A proteção intestinal por proantocianidinas envolve ações antioxidantes e anti-inflamatórias em associação com a melhora da sensibilidade à insulina, homeostase de lipídios e glicose Parte 2

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Expressão de Tein usando Western blot. A Figura 6 mostra que a adição de Fe/Asc às células Caco-2/15 elevou o nível das duas enzimas importantes, mas os PACs contrabalançaram sua regulação positiva induzida por Fe/Asc.

Como a sinalização da insulina modula os processos de lipogênese, oxidação de ácidos graxos e gliconeogênese, foi importante investigar a influência de Fe/Asc e PACs nas MAPKs e PI3K/Akt, as duas principais vias de sinalização da insulina. Para isso, as células Caco-2/15 foram pré-incubadas com insulina antes da outra célula Caco-2/15

Figura 6. Efeitos de PACs na glicogênese em células Caco-2/15. Proantocianidinas (PACs, 250 ug/mL) foram adicionadas ao compartimento da célula apical por 24 h antes do tratamento com Fe/Asc （200μM/2 mM） por 6h a 37 graus. A expressão proteica de (A) G6Pase e (B) PEPCK foi avaliada por Western blot.pó de cistacheOs resultados representam as médias ± SEM de 3 experiências independentes, cada uma em triplicado. Um Western blot representativo é mostrado, ilustrando um experimento em triplicata no mesmo gel e na mesma exposição.*P<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">raiz de cistacheG6Pase glicose-6-fosfatase, PEPCK fosfoenolpiruvato carboxiquinase.

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tratamentos para ativar a via de sinalização. Enquanto Fe/Asc aumentou a expressão da proteína p38-MAPK e a razão fosfo p38-MAPK/p38-MAPK, os PACs impediram essas ações (Fig.7A-C). Por outro lado, enquanto o Fe/Asc reduziu a massa proteica de fosfo Akt (pAkt) e a razão Akt/Akt, os PACs mostraram uma capacidade de manter seu nível normal. Uma tendência semelhante foi observada para PI3K (Fig. 7D-I. Portanto, essas observações apóiam o papel favorável dos PACs na sinalização da insulina.

Discussão

Os polifenóis são bem conhecidos por seus efeitos biológicos e medicinais pleiotrópicos, o que explica a atração de muitos cientistas e indústrias alimentícias por esses fascinantes produtos naturais derivados de plantas. Os PACs se destacam pela variedade e alto número de polifenóis por seus impactos farmacológicos e terapêuticos em doenças crônicas2021. Apesar de suas características louváveis, ainda há muito que permanece desconhecido sobre sua influência no trato GI, que implanta extensas redes digestivas, imunológicas, neuronais e metagenômicas2.sono de cistachePor esta razão, esforços têm sido dedicados na presente investigação para esclarecer o papel dos PACs na OxS intestinal, defesa antioxidante, inflamação, oxidação de ácidos graxos, lipogênese e gliconeogênese, ao mesmo tempo em que tenta elucidar mecanismos subjacentes, como a sinalização da insulina e status dos fatores de transcrição.

Para investigar os efeitos do PAC, usamos a linhagem celular Caco-2/15, um modelo intestinal popular predominantemente apreciado pela comunidade científica2 e reconhecido pela Food and Drug Administration por processos de captação e transporte4. As células Caco-2/15 não apenas se diferenciam espontaneamente em enterócitos humanos funcional e morfologicamente semelhantes3,25, mas também servem para a exploração eficiente da absorção e interações intestinais, nutrição, toxicologia, microbiologia alimentar, testes de biodisponibilidade e triagem de permeabilidade de drogas no programa de descoberta2²627. Como em nossos relatórios anteriores sobre vários tópicos28-3】, a linhagem celular Caco-2/15 foi fundamental no estudo atual para desvendar o potencial dos PACs para regular diversas vias metabólicas. É importante ressaltar que neste estudo, as células foram semeadas em filtros porosos, permitindo o acesso a ambos os lados do epitélio intestinal bipolar: compartimentos apical e basolateral correspondentes ao lúmen intestinal ou circulação serosa, respectivamente. Além disso, pré-incubamos Caco-2 /15 células com Fe/Asc, pois este sistema foi altamente relevante em nosso laboratório para induzir forte OxS e inflamação, que por sua vez foram desafiados por um grande espectro de efetores17,1932-3 Notável, Fe/Asc como um forte oxigênio -sistema gerador de radicais causa danos oxidativos a macromoléculas biológicas, altera o ambiente redox intracelular e está envolvido em vários estados patológicos2,35,56. Nossos achados mostram uma elevação significativa da peroxidação lipídica (altos níveis de MDA) juntamente com defesa antioxidante expressões da proteína SOD2).benefícios do cistanche tubulosaAlém disso, em virtude de sua capacidade de gerar peróxidos lipídicos, o complexo Fe/Asc promove inflamação como evidenciado pelo aumento da expressão de TNFa, COX2 e NF-is. Coletivamente, os presentes resultados validam a geração radical e inflamatória em resposta ao Fe/Asc

