Deficiência do fator de transcrição mitocondrial direcionado ao epitélio renal resulta em depleção mitocondrial progressiva associada à doença cística grave
Mar 23, 2022
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Ken Ishii, Hanako Kobayashi, Kensei Taguchi & et al.
INTRODUÇÃO
A disfunção mitocondrial (mt) é uma característica patológica bem reconhecida de doenças renais comuns e pode desencadear lesão celular, inflamação e fibrose. No rim, as células epiteliais tubulares são altamente dependentes do trifosfato de adenosina (ATP) gerado a partir da fosforilação oxidativa (OXPHOS) porque realizam múltiplas funções de transporte epitelial que consomem energia. Portanto, a manutenção da produção eficiente de mt ATP é essencial para a função renal normal e a homeostase sistêmica dos eletrólitos. Além disso, evidências recentes indicam que as mitocôndrias têm um papel importante na regulação gênica, sinalização celular e diferenciação celular por meio da geração de metabólitos intermediários e espécies reativas de oxigênio (ROS).2 Apesar desses avanços, o papel da sinalização mt na patogênese da doenças renais comuns não é bem compreendida.
Para investigar a função mt na homeostase e patogênese renal,fator de transcrição mitocondrial alvo A(TFAM). TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)é um fator de codificação nuclear essencial para a função mt, manutenção do número de cópias mt e estabilidade estrutural do DNA mt porque regula a replicação e transcrição do genoma mt pela dobra do DNA promotor.3 O DNA mt de mamífero contém 37 genes,13 dos quais codificam subunidades proteicas do complexo da cadeia respiratória, 22 codificam RNAs de transferência e 2 RNAs ribossômicos. Desta forma,TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)está diretamente envolvido na regulação do transporte de elétrons mt e síntese de ATP através da transcrição de genes como citocromo b codificado mitocondrialmente (MT-CYB), subunidade 1 da citocromo c oxidase codificada mitocondrialmente (MT-CO1) e subunidade de membrana ATP sintase codificada mitocondrialmente 6 (MT-ATP6). 3 SemTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A), as células perdem sua capacidade de produzir ATP via OXPHOS, não podem gerar quantidades significativas de mt ROS e tornam-se progressivamente depletadas de mitocôndrias.-Estudos genéticos mostraram queTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)é essencial para a embriogênese normal porque homozigotos globaisTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)a inativação resultou em letalidade intrauterina no dia embrionário 10,5, enquanto a deficiência heterozigótica, embora tenha reduzido o número de cópias mt em -40 por cento e levado à deficiência da cadeia respiratória, não levou à letalidade embrionária. Assim, o direcionamento genético deTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A) é uma estratégia experimental útil para examinar o papel da disfunção progressiva de mt na diferenciação celular e homeostase tecidual. Inativação condicional específica do tipo de célula deTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)sugeriram que a geração de OXPHOS e/ou mt ROS é crítica para a diferenciação celular, função e fisiologia normal.-1o
Os distúrbios primários de mt devido a mutações no gene mt ou nuclear podem apresentar doença renal mais comumente manifestada como lesão tubulointersticial ou disfunção tubular isolada.1,12 Embora implicados na patogênese de certas doenças humanas, como distúrbios neurodegenerativos, mutações específicas no TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)causando doença renal não foram relatados. Mais recentemente, reduzidoTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)expressão tem sido associada à doença renal crônica. Perda de integridade mt devido aTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)a inativação causou doença tubulointersticial e insuficiência renal em camundongos, que foi parcialmente devido à ativação de respostas inflamatórias dependentes de genes de interferon (STING) induzidas por estresse de mt DNA cíclico GMP-AMP sintase (cGAS).
Aqui relatamos que camundongos comTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A) inativação em células progenitoras de néfrons expressando homeobox 2(SIX2) relacionadas ao sine oculis desenvolvem doença cística grave e morrem prematuramente de insuficiência renal como camundongos juvenis jovens.TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/-camundongos foram caracterizados por defeitos na maturação dos néfrons, que foi associado à depleção de mt, redução de OXPHOS e uma mudança metabólica em direção à glicólise emTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-7-epitélio renal. Dada a gravidade da doença cística emTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-7-camundongos, analisamos dois modelos de camundongos de doença renal policística (PKD), que resultam de mutações em policistina-1 (Pkd1) ou cistina-1 (Cys1), bem como em humanos tecidos de pacientes com doença renal policística autossômica dominante (ADPKD). Estabelecemos queTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)é desregulada em cistos de tecidos PKD murinos e humanos. Em conjunto, nossos estudos sugerem que o TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)desregulação e depleção de mt são características das doenças císticas renais e podem ter um papel contributivo em sua patogênese.
