Interações entre antioxidantes polifenólicos quercetina e naringenina ditam o comportamento químico e biológico distintivo relacionado a redox de suas misturas Parte 1

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Pesquisas realizadas nas últimas duas décadas sobre a base molecular de doenças crônicas não infecciosas, comoaterosclerose, hipertensão, diabetes e, especialmente, câncer, despertando grande interesse, revelou que todas essas doenças compartilham um fator de risco comum, que é a ruptura da homeostase redox, muitas vezes referida como estresse oxidativo12. Surge como resultado de um aumento do nível endógeno de espécies reativas de oxigênio (ROS) devido à falha da barreira antioxidante do corpo e acredita-se que promova o desenvolvimento de todas essas doenças.3. Assim, seguiu-se a suposição de que fatores exógenos capazes de neutralizar EROs, como antioxidantes vegetais, poderiam neutralizar ou retardar o desenvolvimento de doenças crônicas e apoiar seu tratamento. A verificação dessa hipótese deu início a estudos detalhados sobre antioxidantes presentes em alimentos que podem apresentar potencial preventivo4. De fato, vários estudos resumidos na meta-análise comparando o consumo de alimentos e doenças crônicas relacionadas à dieta revelaram diminuição do risco no caso de dietas ricas em frutas e vegetais, cereais integrais e bebidas como vinho, café e chá, daí produtos ricos em fitoquímicos antioxidantes. Não surpreendentemente, presumiu-se que essas substâncias, uma vez isoladas de suas fontes naturais, purificadas e depois consumidas na forma de suplementos alimentares contendo doses mais altas do que aquelas alcançáveis ​​na dieta, poderiam se tornar poderosos agentes quimiopreventivos. Esta suposição foi confirmada por um grande conjunto de evidências provenientes de estudos explorando vários modelos experimentais in vitro e in vivo de doenças crônicas, incluindo câncer. . Por exemplo, duas meta-análises de coortes humanas e investigações de caso-controle com vitamina E8 ou preparações de micronutrientes" concluíram que baixos níveis de antioxidantes não tiveram efeito, enquanto altas doses podem aumentar tanto a incidência quanto a mortalidade de câncer e doenças cardiovasculares. suplementos foram baseados em plantas reais, como uma mistura específica de alimentos ricos em polifenóis concentrados (romã, chá verde, brócolis e açafrão), foi observado um efeito protetor significativo em homens com câncer de próstata1.

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Os efeitos promissores dos alimentos integrais em contraste com os compostos isolados estão alinhados com o conceito de sinergia alimentar, que é definido como um aditivo ou mais do que a influência aditiva da combinação de diferentes ingredientes alimentares na saúde humana. Nosso estudo anterior verificou esse conceito comparando as bioatividades de alimentos reais com seu principal antioxidante isolado. Isso mostrou que os efeitos biológicos dos extratos de frutas silvestres diferem amplamente daqueles exibidos pela antocianina cianidina-3-O-glicosídeo. Alguns outros relatórios também indicaram a importância das interações entre diferentes compostos bioativos e componentes da matriz alimentar que acabaram por ser fatores cooperantes, que determinam a bioatividade final dos alimentos3-1. Nossas recentes investigações mecanicistas envolvendo a reconstituição passo a passo da composição de bioativos de cacau também apoiaram a ideia de sinergia alimentar, mas demonstraram que os efeitos biológicos de amostras com composições complexas não são apenas uma combinação das atividades exibidas por componentes individuais'3. Todas essas observações sugeriram que, ao considerar as bioatividades relacionadas ao redox de antioxidantes isolados versus suas misturas, as interações entre os componentes devem ser levadas em consideração. A crescente complexidade de uma mistura defitoquímicosparecia criar um novosubstância ativa redoxao invés de enriquecer a mistura com novas atividades características do composto adicionado, o que é inferido pelo conceito de sinergia alimentar.

