A deficiência de Klotho intensifica a expressão induzida por hipóxia de IFN-/através da regulação positiva de RIG-I nos rins
Mar 25, 2022
Abstrato A hipóxia é uma via comum para a progressão do estágio finaldoenca renal.O gene I induzível por ácido retinóico (RIG-I) codifica uma RNA helicase que reconhece vírus, incluindo SARS-CoV2, que é responsável pela produção de interferon (IFN)-a/ para evitar a propagação da infecção viral. Recentemente, a ativação de RIG-l foi encontrada em condições hipóxicas, e a deficiência de klotho mostrou intensificar a ativação de RIG-I em cérebros de camundongos. No entanto, os papéis dessas funções na inflamação renal permanecem indefinidos. Aqui, para estudo in vitro, a expressão de RIG-I e IFN-a/ foi examinada em ratos normaisrim(NRK)-52Células E incubadas em condições hipóxicas (1 por cento de O2). Em seguida, o siRNA direcionado a RIG-I ou siRNA codificado foi transfectado em células NRK52E para examinar a expressão de RIG-I e IFN-a/ß sob condições hipóxicas. Também investigamos os níveis de expressão de RIG-I e IFN-a/ em 33rimamostras de biópsia diagnosticadas com nefropatia por lgA. Para o estudo in Vivo, induzimos hipóxia renal por clampeamento da artéria renal por 10 min em camundongos do tipo selvagem (camundongos WT) e camundongos Klotho-knockout (KIT/camundongos). A incubação em condições hipóxicas aumentou a expressão de RIG-lI e IFN-a/ em células NRK52E. Sua regulação positiva foi inibida em células NRK52E transfectadas com siRNA visando RIG-I. Em pacientes com nefropatia por IgA, a coloração imuno-histoquímica de amostras de biópsia renal revelou que a expressão de RIG-I estava correlacionada com a de IFN-a/ (r=0.57,P<0.001, and="" r=""><0.001, respectively).="" the="" expression="" levels="" of="" rig-i="" and="" ifn-a/β="" were="" upregulated="" in="">rinsde camundongos hipóxicos WT e mais regulação positiva foi observada em camundongos hipóxicos. Esses achados sugerem que a hipóxia induz a expressão de IFN-a/ através da regulação positiva de RIG-I e que a deficiência de klotho intensifica essa expressão induzida por hipóxia emrins.
Palavras-chave:doenca renal; células renais; substituição renal; dano renal; rim
CISTANCHE VAI MELHORAR A FUNÇÃO RENAL/RENAL
IntroduçãoCrônicadoenca renal(DRC) afetou 697,5 milhões de pessoas em todo o mundo em 2017 [1], por isso é bem reconhecido como um grande problema de saúde. Para retardar a progressão da DRC, inibidores da via do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) são usados em um ambiente clínico [2,3]. No entanto, seus efeitos benéficos são limitados e muitos pacientes eventualmente necessitam de terapia renal substitutiva[4]. Patologicamente, inflamação crônica e fibrose intersticial são as características comuns da DRC, independentemente da doença primária [5]. Embora o fator de crescimento transformador (TGF)- 1 desempenhe um papel fundamental no desenvolvimento da fibrose intersticial [6-8], estudos anteriores demonstraram que a infiltração de células inflamatórias é responsável pela produção de TGF{{12} } [9]. Esses achados sugerem que a inflamação é o evento a montante da fibrose intersticial e que a inflamação é um alvo terapêutico candidato para a DRC.