RESULTADOS
TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)inativação em células da linhagem SIX2 causa doença cística grave resultando em insuficiência renal
Para investigar a função mt no epitélio renal, inativamosTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)em SEIS2-células progenitoras expressando, que dão origem a todos os segmentos de néfrons, exceto o ducto coletor (CD).15Para isso, cruzamos oTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)alelo floxed com camundongos transgênicos de cromossomo artificial bacteriano que expressam uma proteína de fusão de proteína fluorescente verde/proteína de recombinase Cre (eGFP/Cre) sob controle transcricional do promotor Six2 (Figura la).TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)alelo floxed e heterozigoto para o transgene eGFP/Cre (Six2-eGFP/Cre plus; T fam) são daqui em diante referidos como Six2-Tfam-/- mutantes. Seis camundongos2-Tfam-/- nasceram nas proporções mendelianas esperadas e não foram distinguíveis dos controles Cre-litermate por inspeção visual no nascimento. No entanto, as diferenças de peso corporal entre Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A){{0}}mutantes e controles Cre- ninhada tornaram-se aparentes no dia pós-natal(P)14(5,7±0,3g para mutantes vs.7,5±0,3g para controles,n{{11} } cada, P=0.004; Tabela Complementar S1). Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A) camundongos mutantes foram caracterizados por rins aumentados em comparação com controles (relação rim/peso corporal de 1,45 por cento ± 0,19 por cento para mutantes vs.0,60 por cento ±0,02 por cento para controle , n=4 cada, P<0.001; figure="" lb,="" supplementary="" table="" s1)and="" died="" between="" age="" p20="" and="" p30(figure="" lb).="" juvenile="" lethality="" in="" the="" mutant="" cohort="" was="" associated="" with="" renal="" failure="" from="" severe="" cystic="" disease="" with="" blood="" urea="" nitrogen="" levels="" of="" 68.40±5.32="" mg/dl="" for="" mutant="" mice="" versus="" 16.8±2.0mg="" dl="" for="" controls(n="6" and="" 7,="" respectively;=""><0.0001; figure="" lb="" and="" c).="" furthermore,="">TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-7- mutantes desenvolveram albuminúria significativa (proporção albumina/creatinina na urina=362,4 ± 75,18 mg/g em seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)--mutantes vs. 43,58±3,39 mg/g em controles em P14, n=6 e 10 respectivamente;P<0.0001). this="" is="" consistent="" with="" the="" expression="" pattern="" of="" cre="" recombinase="" in="" six2="" nephron="" progenitor="" cells,="" which="" give="" rise="" to="" cap="" mesenchyme-derived="" renal="" tubules="" and="" podocytes.="" in="" contrast="" to="">TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-'mutantes, camundongos com heterozigoseTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)deficiência em células progenitoras SIX2 desenvolvidas normalmente eram férteis e não desenvolveram doença renal evidente (Figura S1 suplementar).
Figura 1|A inativação de Tfam em células da linhagem SIX2 resulta em doença cística grave e insuficiência renal.(a) Um esquema ilustrando a abordagem experimental e localização de sequências direcionadas dentro do alelo Tfam floxed. Análise da reação em cadeia da polimerase do DNA genômico total do rim isolado de controle de ninhada (Cre ) e Seis {{0}}Tfammice na idade pós-natal (P) 7; o alelo floxed Tfam não recombinante é denotado por 2-lox (2); o alelo recombinado por 1-lox, o alelo de tipo selvagem por wt; þ ou - indicam a presença ou ausência do transgene Six2-eGFP/Cre. (b) Painéis da esquerda, fotografias de rins de controle Cre e Six2-camundongos Tfam na idade P20. Os pesos renais (KWs) são expressos como uma porcentagem do peso corporal (BW) (n ¼ 4–14). Painéis à direita, níveis de nitrogênio ureico no sangue (BUN) no controle de ninhada Cre (co) e Six2-camundongos Tfam na idade P7 (n ¼ 7 e 6, respectivamente) e curvas de sobrevivência Kaplan-Meier para controle Cre e Six{ {16}}Camundongos Tfam comparados com o teste log-rank (n ¼ 10–13). (c) Imagens representativas de seções renais embebidas em parafina e fixadas em formalina de camundongos Cre controle e Six2-Tfam na idade P7 e P29 coradas com hematoxilina e eosina (H&E) e analisadas por imuno-histoquímica para actina de músculo liso (ACTA2) e antígeno de diferenciação de cluster (CD) 31. Os sinais numéricos representam estruturas císticas e os asteriscos representam glomérulos. Barras de ¼ 1 mm para cortes transversais de rim inteiro, 100 mm para imagens H&E de alta potência e 50 mm para imagens IHC. Os dados são expressos como SEM média e foram analisados pelo 2-teste t de Student com cauda. ***P < 0,001.="" para="" otimizar="" a="" visualização="" desta="" imagem,="" consulte="" a="" versão="" online="" deste="" artigo="">www.kidney-international.org.
