Nanozimas que imitam catalase com detecção de inflamação aliviam lesões renais agudas por meio da reversão do estresse oxidativo local Ⅳ
Jun 19, 2024
Conclusão
Ervas orgânicas para doenças renais
Materiais e métodos
Materiais
Síntese e caracterização de nanopartículas de dMn3O4
A síntese do ligante TK, polietilenoglicol conjugado com ligante TK (PEG-TK) e conjugado (PEG)-estearina (C18) (PTC) foi realizada de acordo com nossa publicação anterior [15]. Como controle, também preparamos polímero não sensível a ROS (PC) conjugando ácido esteárico com PEG-AM. Resumidamente, 200 mg de m-PEG amina reagiram com 160 mg de ácido esteárico com 160 µl de TEA, 480 mg de EDC e 290 mg de NHS em 20 ml de DMF a 37 graus durante a noite com agitação sob purga de N2. A amostra foi então purificada por diálise (MWCO=12–14 KDa) contra DW por um dia, seguida de liofilização. As estruturas químicas do PTC e PC sintetizados foram confirmadas usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear de prótons (1 H NMR) (400 Hz, Bruker: Billerica, MA, EUA) em clorofórmio (CHCl3). Micelas vazias de PTC sensíveis a ROS e PC não sensíveis a ROS foram preparadas pela automontagem de PTC e PC sob sonicação e diálise.
Preparação e caracterização de enzima sensível a ROS (PTC‑M)
O PTC-M foi preparado pelo método de diálise. Resumidamente, 2 mg de dMn3O4 e 10 mg de PTC foram dissolvidos em 1 mL de dimetilsulfóxido anidro (DMSO). A mistura foi então adicionada gota a gota a 20 ml de DW sob sonicação com sonda (amplitude de 30%, 5 s ON/OFF, 5 min). A solução foi então dialisada (MWCO=12–14 KDa) contra DW por um dia, seguida de liofilização. Da mesma forma, nano micelas não sensíveis a ROS carregadas com dMn3O4 NP (PC-M) também foram preparadas como um grupo de controle. Os diâmetros hidrodinâmicos e o potencial zeta das nano micelas vazias preparadas (PTC e PC) e nano micelas carregadas com dMn3O4 NP (PTC-M e PC-M) foram avaliados por espalhamento dinâmico de luz (instrumento Zetasizer Nano Z, Malvern, Reino Unido). A morfologia do PTC e PTC-M preparados foi visualizada usando FE-TEM. A desestabilização sensível a ROS através da degradação do ligante TK do PTC-M foi observada por análise DLS e FE-TEM após tratamento das amostras com 1 mM de H2O2. O conteúdo de carga de dMn3O4 no PTC-M final foi analisado usando um analisador termogravimétrico (TGA N-1000, Scinco, Seul, Coreia) e uma análise ICP-MS (820 ICPMS Varian Bruker, Billerica, MA, EUA). .
A decomposição do H2O2 em água e oxigênio também foi confirmada usando Ru(DDP) como sonda para geração de oxigênio. Resumidamente, 1 mM de H2O2 foi adicionado às amostras, seguidopela adição de 1 µM Ru(dDDP(DMF). As amostrasforam bem misturados e a intensidade de fluorescênciana excitação 440 nm e emissão 530 – 730 nm foigravado. Mais tarde, a produção de oxigênio também foi confirmadadeterminando a concentração de oxigênio dissolvido usandoum sensor de oxigênio dissolvido (RDO Optical Dissolved Sensor, Thermo Scientific).