A hipóxia é uma condição na qual o oxigênio insuficiente chega aos tecidos. Como resposta celular à hipóxia, os fatores induzíveis por hipóxia (HIF) desempenham papéis importantes na prevenção de danos nos tecidos [10-12]. No entanto, hipóxia grave leva a doenças vasculares agudas, como acidente vascular cerebral [13], angina pectoris [14] e doença arterial periférica [15]. Recentemente, foi relatado que a hipóxia crônica, como a apneia do sono, também contribui para o desenvolvimento de várias doenças [16]. Sobre arim, a hipóxia supostamente se intensifica com a progressão do estágio da DRC e atualmente é considerada fisiopatologia comum levando ao estágio finaldoenca renal[17]. Como mencionado acima, a inflamação é considerada um evento a montante, portanto, o mecanismo pelo qual a hipóxia induz a inflamação deve ser esclarecido em nível molecular. A inflamação é caracterizada por dor, calor, vermelhidão, inchaço e perda de função[18]. No entanto, ele funciona basicamente para eliminar a causa inicial da lesão celular e para limpar as células necróticas e o tecido danificado. De qualquer forma, a inflamação não é uma resposta específica, e considera-se que a imunidade inata participa principalmente do processo inicial da inflamação através da produção de interferon (IFN)- / [19]. Entre os fatores envolvidos na imunidade inata, um gene I induzível por ácido retinóico (RIG-I) é responsável pelas respostas imunes a infecções virais[20. Notavelmente, estudos recentes demonstraram que a hipóxia aumenta a expressão de RIG-I no cérebro e no fígado, resultando na produção de IFN-/ [21,22]. No entanto, o papel da hipóxia na expressão de IFN-/B mediada por RIG-I narimpermanece indescritível.
Klotho foi relatado pela primeira vez como uma proteína antienvelhecimento [23]. De fato, camundongos deficientes em klotho exibem um tempo de vida reduzido acompanhado por fenótipos semelhantes ao envelhecimento humano. Em contraste, os camundongos transgênicos klotho mostram uma vida útil prolongada [24]. Em termos de efeitos renoprotetores, descobriu-se que a deficiência de klotho intensifica o dano renal em modelos experimentais de doenças renais, enquanto a superexpressão de klotho ou a administração da proteína klotho melhora [25]. A proteína Klotho existe em três formas: membrana, secretada e koto intracelular. Entre estes, klotho intracelular é relatado para suprimir a expressão de RIG-I juntamente com inflamação [26], levantando a possibilidade de que a deficiência de klotho exacerba a regulação positiva induzida por hipóxia de RIG-I e IFN- / emrins.Esses achados nos levaram a supor que a expressão de RIG-I e IFN-/ aumentou sob condições hipóxicas em uma linhagem de células tubulares renais e que sua regulação positiva induzida por hipóxia foi intensificada em camundongos Klotho-knockout (KI-7 ratos). Neste estudo, mostramos que a hipóxia aumenta o RIG-I, bem como o IFN-a/ em ratos normaisrimcélulas (NRK-52E) e rins de camundongos. Também mostramos que RIG-I é responsável pela regulação positiva induzida por hip-óxia de IFN-c/B. Em humanos reaisrimamostras de pacientes diagnosticados com nefropatia por IgA, a expressão de RIG-I foi correlacionada positivamente com IFN-/. Por fim, a regulação positiva de RIG-I e IFN-/ induzida por hipóxia foi intensificada em camundongos KI-/-. Esses achados sugerem que a deficiência de klotho intensifica a expressão induzida por hipóxia de IFN-/ através da regulação positiva de RIG-I emrins.
CISTANCHE VAI MELHORAR A INSUFICIÊNCIA RENAL/RENAL
Materiais e métodos AnimaisCamundongos machos C57BL/6J de tipo selvagem (WT) (com 8 semanas e pesando 20-25 g) foram obtidos de Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japão). Camundongos machos (com 6 semanas de idade e pesando aproximadamente 15 g) foram adquiridos da CLEA Japan, Inc. Os camundongos foram alojados no Instituto de Ciência Animal de Laboratório da Universidade de Hiroshima (Hiroshima, Japão), conforme descrito anteriormente [27]. Todos os experimentos foram aprovados por o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Hiroshima (números de autorização: A19-158 e 2019-156) e foram realizados de acordo com as Diretrizes do National Institutes of Health (NIH) sobre o uso de animais de laboratório. Os camundongos WT e KI foram divididos em um grupo controle ou um grupo de hipóxia (n=5em cada grupo). Condições hipóxicas foram induzidas por pinçamento da artéria renal esquerda por 1{13}} min sob anestesia geral (0,3 mg/kg de medetomidina, 4 mg/kg de midazolam e 5 mg/kg de butorfanol)[28]. Os camundongos do grupo controle foram submetidos a uma operação simulada que foi o mesmo procedimento dos camundongos do grupo hipóxia, exceto pela falta de ligadura da artéria. Após 10 minutos de hipóxia, os camundongos foram eutanasiados por punção cardíaca e seusrinsforam colhidos. Hipóxia dorimfoi confirmado por Western blotting para expressão de eritropoietina (Fig. S1).