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A análise de Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/-camundongos, que também expressaram o alelo repórter ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre, aqui referido como Six2-mT/mG;TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-7 camundongos, indicando que a grande maioria das estruturas císticas emTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/-rins (Figura complementar S3). Esses achados são consistentes com níveis aumentados de quinase regulada por sinal extracelular fosforilado (p-ERK) e -catenina em Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/- tecido renal (Figura complementar S3). Juntos, nossos dados indicam que Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/ os rins exibem características moleculares frequentemente associadas a doenças císticas renais.
A maturação do néfron é defeituosa em seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/camundongos Porque pode levar várias semanas antes que os camundongos com tecido específicoTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)inativação desenvolve patologia, examinamos em seguida o curso de tempo de desenvolvimento da doença renal em Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A){{0}}ratos. Coletamos rins de camundongos controle e mutantes nas idades P0, P7 e P14 e usamos métodos histológicos, coloração de imunofluorescência (IF) e análise de expressão gênica em extratos renais inteiros para avaliação. A coloração IF para SIX2 e E-caderina na idade P0 demonstrou que os rins do controle e Sic2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/- foram histologicamente semelhantes. A formação de estruturas de zonas nefrogênicas corticais, como SIX2 mais mesênquima cap, pontas ureterais que expressam E-caderina e estruturas de néfrons nascentes, como vesículas renais e corpos em forma de vírgula e em forma de S, não foi bloqueada em Six{{7} }TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-7- rins (Figura 2a). Esses achados histológicos foram consistentes com os níveis de expressão de genes que codificam marcadores nefrogênicos. Six2, caixa pareada 2 (Pax2), proteína LIM homeobox 1 (Lhx1) e fator de transcrição tipo spalt 1(Sall)mRNA níveis não foram significativamente diferentes entre controle e Six2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/camundongos em homogeneizados renais totais de rins P0 (Figura 2b). Isso sugeriu queTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)a inativação em progenitores de néfrons SIX2 não teve impacto significativo na formação de estruturas nefrogênicas.
Figura 2|A maturação do Nephron é defeituosa em Six2-Tfam-7camundongos.(a) Imagens representativas de seções fixadas em formalina e embebidas em parafina do controle Cre~ e Seis2-Tfam-/rins na idade pós-natal (P) 0. As secções renais foram coradas com azul de toluidina e analisadas por imunofluorescência para a expressão de homeobox 2 (SIX2) e E-caderina (ECAD) relacionada com o sine oculis. As árvores ureterais são delineadas por linhas brancas tracejadas. Cap mesênquima (CM), corpo em forma de vírgula (CSB), corpo em forma de S (SSB) e ponta ureteral (UT) são anotados. (b) Painel esquerdo, níveis de expressão de mRNA relativos de marcadores de desenvolvimento por uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em homogeneizados renais totais de seis2-Tfam-/mutantes na idade PO em comparação com controles de ninhada Cre (n =6 cada ). Painel direito, glomerular relativa (glom) e expressão gênica específica do segmento de néfrons em homogenatos renais totais de seis 2-mutantes Tfam7 na idade P7 em comparação com controles Cre-litermate (n =4 cada). PT, túbulo proximal; mTAL, ramo ascendente espesso de Henle; DT, túbulo distal; CD, duto coletor. (c) Secções renais coradas com azul Alcian/ácido periódico de Schiff (AB-PAS) na idade P0, P7 e P14. As setas indicam túbulos positivos para PAS com borda em escova, asteriscos representam glomérulos e sinais numéricos representam túbulos císticos, Barras=100 um para imagens AB-PAS e 50 um para imagens coradas com azul de toluidina e imagens IF. Os dados são expressos como média± SEM;2-teste t de Student caudal;*P<><><0.001.agp1,aquaporin 1;agp2,aquaporin="" 2;lhx1,lim="" homeobox1;napi2a,="" sodium-phosphate="" cotransporter="" 2a;="" ncc,="" thiazide-sensitive="" sodium-chloride="" cotransporter;="" nkcc2,="" sodium-potassium-chloride="" cotransporter="" 2;pax2,="" paired="" box="" 2;="" sall1,="" spalt="" like="" transcription="" factor="" 1;="" scnn1a,="" epithelial="" sodium="" channel="" 1="" alpha="" subunit;="" trpv5,="" transient="" receptor="" potential="" cation="" channel="" subfamily="" v="" member="" 5;="" umod,="" uromodulin.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">www.kidney-international.org.