Cistanche pode melhorar a imunidade

Na pesquisa atual, simplificamos o sistema experimental limitando-o a apenas duas estruturas centrais para aprofundar os detalhes de suas interações no contexto da estrutura química, reatividade redox e bioatividades relacionadas a redox, para permitir um melhor entendimento e previsão do potencial quimiopreventivo de antioxidantes.'Os fitoquímicos utilizados para este fim foram antioxidantes comuns presentes em várias ervas, vegetais e frutas, especialmente em frutas cítricas, a saber: flavonóis representados pela quercetina (O) e seu ramno-side-rutina ( R) e flavanonas pela naringenina (N-) e seusneohesperidosídeonaringina (N plus ), bem como duas misturas destes compostos (QN-, RN plus ). A composição química do estudo incluiu determinações que fornecem algumas informações sobre termodinâmica e cinética de processos oxidativos, teste ieDPPH, titulação potenciométrica e voltametria de pulso diferencial (DPV). Os testes biológicos examinaram o impacto das amostras estudadas no crescimento celular (teste MTT), atividade antioxidante celular (ensaio CAA), genotoxicidade (ensaio cometa), nível global de metilação do DNA (versão epigenética do ensaio cometa) e a expressão de 84 redox genes relacionados (tecnologias baseadas em arrays de PCR em tempo real). Os experimentos biológicos foram realizados utilizando a linhagem celular HT29 de adenocarcinoma de cólon recomendada para estudos nutricionais como modelo do epitélio intestinal que pode ser exposto a concentrações relativamente altas de antioxidantes ingeridos.

Resultados

Nossas investigações anteriores que compararam as propriedades redox do pó de cacau e seus principais constituintes apontaram para a importância das interações entre os componentes polifenólicos da mistura na atividade antioxidante geral. Na pesquisa atual, simplificamos o sistema experimental para examinar essas interações com mais detalhes para um par de flavonóides que são componentes alimentares comuns. Dois flavonóides foram escolhidos, ambos na forma de agliconas e glicosídeos. Os flavonóis foram representados pela quercetina (Q) e seusramnosídeo-rutina(R) eflavanonaspela naringenina (N-) e seu neohesperidoside naringina (N plus ). Esses polifenóis diferem no número e localização dos grupos hidroxila redox-ativos, bem como na capacidade de formar ligações H intramoleculares, ou seja, três características estruturais que podem interferir na redução das propriedades dos compostos antioxidantes. Conforme mostrado na Fig. 1, os radicais semiquinona intermediários formados na primeira etapa de oxidação da fração catecol no anel B

de Q ou R podem ser estabilizados de duas maneirasi8,19. A primeira maneira é a conjugação da estrutura central sobre os anéis B e C e a formação da segunda ligação H com o grupo OH vicinal ou substituintes no anel C, especialmente em R. a presença de grupos hidroxila no substituinte do açúcar na posição 3 do anel C pode aumentar ainda mais esse efeito de estabilização devido a mais possibilidades de formação de ligações H (diretamente ou via molécula de água), Em contraste, o radical fenoxil intermediário em N plus ou N- não é estabilizado nem por ligações duplas conjugadas envolvendo também o anel C nem ligação de H com substituintes vizinhos. Além disso, em N plus, a porção de açúcar está ligada ao anel A e, portanto, está muito longe para formar uma ligação de H com o radical no anel B. Pode-se esperar que essas características estruturais influenciem a atividade redox dos flavonóides estudados.

Atividade antioxidante por testes químicos.

A determinação das propriedades redutoras para os polifenóis estudados e suas misturas foi realizada por dois ensaios químicos a 37°C para adequar as condições celulares dos processos redox. O primeiro método foi o teste DPPH espectrofotométrico em lote comumente usado; os resultados para flavonóides individuais e suas misturas são apresentados na Fig. 2A. Eles são expressos como valores estequiométricos n onde o número 10 se refere à duração da reação – 10 min. Ao introduzir o parâmetro de tempo nas medições, um aspecto cinético foi incorporado à avaliação da atividade antioxidante, conforme descrito anteriormente13. ativos que as flavanonas. O O foi o composto mais eficiente na eliminação do DPPHradical e foi seguido pelo R. Apesar da reatividade insignificante ao DPPH, ambas as flavanonas, incluindo o N, que por si só não exibiu propriedades redox dentro do período de 10 minutos da reação, aumentaram significativamente a atividade antioxidante total do DPPH. misturas, no caso de ambas as agliconas ON e glicosídeos RN plus .