Cultura de célulasO rato normalrim(NRK)-52As células E foram adquiridas da American Type Culture Col. lection (Manassas, VA, EUA).NRK-52As células E foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10 por cento fetal soro bovino (FBS) (Nichirei Bioscience, Tóquio, Japão) e penicilina/estreptomicina (Nacalai Tesque, Kyoto, Japão). Estas clls foram semeadas em placas de cultura de 10 cm. Depois de crescer até a subconfluência, as células foram incubadas em uma câmara de incubadora modular de O2 a 1 por cento (MIC 101; Billups-Rothenberg, San Diego, CA, EUA) por 30,60,90 e 120 min. Os lisados de células inteiras foram preparados e submetidos para análise de western blot. Hipóxia de células NRK-52E foi confirmada por Western blotting para expressão de HIF-1 (Fig. S2).
Transfecção de siRNA RIG-IAs células NRK52E foram transfectadas com 20 nM de siRNA direcionado a RIG-I (RSS311418: Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) ou siRNA de controle negativo (4390843; Applied Biosystems, Waltham, MA, EUA) usando Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific) , de acordo com as instruções do fabricante. Após 43-45 h, algumas dessas células foram incubadas sob condições hipóxicas (1 por cento de O) por 30 min para avaliar RIG-I. As outras células foram mudadas para um meio fresco. Após 24 h, essas células foram incubadas sob condições hipóxicas (1 por cento O2) por 60 e 120 min para confirmar a supressão de IFN-a/. Os lisados de células inteiras foram preparados e submetidos a análise de Western blot.
Análise de Western BlotA coleta de amostras e western blotting foram realizados de acordo com os métodos descritos anteriormente[29]. Anticorpo monoclonal anti-RIG-I de coelho (#3743S; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), anticorpo policlonal anti-IFN- 11 de coelho (bs-7023R; Bioss Anti-bodies, Woburn, MA, EUA), anticorpo policlonal de coelho anti-IFN- (GTX37658; GeneTex, Irvine, CA, EUA), anticorpo monoclonal de coelho anti-RIG-I (=700366; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), policlonal de coelho anticorpo anti-IFN- 2 (ab193055; Abcam, Cambridge, Reino Unido), anticorpo policlonal de coelho anti-IFN-(PA5-20390; Invitrogen), anticorpo monoclonal de rato anti-klotho humano (KO603; TransGenic, Fukuoka , Japão), anticorpo monoclonal de camundongo anti- -actina (A5316; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, EUA) e anticorpo monoclonal de camundongo anti- -tubulina (T9026; Sigma-Aldrich) foram usados como anticorpos primários. A imunoglobulina G de cabra anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano (Dako, Glostrup, Dinamarca) e a imunoglobulina G de cabra anti-camundongo (Dako) foram usadas como anticorpos secundários. O SuperSignal West Dura e o sistema Pico (Thermo Fisher Scientific) foram usados para detectar os sinais. A intensidade de cada banda foi medida pelo software ImageJ (versão 1.47y; National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA) e normalizada para o nível de -actina ou -tubulina.
CISTANCHE VAI MELHORAR A DOENÇA RENAL/RENAL
Análise imuno-histoquímica de tecido renal de camundongoA coloração imuno-histoquímica foi realizada de acordo com métodos previamente descritos [27]. Como anticorpos primários, foram aplicados os seguintes produtos: anticorpo monoclonal de coelho anti-RIG-I (#700366; Invitrogen), anticorpo policlonal de coelho anti-IFN- 2 (ab193055; Abcam), anticorpo policlonal de coelho anti-IFN ( PA5-20390; Invitrogen) e anticorpo monoclonal anti-klotho humano de rato (KO603; TransGenic). As áreas RIG-I-,IFN-a/ - e klotho-positivas foram quantificadas como a média de 20 campos selecionados aleatoriamente com software ImageJ.