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Embora a formação da estrutura do néfron nascente não tenha sido inibida, a coloração com azul alcian/ácido periódico-Schiff e lectina de lótus tetragonolobus indicou maturação de néfron terminal defeituosa em Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A){{0}}ratos na idade P0. Alcian blue/ácido periódico-Schiff, que cora membranas basais tubulares e borda em escova, e lectina de lótus tetragonolobus, que identifica oligossacarídeos específicos na borda em escova das células do túbulo proximal, foram ambos diminuídos em rins mutantes. A Figura 2c mostra a coloração de alcian blue/ácido periódico-Schiff nos pontos de tempo P0, P7 e P14. A histoquímica da lectina de Lotus tetragonolobus e a coloração IF para a proteína do tumor de Wilms 1 nos pontos de tempo P0, P7 e P14 são mostradas na Figura Suplementar S4. Na idade PO, a área relativa que corou positivamente com lectina de tetragonolobus de lótus foi de 2,10 por cento ±0,51 por cento e 0,39 por cento ± 0,1 por cento em idade P7 versus 6,25 por cento ± 0,28 por cento e 6,2 por cento ± 1,1 por cento para controles, respectivamente (n=3-4,P=0,0004 e 0,0007, respectivamente; Figura complementar S4). Consistente com esses achados histológicos é a diminuição significativa na expressão de genes que codificam marcadores específicos de segmentos glomerulares e néfrons podocina, nefrina, aquaporina 1 (Agp1), cotransportador de sódio-fosfato 2a (NaPi2a), uromodulina, cotransportador sódio-cloreto de potássio 2 (Nkcc2) e cotransportador de cloreto de sódio sensível a tiazida (Ncc) em seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/ camundongos (Figura 2b). Juntos, esses dados sugerem que Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/- rins exibem uma redução progressiva no número de segmentos de néfrons proximais maduros e glomérulos.
Como a atividade de seis2-eGFP/Cre resulta emTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-segmentos de néfrons derivados do mesênquima cap deficiente, previmos que a maturação das células epiteliais CD, que são derivadas do broto ureteral, não seria afetada em Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/ rins. Consistente com esta noção é que a coloração com aglutinina de Dolichos biflorus, que reage com N-acetil-D-galactose no túbulo distal e CD, indicou uma sobre-representação relativa de estruturas positivas para aglutinina de Dolichos biflorus em Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/- rins. Na idade P7, as áreas coradas positivamente para aglutinina de Dolichos biflorus compreendiam 13,91 por cento ±0,9 por cento da área total para mutantes versus 1,93 por cento ± 0,1 por cento para o controle (n {{11} }, P=0.0002; Figura complementar S4). A expressão de mRNA da subunidade 1 alfa epitelial do canal de sódio (Scnnla) ou aquaporina 2 (Agp2), ambas expressas em células epiteliais CD, não foi significativamente diminuída em comparação com o controle (Figura 2b). Em contraste com Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/-rins,TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)inativação em células progenitoras homeobox B7(HOXB7), que dão origem a células epiteliais CD, resultando na perda da expressão do marcador de néfrons CD e dilatação tubular leve, mas não cistogênese (Figura S5 complementar). Em conjunto, nossos dados indicam que a perda deTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)A função em células progenitoras SIX2 não bloqueia o desenvolvimento de estruturas de néfrons nascentes, mas inibe a maturação dos néfrons terminais.
TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/-cistos são deficientes em marcadores de segmento de néfrons comuns
Caracterizar a origem histogenética deTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-7cistos renais, realizamos análises IF deTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/kidneys at age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter(distal tubule), and aquaporin 2(CD). The majority of cysts with a maximal diameter of>50 um did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation(Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 µm foram caracterizados por depósitos intraluminais de uromodulina, sugerindo originação de segmentos de néfrons distais ao túbulo proximal e alça descendente de Henle (Figura 3b).
Figura 3ITfam-/cistos não expressam marcadores específicos de segmentos de néfrons comuns.(a)Representative images of formalin-fixed, paraffin-embedded kidney sections from Six2-mT/mG; Tfam-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2(AQP2)by immunofluorescence (IF). 4'6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 um. (b) Imagens representativas de cortes de rim embebidos em parafina e fixados em formalina de Seis2-mT/mG; Camundongos Tfam-7 na idade P14 corados para eGFP e uromodulina por IF. Asteriscos representam cistos com uromodulina intraluminal. A presença de uromodulina intraluminal foi examinada em cistos com diâmetro máximo de 50-100 um ou em cistos maiores que 100 um de diâmetro máximo. Barras =(a,b)100 um. Para otimizar a visualização desta imagem, consulte a versão online deste artigo em www.rim-international.org.