O segundo método envolveu a titulação potenciométrica (PT) que permite a medição do potencial padrão de redução (E), e assim avaliou a capacidade termodinâmica de compostos puros em ganhar elétrons. Os valores determinados de Confirmaram que Q e R são compostos redutores fortes (Fig. 2B). No entanto, em PT, R aceitou elétrons doadores com mais facilidade do que Q. A determinação de E para N- e N plus não foi possível devido à transferência de elétrons muito lenta durante o processo de oxidação (mais lenta para N plus ). PT mede a diferença de potencial entre o eletrodo de referência e o eletrodo de medição após adicionar cada porção do titulante. O potencial estacionário significa que o quociente de reação (Q) entre titulante e analito é estável (Q= constante). Se a taxa de transferência de carga durante uma reação for baixa (baixas correntes na voltametria), levará muito tempo para estabilizar o Q em PT. Consequentemente, para reações muito lentas, a curva de titulação potenciométrica é difícil de obter e, portanto, o valor encontrado de E" é menos confiável.

Atividade Antioxidante por voltametria de pulso diferencial,

Os testes químicos utilizados sugeriram que a elucidação da ação antioxidante dos polifenóis deve levar em consideração aspectos cinéticos, onde a estabilidade dos radicais intermediários poderia desempenhar um papel. Conforme ilustrado na Fig. 1, os radicais semiquinona formados no primeiro estágio da oxidação do flavanol são muito melhor estabilizados do que os radicais fenoxil que surgem na oxidação da flavanona. Esta relação é ilustrada na Fig. 1 e pode afetar a taxa de processos redox. Portanto, as propriedades de redução-oxidação dos antioxidantes puros estudados e suas misturas foram posteriormente analisadas com o auxílio de voltametria de pulso diferencial (DPV). Como essa técnica permite o monitoramento dos aspectos termodinâmicos e cinéticos das reações de oxidação, ambos são finalmente combinados em um parâmetro chamado poder antioxidante (POA)15.

As observações feitas com as medidas do DPV (Fig.2B-F) contradiziam as obtidas com o teste DPPH (Fig.2A). Surpreendentemente, o DPV revelou que o Q descrito na literatura como um excelente redutor, considerando apenas os aspectos termodinâmicos (potencial de pico anódico, E.), mostrou-se o antioxidante mais fraco (Fig.2B, C). Termodinamicamente, R foi um antioxidante ligeiramente mais forte. Curiosamente, N- e N plus são considerados na literatura como antioxidantes fracos, exibiram termodinamicamente os maiores valores de E significando que eram agentes redutores muito fortes. Para ambas as classes de flavonóides, a fração glicosídica aumentou a atividade antioxidante das agliconas. No entanto, parâmetros relacionados à cinética (Fig.2E, F), ou seja, corrente anódica (I,.) e densidade de carga (Q), revelaram que a oxidação de N plus é o processo mais lento em comparação com a oxidação de Q e R. Da mesma forma , a corrente anódica (I) foi menor para N- do que para Q e R, mas a transferência de carga para este composto atingiu o valor mais alto.

No caso de misturas, foram detectados dois picos anódicos (1º e 2º) nas curvas voltamétricas como seria de esperar para a mistura de dois componentes. Os valores determinados de potenciais de pico anódicos (E.) indicaram que o 1º pico observado reflete a oxidação dos flavonóis, enquanto o 2" d pico a oxidação das flavanonas (Materiais Suplementares-Fig. S1). Na maioria dos casos, a presença do outro componente em uma mistura influenciou a termodinâmica e/ou cinética do processo redox em comparação com a oxidação dos compostos puros. Por exemplo, para QN-, o valor de E., para o 1º pico de oxidação foi igual ao potencial de pico anódico de Q No entanto, o pico anódico de 2" correspondente à N-oxidação e o potencial desta transição foi maior do que o potencial anódico do N puro (Fig.2C). A situação oposta foi observada para a cinética desta reação. O I e Q de 1s pico anódico de QN estavam próximos dos parâmetros cinéticos de oxidação de componentes puros (Fig. 2E, F), enquanto a carga trocada durante a etapa 2n de ON-oxidação foi muito menor do que para N-oxidação (Fig.2F). Esses efeitos termodinâmicos e cinéticos combinados resultaram no aumento da POA (Fig. 2D) dessa mistura, o que está de acordo com os resultados do teste DPPH.

Avaliação da citotoxicidade.