Coleta de amostras clínicas e declaração de éticaAmostras de rim foram obtidas por biópsia renal no Hospital Universitário de Hiroshima entre agosto de 2014 e novembro de 2016 de 33 pacientes que foram diagnosticados com nefropatia por IgA. Este estudo aderiu aos princípios incorporados na Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Hiroshima(E-1718), o consentimento informado foi obtido na forma de opt-out em um site(httns:/inzounaika Hiroshima-uaciplresearchl opt out.html).
Análise imuno-histoquímica do tecido renal humanoA imunocoloração foi realizada de acordo com métodos previamente descritos [27]. Os seguintes anticorpos primários foram usados: anticorpo monodonal anti-RIG-I de coelho (#700366; Invitrogen), anticorpo monoclonal anti-IFN de camundongo (sc-373757; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA) e coelho Anticorpo policlonal anti-IFN-(PA5-20390; Invitrogen), áreas positivas para RIG-I e IFN-a/ foram quantificadas como a média de cinco campos selecionados aleatoriamente com o software Image].
Análise estatísticaOs resultados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). As correlações foram calculadas por meio de análise de regressão univariada. Para comparações múltiplas, utilizou-se a análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste t de Student com correção de Bonferroni. As diferenças entre os dois grupos foram analisadas pelo teste t de Student.P<0.05 was="" considered="" as="" statistically="">
Resultados:Hipóxia regula positivamente RIG-I e IFN-a/ em uma linhagem de células epiteliais renais de ratoPara identificar o efeito da hipóxia na expressão de RIG-I e IFN-a/ in Vitro, realizamos análise de Western blot para essas proteínas em células NRK-52E cultivadas em condições hipóxicas. O nível de proteína de RIG-I atingiu o pico em 30 min e depois diminuiu gradualmente nas células NRK-52E sob estimulação hipóxica （Fig 1A）. Os níveis de IFN-/ß aumentaram e atingiram o pico em 120 e 60 min, respectivamente, em NRK -52Células E com estimulação hipóxica (Eig 1Band1C). Knockdown de RIG-I reduz a expressão de IFN-a/ em células NRK52E com hipóxia RIG-I siRNA ou negativo
controle siRNA. Primeiro, confirmamos o efeito knockdown do RIG-siRNA em células NRK-52E. Western blotting para RIG-I revelou que RIG-I siRNA regulou negativamente a expressão de RIG-I em células NRK-52E com ou sem estimulação hipóxica (Eig 2A). Em seguida, investigamos o papel da regulação positiva induzida por hipóxia de RIG -I na expressão de IFN- /B em células NRK{10}}E usando RIG-I siRNA ou controle negativo. RIG-siRNA suprimiu a expressão de IFN- / em NRK-52Ecells (Eig2Band2C).
RIG-I correlaciona-se com os níveis de expressão de IFN-/ em amostras de rim humano de nefropatia por IgAExaminamos se o nível de expressão de RIG-I está associado ao IFN-a/ em amostras de biópsia renal obtidas de pacientes com nefropatia por IgA (n=33). As características clínicas detalhadas desses pacientes são mostradas na Tabela S1. A coloração imuno-histoquímica para RIG-I e IFN-/ revelou sua expressão em glomérulos e túbulos renais (Fig 3A), e mostrou que RIG-I está positivamente correlacionado com IFN-o/ (r=0.57,P<0.001, and="" r=""><0.001, respectively)(eig="">
A hipóxia não altera o nível de expressão de klotho em WT e K1-/ camundongosPara determinar o efeito da estimulação hipóxica na expressão de klotho in vivo, investigamos sua expressão em WT e K-/camundongos com ou sem 10 min de estimulação hipóxica. Western blotting e coloração imuno-histoquímica revelaram que a expressão de klotho não diferiu entre camundongos WT com e sem hipóxia e que a expressão de klotho não foi observada em KIT/camundongos, independentemente da presença ou ausência de estimulação hipóxica (Eig 4A e 4B). Nos camundongos WT, klotho proteína foi corada no citoplasma das células tubulares (Fig. 4B).A expressão de RIG-I é intensificada sob condições hipóxicas em camundongos K~.O klotho intracelular supostamente confere a capacidade de suprimir a inflamação mediada por RIG-I, por isso examinamos o nível de expressão e a localização de RIG-I em hipóxiarinsde camundongos WT e Kl−/−. Western blotting revelou que a expressão de RIG-I aumentou em camundongos WT com estimulação hipóxica e que foi intensificada em camundongos Kl-/- (Fig 5A). A imunohistoquímica mostrou que a área positiva para RIG-I aumentou em camundongos Kl−/−, o que foi semelhante aos resultados obtidos por Western blotting (Fig. 5B).