Anormalidades progressivas na função mt e morfologia emTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-7-células epiteliais
Caracterizar a evolução temporal das consequências metabólicas daTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)deleção, primeiro examinamos os níveis de mRNA deTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)eTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-regulado mt-Col, mt-Cyb e mt-Atp6 emTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/-rins na idade PO, P7 e P14. Como esperado,TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A), os níveis de mRNA de mt-Col, mt-Cyb e nt-Atp6 foram significativamente reduzidos (Figura 4a). As células epiteliais T fam-7- marcadas com eGFP(Seis2-mT/mG; Tfam-7camundongos) exibiram uma redução significativa na expressão da proteína MT-CO1 (Figura complementar S7). O número de cópias de DNA mt foi reduzido em 63%, o que é consistente com a depleção de mt, uma marca registrada deTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)deficiência (Figura 4a). Em contraste, a expressão de genes nucleares que codificam nicotinamida adenina dinucleotídeo: ubiquinona oxidorredutase core subunidade 3 (Ndufs3) e complexo succinato desidrogenase flavoproteína subunidade A (Sdha) não foi afetada na idade P0, mas foi reduzida na idade P7 e P14 (Figura 4a). Esses achados da análise do gene mt e da proteína são consistentes com a perda progressiva do número de cópias mt no epitélio Tfam-/-.
Em seguida, investigamos os efeitos metabólicos deTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)inativação em células epiteliais primárias do túbulo proximal (PTECs) isoladas na idade P7.TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-7 PTECs exibiram reduções significativas nas taxas de consumo basal de oxigênio (40,77 ± 4,10 para mutantes vs.61,75± 5,18 pmol/min/10 células para controles,n=3 cada,P= 0.034 ), respiração ligada ao ATP (33,11 ± 3,91 para mutantes vs. 46,92 ± 4,91 pmol/min/10* células para controles, n=3 cada, P=0,093), respiração máxima (116,8 ± 14,19 para mutantes vs.225,5 ± 13,55 pmol/min/10* células para controles, n= 3 cada,P=0,005) e capacidade respiratória de reposição (76,05 ± 10,18 para mutantes vs. 163,7 ± 8,61 pmol/min/10* células para controles, n=3 cada,P= 0.003; Figura 4b).
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Para caracterizar ainda mais o grau de depleção e dano do mt, examinamosTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/- rins por microscopia eletrônica de transmissão e 3-microscopia de iluminação estruturada dimensional (3D SIM). Na idade P7, as mitocôndrias exibiram formas irregulares e balonismo, que são consistentes com achados anteriores emTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)ratos de nocaute. A análise de microscopia eletrônica de transmissão indicou que anormalidades estruturais das mitocôndrias, como tamanho aumentado e cristas anormais, progrediram no período pós-natal porque as diferenças morfológicas entre mutantes e o controle foram menos aparentes na idade P0 e se tornaram mais graves com a idade (Figura 4c ). O SIM 3D foi usado para examinar o volume mt e o tamanho da rede em Seis2-mT/mG;TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)--/ mutantes comparados com Seis2- camundongos controle mT/mG na idade P7; O volume mt foi medido em seções transversais de 5 a 8 túbulos por seção, examinando 25 a 40 células epiteliais corticais positivas para eGFP coradas para canal 1 seletivo de ânion dependente de voltagem por coloração IF. Descobrimos que o volume total de mt por célula positiva para eGFP foi significativamente diminuído (62,66 ± 16,46 um/célula para mutantes vs.177,4±30,17 μm'/célula para controles,n=3 cada , P= 0.0289) e foi associado a uma alteração na proporção do volume total de mt por volume total da célula de 0,230 ± 0,01 em controles para 0,089 ± 0,016 em seis 2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-7 mutantes (n= 3 cada, P=0.0017; Figura 4c). O tamanho máximo da rede mt, que mede a maior rede mt encontrada em todas as células positivas para eGFP examinadas, foi diminuída em seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/ rins（143,2 ± 23,2 μm² para mutantes vs.318,3 ± 49,45 um² para controles, n= 3 cada, P= 0,0327）. Tomados em conjunto, os achados ultraestruturais e SIM e os achados da análise do gene mt e da proteína são consistentes com a perda progressiva do número de cópias mt emTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-7-epitélio.