O impacto dos flavonóides agliconas (Q, N-), glicosídeos (R, N plus ) e suas misturas (QN-, RN plus ) estudados no crescimento das células intestinais foi avaliado pelo teste MTT. A linhagem celular HT29 de adenocarcinoma de cólon humano foi escolhida como modelo de epitélio do trato alimentar, ou seja, o tecido em contato direto com ingredientes alimentares ingeridos, como os polifenóis. As células foram tratadas com flavonóides individuais e suas misturas em concentrações fisiológicas que podem ocorrer no sangue (0.01-1 uM)22-2 ou concentrações alcançáveis ​​no trato alimentar (10-100 uM) após a ingestão de alimentos25-27. As curvas de dose-resposta para os tratamentos de 6,24 e 72 h são apresentadas na Fig.3.

Os compostos individuais não influenciaram significativamente o crescimento celular em nenhuma das concentrações investigadas, nem para tratamentos curtos nem prolongados. A exceção foi a concentração mais alta de N-que após 72 h inibiu o crescimento celular até 75 por cento em comparação com o controle. Em contraste, as misturas investigadas (QN-, RN plus) estimularam significativamente o crescimento celular de uma maneira dependente da concentração para todos os tempos de exposição testados. Este efeito foi observado em baixas concentrações (0.01-1 uM) sendo alcançável na corrente sanguínea e foi ainda mais potente em concentrações mais altas (10-100 uM) às quais as células epiteliais do trato alimentar pode ser exposto. Somente no caso da maior concentração de QN-, após 72 h de tratamento, a estimulação cessou, provavelmente devido aos efeitos inibitórios observados nessas condições para o N-. Atividade antioxidante celular. A eficiência dos flavonoides purificados e suas misturas no suporte da barreira antioxidante endógena das células HT29 foi verificada com o auxílio do ensaio CAA. pelas células à sua forma fluorescente. A atenuação da oxidação da sonda, observada como a extinção da fluorescência, é uma medida da capacidade redutora dos antioxidantes nas células (valores de CAA positivos), enquanto o aumento da oxidação da sonda denota sua atividade pró-oxidativa (valores de CAA negativos)28 . As determinações foram realizadas para agliconas e glicosídeos em concentrações que refletem tanto exposições fisiológicas - endógenas - quanto derivadas de alimentos - exógenas - intestinais. A incubação com os flavonóides estudados foi realizada por um período padrão recomendado de 1 h18 para agliconas e glicosídeos. Os tratamentos prolongados (3 e 6 h) destinados a monitorar a cinética da resposta redox no modelo celular aplicado foram utilizados apenas no caso das agliconas, devido ao seu impacto mais proeminente na atividade antioxidante celular.

As flavanonas e flavonóis investigados diferiram em seu impacto no estado redox das células HT29. No caso de agliconas individuais, as respostas dependentes da concentração definidas foram observadas após 1 h de exposição. No entanto, a atividade antioxidante do flavonol-Q aumentou com a concentração aplicada, enquanto no caso da flavanona-N- observou-se o aumento gradual do efeito pró-oxidativo (Fig. 4A). A dependência da dose de glicosídeos individuais foi menos evidente; apenas R em sua concentração mais alta aumentou de forma convincente a atividade antioxidante celular (Fig. 4A). Curiosamente, ambas as misturas apresentaram atividade antioxidante aumentada, aparentemente não influenciada pelo efeito pró-oxidativo observado para compostos individuais.

A Figura 4B apresenta a cinética das alterações dos valores de CAA determinados após 1,3 e 6h de tratamento de células HT29 com agliconas. Para a concentração mais baixa (1 μM), correspondente a exposições fisiológicas, a dependência do tempo não foi observada para agliconas individuais ou sua mistura. No entanto, as influências da maior concentração nos valores de CAA foram claramente dependentes do tempo. As exposições prolongadas diminuíram tanto o efeito pró-oxidativo do N- quanto a atividade antioxidante de Q e QN-.

As agliconas investigadas apresentaram atividade nutrigenômica diferente, modificada adicionalmente pela concentração aplicada às células.

Flavanona N-at l μM diminuiu significativamente a expressão de CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

Esta flavanona aplicada às células HT29 a 10 uM influenciou a expressão de 5 genes, que também foram regulados negativamente pela sua dose mais baixa, a saber: CCL5, CYGB.MT3(p<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

dismutação de radicais superóxido em peróxido de hidrogênio e oxigênio6. O ligeiro aumento na expressão causado por N-at 10uM foi observado apenas para o gene VIMP (0,05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

Este artigo foi extraído de www.nature.com/scientificreports