IFN- é regulado positivamente sob condições hipóxicas em camundongos KI--Para identificar os efeitos da hipóxia na expressão de-a em wvo, examinamos seu nível de expressão e localização em camundongos hipóxicos WT e KI. Western blotting revelou que a expressão de IFN- aumentou em camundongos WT com estimulação hipóxica e que foi ainda mais regulada em camundongos (Fig 6A). A coloração imuno-histoquímica também revelou que a área positiva de IFN- -foi observada principalmente em células tubulares, e que o nível de expressão de IFN- mostrou a mesma tendência que no Western blotting (Fig. 6B).
IFN- é aumentado sob condições hipóxicas em K1T-/camundongosAlém de IFN-c, examinamos o nível de expressão e localização de WT hipóxico de IFN-Bin e camundongos. A partir dos resultados de Western blotting, a expressão de IFN- aumentou em camundongos WT com estimulação hipóxica, enquanto um aumento adicional foi observado em KIT/camundongos (Fig 7A). Ao quantificar a área positiva de IFN- -, o nível de expressão de IFN- aumentou em camundongos KI-/- em comparação com o de camundongos WT'(Fig 7B).
observado em camundongos Kl−/− independentemente da presença de estimulação hipóxica. Mostramos que a hipóxia renal aumentou a expressão de RIG-I e IFN-/ e que sua expressão foi ainda mais intensificada em camundongos Kl−/−. Esses achados sugeriram que a deficiência de klotho intensificou a expressão de RIG-I induzida por hipóxia, resultando na regulação positiva de IFN-/. Identificamos que a hipóxia induziu a expressão de RIG-I e IFN-/ em estudos in vitro e in vivo. Para se adaptar às condições hipóxicas, o HIF é estabilizado e funciona como um fator de transcrição [30]. Em um estudo anterior, foi relatado que o RIG-I está envolvido em moléculas induzíveis por HIF. No entanto, não conseguimos identificar que o RIG-I é um efetor a jusante do HIF. Além da infecção pelo vírus, a expressão de RIG-I aumenta em condições hipóxicas [31]. Embora estudos anteriores tenham relatado que a hipóxia afeta células epiteliais tubulares, células endoteliais, pericitos, fibroblastos, células inflamatórias e células progenitoras nos rins [32,33], mostramos que a regulação positiva de RIG-I foi observada principalmente em células epiteliais tubulares em camundongos com estimulação hipóxica, bem como em pacientes com nefropatia por IgA. Como os túbulos renais são considerados como um local de entrada de patógenos transuretrais [34], o RIG-I pode desempenhar um papel fundamental na resposta imune das células epiteliais tubulares sob condições hipóxicas. A resposta imune inata é ativada não apenas por microorganismos, mas também por sinais de alarme de células danificadas, feridas ou estressadas. Neste estudo, mostramos que a expressão de RIG-I induzida por hipóxia participou da produção de IFN-/ em uma linhagem celular de túbulos renais de rato. Os dados apresentados sugerem que a expressão de RIG-I funciona como o sistema imune inato do citosol em resposta ao estresse hipóxico, bem como à infecção por vírus. Estudos anteriores descreveram que a hipóxia aumenta durante o desenvolvimento da DRC independentemente da doença primária e que a hipóxia contribui para a progressão do dano renal [17]. Em um estudo clínico usando ressonância magnética dependente do nível de oxigenação do sangue, a hipóxia renal não apenas se intensificou durante a progressão da DRC, mas também previu tal progressão [36]. Assim, a hipóxia é atualmente considerada como a via comum para a progressão da doença terminal.doenca renal, portanto, a inflamação induzida por hipóxia deve ser um alvo terapêutico para suprimir a progressão da DRC.