Figura 4| O epitélio Tfam-/renal é caracterizado por depleção mitocondrial progressiva.(a) Expressão do gene mitocondrial (mt) por reação em cadeia da polimerase quantitativa no dia pós-natal da idade (P){{0}}, P7 e P14 (mudança de vezes em relação ao controle, n =6 cada) e conteúdo de DNA mt (P7) em homogeneizados renais totais de Cre~ controle de ninhada (co) e Six2-Tfam-/camundongos. (b) Taxa de consumo de oxigênio (OCR) em células epiteliais tubulares proximais primárias (PTECs) isoladas do controle da ninhada Cre e seis 2-7rim-fam- na idade P7 em uma plataforma Seahorse XFe24. Medições representativas de OCR em controle e Tfam-7PTECs tratados com oligomicina A (oligo A, inibição de adenosina trifosfato [ATP] sintase), carbonil cianeto-p-trifluoro metoxifenil hidrazona (FCCP, desacoplador) e inibidores de rotenona de fosforilação oxidativa e antimicina A(AA). Também são mostradas a respiração basal e máxima calculada, a respiração ligada ao ATP e a capacidade respiratória de reposição (n =3 cada). (c) Análise ultraestrutural de mitocôndrias por microscopia eletrônica de transmissão. Imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão de seções renais de camundongos Crecontrol e Six2-Tfam-7na idade P0 e P7, setas vermelhas representam mitocôndrias. Barra=500 nm. (d) Imagens de microscopia de iluminação estruturada tridimensional de seções de rim de Seis2-mT/mG (co) e Seis2-mT/mG; Camundongos Tfam-/- na idade P7. Proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP), subunidade 4 de citocromo c oxidase (COXⅣ) e canal seletivo de ânion dependente de voltagem 1 (VDAC foram detectados por imunofluorescência.4',6-diamidino-2-fenilindol (DAP) ) foi usado para coloração nuclear (fluorescência azul). As linhas tracejadas brancas delineiam o túbulo renal no controle e o lúmen do cisto no rim mutante, e os sinais numéricos representam o lúmen tubular no controle ou o lúmen do cisto no rim mutante. A área mt foi quantificada com Imaris software (Oxford Instruments, Abingdon, Reino Unido; n =3 cada). Volume total (tot) mt (vol) por célula positiva para eGFP (25-40 células/amostra analisada), a proporção do volume total de mt por volume total da célula e o tamanho máximo (máximo) da rede mt por célula. O tamanho da rede mt foi determinado em uma seção transversal tubular com 5 células por seção transversal. Barras =4 um. Os dados são representados como média± SEM e foram analisados pelo teste t de Student. *P<><><0.001, mt-atp6,="" mitochondrially="" encoded="" atp="" synthase="" membrane="" subunit="" 6;="" mt-co1,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" c="" oxidase="" 1;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b;="" ndufs3,="" nadh:="" ubiquinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" sdha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a;="" tfam,="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)A deficiência desloca o metabolismo do epitélio renal para a glicólise
PTECs no rim usam oxidação de ácidos graxos e OXPHOS para geração de ATP e são gluconeogenetic.' grau Para obter informações adicionais sobre as alterações metabólicas associadas à inativação de Tam, realizamos análise de sequenciamento de RNA de rins de Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/- e Cre~ camundongos de controle da mesma ninhada na idade P7. Descobrimos que os principais genes reguladores envolvidos na glicólise, como hexoquinase 2 (Hk2) e enolase 2 (Eno2), foram regulados positivamente. Em contraste, a expressão da maioria dos genes envolvidos no ciclo do ácido tricarboxílico foi diminuída (por exemplo, isocitrato desidrogenase 1[Idh1), assim como a expressão de genes envolvidos na oxidação de ácidos graxos, como acetil coenzima A aciltransferase 1B(Acaalb), acil-coenzima A desidrogenase de cadeia média (Acadm) (Figura 5a eb, Figura Suplementar S8). Consistente com a diminuição da expressão de genes envolvidos no controle do ciclo do ácido tricarboxílico e rins mutantes na idade P7 usando uma plataforma Seahorse XFe24 (Agilent, Santa Clara, CA). Os PTECs mutantes foram caracterizados por um aumento significativo na glicólise basal (taxa de efluxo de prótons=117,4 ± 12.07 pmol/min para mutantes e 73,34 ± 6,33 pmol/min para controle, n{{25 }}, P=0.{{30}}032) e uma diminuição na razão da taxa de consumo de oxigênio mt sobre a taxa de efluxo de prótons glicolíticos de 0,73 ± 0,08 no controle a 0,34 ± 0,02 em PTECs mutantes(n=3,P=0.0074). Em conjunto, esses dados indicam queTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/- células epiteliais sofreram uma mudança metabólica de OXPHOS e oxidação de ácidos graxos para glicólise (Figura 5d).