A presença de PACs neutralizou a peroxidação lipídica mediada por Fe/Asc. Como a falha na defesa antioxidante poderia explicar a indução de OCS, examinamos sua ação sobre enzimas antioxidantes endógenas. De fato, os PACs foram capazes de restaurar o declínio de SOD2 e GPx mediado por Fe/Asc. Para delinear o mecanismo para a exacerbação de OxS por Fe/Asc e alívio por PACs, avaliamos a via de sinalização Keap1-NRF2-elemento de resposta antioxidante (ARE), que é considerado o mais poderoso antioxidante endógeno regulador37.chá de cistacheO NRF2 é um sensor OCS celular cuja função é manter a homeostase redox. Em condições normais. NRF2 é continuamente ubiquitinado e direcionado para degradação proteassomal por seu regulador de ligação negativa Keap18. Na presença de efetores endógenos e exógenos, Keapl é inativado e regulado negativamente, interrompendo assim a interação Keapl-NRF2 e liberando NRF2, que se transloca para o núcleo da célula, liga-se aos promotores contendo

Figura 7. Efeitos dos PACs na sensibilidade à insulina na linhagem celular Caco-2/15. Proantocianidinas (PACs, 250 ug/mL) foram adicionadas ao compartimento da célula apical por 24 h antes do tratamento com Fe/Asc（200μM/2 mM） por 6h a 37 graus. Duas horas antes do final das 6h de incubação com a mistura Fe/Asc, foi adicionada insulina (100 nM) para avaliar a sensibilidade à insulina. A expressão proteica de(A) p38-MAPK,(B)fosfor p38-MAPK,(D)Akt,(E)fosfo Akt,(G)PI3k e (H)fosfo PI3k foi avaliada por Western blot. As razões (C) fosfo p38-MAPK/p38-MAPK,(F)fosfo Akt/Akt e (Dfosfo PI3k/PI3k foram então calculadas. Os resultados representam as médias ± SEM de 3 experimentos independentes cada um em duplicata. Um Western blot representativo é mostrado, ilustrando um experimento em triplicata no mesmo gel e com a mesma exposição.*P<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">

ARE, e acelera a transcrição de enzimas antioxidantes39. De acordo com nossos dados, o tratamento de células Caco-2/15 com PACs reprimiu Keapl e provavelmente permitiu que NRF2 se transloque para o núcleo permitindo a ligação a ARE (sequência central: 5'TGACnnnGC3') na região promotora de genes antioxidantes (SOD2 e GPx), resultando na estimulação de sua transcrição e regulação positiva coordenada. De acordo com esses dados, o composto de resveratrol fenólico preveniu OxS em sinoviócitos semelhantes a fibroblastos de artrite reumatóide tratados com H, O, promovendo a expressão de NRF2 e diminuindo a expressão de Keap12. Adicionalmente, segundo Kanzaki et al, a ativação de enzimas antioxidantes e citoprotetoras pode estar associada à relação NRF2/Keapl1.

Como esperado da melhora da OCS, os PACs reduziram significativamente a inflamação, conforme evidenciado pela regulação negativa de TNFa e COX2. Como o NF-KB é um regulador chave de citocinas pró-inflamatórias, examinamos sua resposta aos PACs. Em linha com a tendência de agentes inflamatórios, os PACs anularam a indução de NF-KB mediada por Fe/Asc e reduziram a razão NF-KB/IikB. Assim, podemos razoavelmente supor que os PACs ajudam a proteger contra a inflamação que põe em risco as funções das células intestinais através do controle do NF-kB, o regulador mestre da resposta inflamatória. Vale ressaltar que os PACs podem proteger da inflamação estimulando mecanismos de defesa antioxidantes celulares, uma vez que existe uma estreita relação entre biomarcadores de desequilíbrio redox e inflamação2.

O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos do Pac na homeostase lipídica intestinal. Nossos achados interessantes mostraram que os PACs regulam positivamente o CPTla, por um lado, e regulam negativamente o FAS, que representam os biomarcadores de oxidação de FA e lipogênese, respectivamente. Portanto, essas enzimas são potenciais alvos de PACs, o que indica o potencial polifenólico para prevenir o acúmulo de lipídios, considerado uma manifestação patológica de OxSand inflamação em muitos tecidos*3. Os mecanismos moleculares provavelmente estão relacionados à regulação positiva de PPARa e regulação negativa de SREBPlc, dois fatores de transcrição que regulam o metabolismo lipídico. A FAS é a enzima central na lipogênese, responsável por catalisar a conversão de malonil-CoA em FAs45. Já o ACC catalisa a formação de malonil-CoA, substrato essencial para a FAS. De acordo com nossos achados, os polifenóis de Solanum nigrum também diminuíram FAS e SREBPs, enquanto aumentaram CPTla e PPARa em hepatócitos tratados com ácido oleico"6.