Mostramos que a hipóxia induz a produção de IFN-/ , que são classificados como interferons do tipo 1. Os interferons do tipo 1 funcionam basicamente para inibir a replicação viral [37] e para resistir à imunossupressão induzida por hipóxia [21,22]. No entanto, estudos realizados até o momento relataram que os interferons do tipo 1 levam à ativação de células natural killer, desempenhando um papel importante não apenas na remoção de células infectadas por vírus, mas também no dano tecidual [38]. De fato, estudos anteriores relataram que o RIG-I contribui para a inflamação em vários órgãos, como o pulmão [39],rim[40], e o sistema nervoso [21]. Neste estudo, também mostramos que a regulação positiva de RIG-I induzida por hipóxia é responsável pela produção de IFN-/. Assim, os interferons do tipo 1 podem funcionar para proteger contra a infecção em um estado de hipóxia, mas seriam prejudiciais sob condições não infectadas. Além disso, um estudo anterior relatou que, além dos interferons tipo 1, o RIG-I está envolvido na produção de várias citocinas, como IL-1 , IL- 6 e TNF- [41]. Como essas citocinas causam dano tecidual, a regulação positiva de RIG-I induzida por hipóxia pode participar da progressão da DRC. Mostramos que a deficiência de klotho aumenta a expressão de RIG-I induzida por hipóxia, que é acompanhada pela regulação positiva de IFN-/. A expressão de Klotho diminui com o envelhecimento e a progressão da DRC [42,43]. Portanto, a expressão de RIG-I pode ser mais regulada em idosos e pacientes com DRC em condições hipóxicas, levando à produção de IFN-/. Como mencionado acima, klotho existe em três formas - membrana, secretado e klotho intracelular - sendo este último responsável por suprimir a produção mediada por RIG-I de citocinas inflamatórias [26]. Em termos de localização, mostramos que a expressão de klotho ocorre principalmente nas células tubulares renais, com evidências de que a expressão de RIG-I é intensificada principalmente nas células tubulares renais sob condições hipóxicas. Esses achados sugerem que um nível diminuído de expressão de klotho contribui para a produção aumentada mediada por RIG-I de interferons tipo 1 sob condições hipóxicas.
CISTANCHE VAI MELHORAR A DOR RENAL/RENAL
Em resumo, mostramos que a estimulação hipóxica induziu RIG-I e IFN-/ em rins de camundongos e uma linhagem de células tubulares renais de rato, e que RIG-I estava envolvido na hipóxia induziu regulação positiva de IFN-/ em experimentos in vitro. Em amostras de biópsia renal de pacientes com nefropatia por IgA, a expressão de RIG-I correlacionou-se com a regulação positiva de IFN-/. Por último, a expressão de RIG-I induzida por hipóxia foi intensificada em camundongos Klotho-knockout, juntamente com a regulação positiva de IFN-/. A expressão mediada por RIG-I de interferon tipo 1 aumentou sob condições hipóxicas, e uma regulação positiva adicional foi observada em um estado de regulação negativa de klotho. De acordo com estudos clínicos, a hipóxia é exacerbada com o estágio avançado da DRC [36] e é preditiva da progressão a longo prazo da DRC [36]. Além disso, a expressão de klotho diminui com o declínio da função renal, e a redução da expressão de klotho está associada a danos renais [44]. Neste estudo, mostramos que a deficiência de klotho intensifica a expressão de IFN-/ induzida por hipóxia através da regulação positiva de RIG-I nos rins e que a expressão de RIG-I está associada à de IFN-/ em pacientes reais com nefropatia por IgA. Juntando esses achados, tanto a hipóxia quanto a redução do klotho são promovidas durante a progressão da DRC e, portanto, a ativação da imunidade inata é aumentada em pacientes com DRC.