Figura 5]A deficiência do fator de transcrição mitocondrial mitocondrial renal (TFAM) está associada ao aumento da glicólise e ao metabolismo anormal dos ácidos graxos.(a) Análise da expressão de genes metabólicos por sequenciamento de RNA do córtex de rim inteiro isolado de seis camundongos 2-Tfam-/- e Cre-littermate controle (co) na idade pós-natal (P) 7 (n {{6) }} cada). São mostrados genes metabólicos regulados diferencialmente envolvidos na glicólise e no ciclo do ácido tricarboxílico. Os genes com um aumento estatisticamente significativo na expressão de mRNA são mostrados em vermelho e os genes com expressão diminuída são mostrados em verde. (b) níveis de expressão de mRNA de genes regulados diferencialmente selecionados por reação em cadeia da polimerase quantitativa (n=4-6). (c) Metabolismo de ácidos graxos alterado em seis camundongos2-7Tfam-7mutantes. Imagens representativas de seções de rim coradas com óleo vermelho O de camundongos controle Six{10}}Tfam-7e Cre-litermate na idade P14. As setas apontam para células O-positivas vermelhas de óleo e o número sian representa o custo. Bar=10 um.(d) Análise de fluxo glicolítico de células epiteliais tubulares proximais primárias (PTECs) isoladas do controle de ninhada Cre e Seis2-Tfam-/rins na idade P7 (n=4 cada ) em uma plataforma Seahorse XFe24. São mostradas medidas representativas da taxa de efluxo de prótons glicolíticos (glico PER) no controle e Tfam-7PTECs tratados com 2-desoxiglicose (2-DG) e inibidores de fosforilação oxidativa rotenona e antimicina A(AA) . Também são mostrados o glico PER médio na linha de base e a razão da taxa de consumo de oxigênio mitocondrial (mt) (OCR) sobre o glico PER. Os dados estão representados como média ± SEM e foram analisados pelo teste t de Student. (Contínuo)
ReduzidoTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)A expressão em tecidos PKD murino e humano está associada à depleção de mt
Porque Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)-/ rins tinham uma forte semelhança com os rins PKD, em seguida avaliamos seTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)foi desregulada em tecidos PKD. Nós primeiro examinamosTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)e expressão gênica regulada por TFAM em 2 modelos genéticos de camundongo PKD bem estabelecidos.TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)Os níveis de mRNA foram significativamente reduzidos em homogenatos de rim inteiro de camundongos Pkd1-/- e Cyspk/pk, que carregam mutações em Pkd1 ou Cys1. Isso foi associado a uma diminuição na expressão de genes mt codificados mitocondrial e nuclear, bem como a expressão de genes glicolíticos desregulados. Semelhante a Seis2-TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)Os rins -/rins, Pkd1-7 e CysPkpk foram caracterizados por níveis elevados de Eno2 e Hk2 e níveis de transcrição de fosfoglicerato quinase (Pkg)1, piruvato desidrogenase quinase (Pdk)1 e Pdk4 significativamente diminuídos (Figura 6a).TFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)a expressão da proteína, avaliada pela coloração IF, foi reduzida nas células epiteliais do revestimento do cisto em comparação com as células epiteliais dos túbulos não císticos adjacentes (Figura 6b). Isso foi associado à expressão reduzida de mt-Co1 e mt-Atp6 por hibridização in situ de fluorescência de RNA (Figura 6b, Figura Suplementar S9); O volume mt, conforme determinado pelo 3D SIM, foi reduzido em 55 por cento em comparação com as células epiteliais dos túbulos não císticos adjacentes ou PTECs dos rins normais de controle. Não foram encontradas diferenças no volume mt entre PTECs de controle normal e PTECs de túbulos não císticos (Figura 6c).