Os mecanismos de ação dos polifenóis geralmente estão associados à ativação da fosforilação de AMPKa7. É importante ressaltar que a AMPka fosforilada em nosso estudo foi reduzida por Fe/Asc, mas estimulada por PACs, o que explica a regulação negativa de fosfo ACC, resultando em lipogênese inibida e aumento do metabolismo energético. No entanto, a expressão proteica de AMPKa foi aumentada por OxS induzido por Fe/Asc em células Caco2/15. Assim, ROS e OxS podem induzir AMPKa por meio de diferentes quinases a montante8.

A OCS e a inflamação induzem fortemente a resistência à insulina e distúrbios metabólicos adicionais9,50, o que nos levou a avaliar a capacidade do Pac em regular algumas proteínas-chave em relação à via de sinalização da insulina. Primeiro, focamos em p38-MAPK cuja expressão foi encontrada regulada positivamente por OxS enquanto interferia na cascata de sinalização do receptor de insulina. Tanto a análise da fosforilação da p38-MAPK quanto o cálculo da relação fosfo p38-MAPK/p38-MAPK revelaram um aumento significativo na resposta ao Fe/Asc, o que é compatível com IS prejudicada em Caco{ {6}}/15 células. A validação foi obtida pelo declínio de pAkt e PI3K. Em contraste, os PACs reverteram a tendência, pois mostraram a capacidade de diminuir a fosforilação da p38-MAPK e a razão fosfo p38-MAPK/p38-MAPK enquanto melhoram a via de sinalização PI3K/Akt, que é conhecido por mediar as principais ações biológicas da insulina regulando o transporte de glicose, síntese de proteínas, proliferação celular, sobrevivência celular e gliconeogênese. O comprometimento da EI por OXS e inflamação crônica também pode afetar o processo de gliconeogênese3,54. A análise das duas principais enzimas envolvidas na síntese de novo de glicose (PEPCK, G6Pase) revelou um aumento significativo na resposta ao Fe/Asc enquanto a administração de PACs os trouxe de volta aos níveis normais em células Caco2/15.

Em conclusão, numerosos estudos na literatura científica demonstram efeitos significativos na saúde de compostos fenólicos, seja como uma molécula fenólica específica ou uma mistura de vários polifenóis por evidência indireta. O presente trabalho aponta o efeito crucial dos PACs (flavanóis complexos) na homeostase intestinal, prevenindo OxS, inflamação e distúrbios metabólicos relacionados. Como os PACs podem não ser totalmente absorvidos pelo intestino delgado, mais estudos são necessários para investigar os mecanismos envolvidos em seus efeitos benéficos à saúde no intestino delgado.

material e métodos

Cultura e tratamento de células Intestinais Caco-2/15. Para todos os experimentos, usamos a linhagem celular de adenocarcinoma colorretal epitelial humano Caco-2/15, um clone estável das células originais Caco-2 (American Type Culture Collection, Rockville, Md., EUA), que foi obtido do Dr. JF Beaulieu (Departamento de Biologia Celular, Faculdade de Medicina, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canadá). A linha celular Caco-2/15 tem a propriedade única de se diferenciar in vitro em enterócitos maduros polarizados e formar um mon-over impermeável. As células Caco-2/15 foram cultivadas conforme descrito anteriormente323455 e usadas para o estudo da integridade celular, OCS e inflamação17,19 e IS56.

Análise da expressão de proteínas por immunoblotting. Após a incubação com vários tratamentos, as células Caco-2/15 foram lisadas em tampão gelado contendo 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1 mM de Na2E-DTA, 1 mM de EGTA, 1 por cento de NP -40,1 por cento de desoxicolato, 2,5 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de Na2VO4, 1 ug/mL de leupeptina e 1 mM de PMSF. A concentração de proteína de cada amostra foi determinada usando o método de Bradford （Bio-Rad）. As proteínas foram então desnaturadas por 5 min em um tampão de amostra contendo SDS e ß-mercaptoetanol. Homogenatos contendo 15 µg de proteínas totais foram separados em um gel de SDS-poliacrilamida a 10 por cento de acordo com os pesos moleculares da proteína e foram eletroblotted em membranas de nitrocelulose. Leite sem gordura foi usado para bloquear locais não específicos das membranas antes de adicionar anticorpos primários durante a noite a 4 graus. A diluição de anticorpos é relatada em Informações Suplementares e em nossa publicação recente. As bandas reativas foram capturadas usando um ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad). Todos os dados são expressos como a razão da proteína alvo para -actina na mesma amostra.

Análise estatística. Todos os valores são expressos como a média±SEM de pelo menos três experiências diferentes realizadas em triplicado. Os dados foram analisados ​​por ANOVA de uma via seguida de testes de comparações múltiplas de Tukey usando PRISM 7.0(GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). As diferenças foram consideradas significativas em P<>

Este artigo foi extraído de Relatórios Científicos|(2021) 11:3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5