Cultura celular e reagentes
Os estudos in vitro foram conduzidos conforme descrito anteriormente [37]. Em suma, células epiteliais tubulares proximais renais humanas (células HK -2, American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) foram utilizadas para os estudos i vitro. Células HK-2 foram cultivadas e passadas a cada 3 - 4 dias em placas de 100-mm contendo uma combinação de meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e meio Hams F-12 (Welgene, Daegu, Coréia) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Welgene), 100 U/ml de penicilinae 100 mg/ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich). TeCélulas HK-2 foram então incubadas em atmosfera umidificadaesfera de 5% CO2e 95% de ar a 37 graus por 24 horas, e subcultivado até 70 – 80% confluente. As células HK-2 foramplaqueados em placas de 60-mm em meio contendo 10%FBS e incubados por 24 h. As células foram então incorridas
Viabilidade celular
Absorção celular
Citometria de fluxo
A análise de citometria de fluxo foi conduzida conforme descrito anteriormente [38]. Um kit de coloração com anexina V FLUOS (SigmaAldrich) foi utilizado para medir o nível de ligação da anexina V de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, após tratamento com 0 ou 1 mM de H2O2 por 24 h com ou sem 2 ug de pré-tratamento PTC-M, as células HK-2 foram colhidas e lavadas duas vezes com solução salina pré-resfriada tamponada com fosfato e ressuspensas em tampão de ligação contendo anexina V. Após incubação no escuro por 15 min, as células foram analisadas por citometria de fluxo (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EUA). Vários controles foram usados para otimizar as configurações do instrumento e determinar o gate para a plataforma baseada em Windows. As células apoptóticas foram definidas como PI-negativas e Anexina V-FITC positivas.
Determinação da geração intracelular de ROS
Para determinar a geração de ROS, utilizamos o fluoróforo DCF-DA (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) conforme descrito anteriormente [38]. Células HK-2 foram incubadas com 0 ou 1 mM H2O2 por 24 h com ou sem 2 ug de pré-tratamento PTC-M, e lavadas duas vezes com solução salina balanceada de Hank, depois incubadas com sal balanceado de Hank solução (sem vermelho de fenol) contendo DCF-DA por 30 min a 37 graus no escuro. As imagens foram obtidas com microscópio de fluorescência (Nikon, Tóquio, Japão).
Animais experimentais e protocolos
Biodistribuição in vivo
Para verificar o efeito terapêutico do PTC-M in vivo, o grupo de tratamento recebeu uma dose única de 0,5 mg/kg de PTC-M através de injeção na veia da cauda após a cirurgia. Os ratosforam sacrificados após 48 horas da reperfusão. Amostras de sangueforam coletados do coração, e osrim esquerdoerarapidamente removido e processado para Western blotting oufixado em solução de paraformaldeído a 4% para imuno-histoquímica (IHQ). Orim direitoestava congelado em−80 grauspara análise de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real.
Medição de plasma NGAL
Imunotransferência semiquantitativa
A análise de Western blot foi realizada conforme descrito anteriormente [37]. Os tecidos renais foram homogeneizados em uma solução de isolamento gelada contendo 0 sacarose 0,3 M, imidazol 25 mM, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 mM, leupeptina 8,5 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonil 1 mM (pH 7,2). Os homogenatos foram centrifugados a 4000×g por 15 min a 4 graus para remover células inteiras, núcleos e mitocôndrias. A concentração total de proteína foi medida por um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce; Rockford, IL, EUA). Todas as amostras foram ajustadas para atingir as mesmas concentrações finais de proteína. Eles foram então dissolvidos a 65 graus por 15 min em tampão de amostra contendo dodecil sulfato de sódio (SDS) e armazenados a -20 graus. Para confirmar a carga igual das proteínas, um gel inicial foi corado com azul de Coomassie. A eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) foi realizada em géis de poliacrilamida a 9 ou 12%. As proteínas foram transferidas eletroforeticamente para membranas de nitrocelulose (Hybond ECL RPN3032D; Amersham Pharmacia Biotech; Little Chalfont, Reino Unido) usando um aparelho Bio-Rad Mini Protean II (Bio-Rad; Hercules, CA, EUA). Os blots foram bloqueados com leite a 5% em PBS-T (Na2HPO4 80 mM, NaH2PO4 20 mM, NaCl 100 mM e Tween a 0,1% -20 a pH 7,5) durante 1 h; incubado durante a noite a 4 graus com anticorpos primários; e incubados com anticorpos secundários anti-coelho, anti-camundongo ou anti-cabra conjugados com peroxidase de rábano silvestre. Os imunotransferências foram então visualizados usando um sistema de quimioluminescência aprimorado. Os níveis de proteína foram quantificados por densitometria. As intensidades relativas dos sinais de imunotransferência foram medidas por densitometria usando o software Scion Image for Windows (Scion Corporation, 2000–2001. versão Alpha 4.0.3.2. MD, EUA) e expressas como alterações de dobramento em relação aos controles. Os anticorpos primários e secundários utilizados na imunotransferência estão listados na Tabela S1.
Reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real)
A análise da reação em cadeia da polimerase foi realizada conforme descrito anteriormente [37]. Os córtex renais foram homogeneizados em reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O RNA foi extraído com clorofórmio, precipitado com isopropanol, lavado com etanol a 75% e depois dissolvido em DW. A concentração de RNA foi determinada pela absorbância a 26 0 nm (Ultraspec 2000; PharMacia Biotech, Cambridge, Reino Unido). A expressão de mRNA de citocinas inflamatórias e moléculas de adesão foi determinada por PCR em tempo real. O cDNA foi produzido por transcrição reversa de 5 µg de RNA total usando oligo (dT) priming e transcriptase reversa sobrescrita II (InvitRogen, Carlsbad, CA, EUA). O cDNA foi quantificado usando um sistema Smart Cycler II (Cepheid, Sunnyvale, CA, EUA) e SYBR Green foi usado para detecção. Cada reação de PCR foi realizada em primer forward 10 pM, primer reverso 10 pM, 2X SYBR Green Premix Ex Taq (TAKARA BIO INC, Seta 3-4-1, Japão), 0,5 ul de cDNA e H2O para trazer o volume final para 20 rua. Os níveis relativos de mRNA foram determinados por PCR em tempo real, utilizando um sistema detector Rotor-GeneTM 3000 (Corbette research, Mortlake, NSW, Austrália). As sequências dos primers estão listadas no arquivo adicional 1: Tabela S2. A PCR foi realizada seguindo os seguintes passos: 1) 95 graus por 5 min; 2) 95 graus por 20 s; 3) 58 a 60 graus por 20 s (otimizado para cada par de primers) e 4) 72 graus por 30 s para detectar SYBR Green. As etapas 2 a 4 foram repetidas por mais 40 ciclos, enquanto no final do último ciclo a temperatura foi aumentada de 60 para 95 graus para produzir uma curva de fusão. Os dados da reação foram coletados e analisados com o Corbett Research Software. Os valores comparativos do limiar crítico de medições em quadruplicado foram utilizados para calcular a expressão gênica, com normalização para GAPDH como controle interno. A análise da curva de fusão foi realizada para aumentar a especificidade da reação de amplificação.
Histologia
A preparação do tecido renal procedeu conforme descrito anteriormente [37]. Os tecidos renais foram fixados com paraformaldeído a 4%, embebidos em parafina e cortados em seções de 3- μm de espessura. A coloração periódica com ácido-Schif foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Abcam, Cambridge, MA, EUA). Para imuno-histoquímica, seções de tecido desparafinizadas foram recuperadas com antígeno por aquecimento a 1{{10}}0 grau por 15 min em tampão citrato, pH 6.0 (Sigma- Aldrich). As seções foram incubadas durante a noite a 4 graus com anticorpos primários diluídos em tampão de bloqueio (1% [p/v] albumina de soro bovino dissolvida em 0,3% [v/v] Triton X-100 preparado em PBS [0,3% PBS- T]). Após as secções terem sido brevemente lavadas três vezes com PBS-T a 0,3%, foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com anticorpos secundários diluídos em tampão de bloqueio. Os escores de lesão tubular foram calculados pelo método descrito anteriormente [39, 40]. O escore de lesão tubular foi medido pelo exame de HPF maior ou igual a 10 da junção corticomedular (ampliação de 200×) em cortes corados com PAS (n=5–7). Os anticorpos primários e secundários utilizados nas análises imuno-histoquímicas estão listados na Tabela S3. A apoptose de células epiteliais tubulares foi detectada com coloração TUNEL com ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Kit (Sigma-Aldrich), de acordo com as instruções do fabricante. Seções de tecido de todos os principais órgãos foram coletadas embebidas em parafina e coradas com hematoxilina/eosina (H&E) para comparar as alterações histológicas.
Análise estatística
Os resultados são expressos como o erro padrão médio da média (SEM). Múltiplas comparações entre os três grupos foram realizadas usando análise de variância unidirecional (ANOVA) e o teste post hoc de diferença significativa de Tukey. Diferenças com valores de p inferiores a 0,05 foram consideradas significativas.