Figura 6| A expressão do fator de transcrição mitocondrial A (TFAM) é reduzida em cistos renais Pkd1-7-e CysPkepk.(a) Níveis de expressão de mRNA relativos (mudança de vezes em relação ao controle de ninhada de Cre) de genes mitocondriais e glicolíticos codificados mitocondrialmente e nuclearmente em Pkd1-7e Cyskidneys (n=3-5). (b) Imagens representativas de rim seções de Pkd1-7e camundongos de controle de ninhada analisadas na idade pós-natal (P)22. São mostradas a coloração de imunofluorescência (IF) para TFAM e hibridização in situ fluorescente de RNA (RNA-FISH) para transcrições mitocondrialmente codificadas de citocromo c oxidase 1 (mt-Co1) e subunidade 6 de membrana ATP sintase codificada mitocondrialmente (mt-Atp6). As setas brancas identificam as células epiteliais de revestimento do cisto com expressão de TFAM, mt-Co1 ou mt-Atp6 fortemente reduzida. Os glomérulos são marcados por gl. As estruturas tubulares que expressam TFAM são identificadas por fluorescência vermelha. Os asteriscos representam células epiteliais tubulares com transcritos detectáveis de mt-Co1 e mt-Atp6. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) foi usado para coloração nuclear (fluorescência azul). Barras=25 um para imagens IF e 10 μm para imagens RNA-FISH. （c） Microscopia de iluminação estruturada tridimensional. São mostradas imagens de seções renais de rins Pkd1-7-analisados por histoquímica com lectina de tetragonolobus de lótus (LTL) e IF para expressão da subunidade 4 da citocromo c oxidase (COXIV) e do canal seletivo de ânion dependente de voltagem 1 (VDAC). O volume mitocondrial (mt) foi quantificado com o software Imaris com base na coloração COXIV. As setas representam as células epiteliais de revestimento do cisto, os sinais numéricos representam o lúmen do cisto e os asteriscos representam os túbulos não císticos. Células epiteliais de revestimento do cisto são delineadas por linhas tracejadas. Barras=10 μm para o painel esquerdo e 3 μum para o painel direito. Os dados são representados como média ± SEM e foram analisados usando o teste t de Student *P<><0.01, and=""><0.001.eno2, enolase="" 2;="" hk2,="" hexokinase="" 2;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b:="" ndufs3.="" nadhubiguinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" pdk1,="" pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 1;="" pdk4.pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 4;="" ppargc1a,="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor="" gamma="" coactivator="" 1-alpha:="" pgk1,="" phosphoglycerate="" kinase="" 1:="" ptec,="" proximal="" tubule="" epithelial="" cell;="" sudha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
Para verificar se a perda deTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)expressão é uma característica molecular comum da PKD humana, analisamos espécimes de nefrectomia de 5 pacientes ADPKD por imuno-histoquímica, coloração IF, fluorescência de RNA hibridização in situ e SIM 3D. ReduzidoTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)expressão foi observada em 75,2 por cento ± 7,5 por cento dos cistos renais analisados por imuno-histoquímica. Isso foi associado a uma expressão diminuída de MT-CO1 e MT-ATP6 por hibridização in situ de fluorescência de RNA (Figura 7a, Figura Suplementar S10); O volume mt nas células epiteliais do revestimento do cisto foi diminuído em aproximadamente 70 por cento, conforme avaliado pelo SIM 3D (Figura 7b). Em conjunto, a análise de 2 modelos de camundongos PKD e tecidos humanos ADPKD sugeriram queTFAM(fator de transcrição mitocondrial alvo A)deficiência e depleção de mt são achados comuns em tecidos PKD e provavelmente impactam a patogênese da doença cística renal.
Figura 7| A expressão do fator de transcrição mitocondrial A (TFAM) em cistos renais de pacientes com doença renal policística é reduzida.(a) Imagens representativas de seções embebidas em parafina fixadas em formalina de rins humanos normais e rins de pacientes com doença renal policística (PKD) analisadas por imuno-histoquímica para expressão de TFAM, por imunofluorescência (IF) para canal seletivo de ânion dependente de voltagem 1 (VDAC ), e por hibridização in situ fluorescente de RNA para citocromo c oxidase 1 (MT-CO1) codificada mitocondrialmente e subunidade de membrana ATP sintase codificada mitocondrialmente 6 (MT-ATP6) expressão de mRNA, as setas identificam as células epiteliais de revestimento do cisto, os sinais numéricos representam o lúmen do cisto , e asteriscos representam glomérulos. Barra=100 μm para imagens de baixa ampliação e 10 um para imagens de alta ampliação (b) Imagens microscópicas de iluminação estruturada dimensional representativa de seções de rim PKD humano analisadas com IF para expressão de VDAC.4',{ {17}}diamidino-2-fenilindol (DAPl) foi usado para coloração nuclear (fluorescência azul). As linhas tracejadas marcam os túbulos e os sinais numéricos representam os lúmens tubulares ou císticos. O volume mitocondrial (mt) foi quantificado usando o software Imaris (n=5). Barra =4 μm. Os dados são representados como média ± SEM e foram analisados usando o teste t de Student.*P<0.05. to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
