6.

[12] Dai D, Zhang CF, Williams S, Yuan CS, Wang CZ. Ginseng no câncer: papel potencial na modulação da angiogênese mediada por inflamação. Am J Chin Med 2017;45:13e22.

[13] Saba E, Jeon BR, Jeong DH, Lee K, Goo YK, Kim SH, Sung CK, Roh SS, Kim SD, Kim HK, et al. Extrato de ginseng preto melhora a hipercolesterolemia em ratos. J Ginseng Res 2016;40:160e8.

[14] Christensen LP. Química dos ginsenosídeos, biossíntese, análise e possíveis efeitos na saúde. Adv Food Nutr Res 2009;55:1e99.

[15] Song M, Mun JH, Ko HC, Kim BS, Kim MB. Pó de ginseng vermelho coreano no tratamento do melasma: um estudo observacional não controlado. J Ginseng Res 2011;35:170e5.

[16] Cabanes J, Chazarra S, Garcia-Carmona F. O ácido kójico, um agente cosmético de clareamento da pele, é um inibidor de ligação lenta da atividade de catecolase da tirosinase. J Pharm Pharmacol 1994;46:982e5.

[17] Bissett DL, Hannon DP, Orr TV. Um modelo animal de pele envelhecida pelo sol: alterações histológicas, físicas e visíveis na pele de camundongos sem pêlos irradiados por UV. Photochem Photobiol 1987;46:367e78.

[18] Cardiff RD, Miller CH, Munn RJ. Coloração manual de hematoxilina e eosina de cortes de tecido de camundongos. Cold Spring Harb Protoc 2014;2014:655e8.

[19] Chang JY, Kessler HP. A coloração do tricrômico de Masson ajuda a diferenciar o miofibroma das lesões musculares lisas na região da cabeça e pescoço. J Formos Med Assoc 2008;107:767e73.

[20] Ohguchi K, Tanaka T, Iliya I, Ito T, Iinuma M, Matsumoto K, Akao Y, Nozawa Y. Gnetol como um potente inibidor de tirosinase do gênero Gnetum. Biosci Biotechnol Biochem 2003;67:663e5.

[21] Yokota T, Nishio H, Kubota Y, Mizoguchi M. O efeito inibitório da glabridina de extratos de alcaçuz na melanogênese e inflamação. Pigment Cell Res 1998;11:355e61.

[22] Jablonska-Trypuc A, Matejczyk M, Rosochacki S. Metaloproteinases de matriz (MMPs), as principais enzimas da matriz extracelular (ECM) na degradação do colágeno, como alvo para drogas anticancerígenas. J Enzyme Inhib Med Chem 2016;31: 177e83.

[23] Englaro W, Bertolotto C, Brunet A, Pagès G, Ortonne JP, Ballotti R. A inibição da via da proteína quinase ativada por mitógeno desencadeia a diferenciação celular do melanoma B16. Journal of Biological Chemistry 1998;273:9966e70.

[24] Tam I, Stepien K. Melanócitos - células pigmentadas imunocompetentes. Postepy Dermatologii I Alergologii 2007;24:188.

[25] Lee HJ, Lee WJ, Chang SE, Lee GY. A hesperidina, um antioxidante popular, inibe a melanogênese por meio da degradação do MITF mediada por erk1/2-. Int J Mol Sci 2015;16: 18384e95.

[26] Hu YH, Liu X, Jia YL, Guo YJ, Wang Q, Chen QX. Cinética inibitória dos ácidos clorocinâmicos na tirosinase de cogumelos. J Biosci Bioeng 2014;117:142e6.

[27] Masamoto Y, Ando H, Murata Y, Shiraishi Y, Tada M, Takahata K. Atividade inibidora da tirosinase de cogumelos de esculetina isolada de sementes de Euphorbia lathyris L. Biosci Biotechnol Biochem 2003;67:631e4.

[28] Wu M, Hemesath TJ, Takemoto CM, Horstmann MA, Wells AG, Price ER, Fisher DZ, Fisher DE. O c-Kit desencadeia fosforilações duplas, que acoplam a ativação e a degradação do fator essencial de melanócito Mi. Genes Dev 2000;14:301e12.

[29]Tobin DJ. Introdução ao envelhecimento cutâneo. Journal of Tissue Viability 2017;26:37e 46.

[30] Helfrich YR, Sachs DL, Voorhees JJ. Visão geral do envelhecimento e fotoenvelhecimento da pele. Dermatol Nurs 2008;20:177e83. teste 184.

[31] Fisher GJ, Kang S, Varani J, Bata-Csorgo Z, Wan Y, Datta S, Voorhees JJ. Mecanismos de fotoenvelhecimento e envelhecimento cronológico da pele. Archives of Dermatology 2002;138:1462e70.

[32] El-Domyati M, Attia S, Saleh F, Brown D, Birk D, Gasparro F, Ahmad H, Uitto J. Envelhecimento intrínseco versus fotoenvelhecimento: um estudo comparativo histopatológico, imunohistoquímico e ultraestrutural da pele. Experimental Dermatology 2002;11:398e405.

[33] Brennan M, Bhatti H, Nerusu KC, Bhagavathula N, Kang S, Fisher GJ, Varani J, Voorhees JJ. A metaloproteinase de matriz-1 é a principal enzima colagenolítica responsável por danos ao colágeno na pele humana irradiada por UV. Photochemistry and Photobiology 2003;78:43e8.

[34] Quan T, Qin Z, Xia W, Shao Y, Voorhees JJ, Fisher GJ. Metaloproteinases degradadoras de matriz no fotoenvelhecimento. J Investig Dermatol Symp Proc 2009;14:20e4.

[35] Gillbro JM, Olsson MJ. A melanogênese e os mecanismos dos agentes clareadores da pele - abordagens existentes e novas. Int J Cosmet Sci 2011;33:210e21.

[36] Roméro-Graillet C, Aberdam E, Clément M, Ortonne JP, Ballotti R. O óxido nítrico produzido por queratinócitos irradiados com ultravioleta estimula a melanogênese. Journal of Clinical Investigation 1997;99:635.

[37] Wakabayashi Y, Nakajima H, Imokawa G. Efeito anulador de modificadores de carboidratos ligados a N no fator de células-tronco e endotelina-1-estimulou a pigmentação epidérmica em equivalentes epidérmicos humanos. Journal of Dermatological Science 2013;69:215e28.

[38] Mizoguchi M. Desenvolvimento de melanócitos: com uma mensagem de encorajamento para jovens cientistas. Pigment Cell Res 2004;17:533e44.

Para mais informações: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501