Inibição in vitro da secreção renal de OCT2 e MATE1 por drogas antieméticas
Mar 18, 2022
Abençoado Jorge1, Xia Wen1, Edgar A. Jaimes2, Melanie S. Joy3,4,5,†e Lauren M. Aleksunes
Abstrato:O transportador de cátions orgânicos 2 (OUT2) e a proteína de extrusão de multidrogas e toxina 1 (MATE1) medeiam a secreção renal de drogas. Estudos recentes sugerem que a ondansetrona, uma droga antagonista 5-HT3 usada para prevenir náuseas e vômitos, pode inibirOUT2- e transporte mediado por MATE1-. O objetivo deste estudo foi testar a capacidade de cinco drogas antagonistas de 5-HT3 para inibir aOUT2e transportadores MATE1. O transporte do substrato de sonda OCT2/MATE1 ASP plus foi avaliado usando dois modelos: (1) HEK293rimcélulas superexpressando humanosOUT2ou MATE1, e (2) células MDCK transfectadas comOUT2and MATE1. In HEK293 cells, the inhibition ofASP+ uptake by OCT2 listed in order of potency was palonosetron (IC50: 2.6 µM) > ondansetron >granisetron > tropisetron > dolasetron (IC50: 85.4 µM) and the inhibition of ASP+ uptake by MATE1in order of potency was ondansetron (IC50: 0.1 µM) > palonosetron = tropisetron > granisetron >dolasetron (IC50: 27,4 µM). Ondansetron (0.5–20 µM) inibiu o transporte transcelular basolateral-apical de ASP mais até 64 por cento. Concentrações mais altas (10 e 20 µM) de palonossetrom, tropisetron e dolasetron reduziram similarmente o transporte transcelular de ASP plus. Em células OCT{12}}MATE1 MDCK duplamente transfectadas, o ondansetron em concentrações de 0,5 e 2,5 µM causou acúmulo intracelular significativo de ASP mais . Em conjunto, esses dados sugerem que 5-fármacos antagonistas de HT3 podem inibir a secreção renal de fármacos catiônicos, interferindo na função de OCT2 e/ou MATE1.
Palavras-chave:OUT2; MATE1; catiônico; 5-antagonista de HT3;rim; secreção; transporte
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1. Introdução
A secreção renal é alcançada pela captação e efluxo coordenados de drogas através do epitélio tubular. Para drogas e tóxicos que são cátions orgânicos, seu transporte transepitelial para o filtrado é realizado primeiro pelo transportador de cátions orgânicos 2 (OCT2) na superfície basolateral e, posteriormente, pelo transportador multidrogas e extrusão de toxinas 1 (MATE1) na borda em escova membrana. Antes de descobrir os genes OCT2/SLC22A1 e MATE1/SLC47A1, era bem entendido que a secreção de cátions orgânicos poderia ser inibida farmacologicamente [1]. Usando uma variedade de abordagens experimentais em diferentes espécies pré-clínicas, foi demonstrado que os cátions orgânicos sofrem transporte ativo e secreção renal [2-4]. Desde essas observações iniciais, a pesquisa avançou para entender não apenas os mecanismos moleculares da secreção de cátions orgânicos, mas também o potencial para interações medicamentosas clinicamente relevantes após a interrupção de OCT2 e MATE1 (revisado em [5]).
Antagonistas do receptor de serotonina 5-HT3 surgiram como drogas críticas para o controle de náuseas e vômitos. A serotonina é liberada pelas células enterocromafins do intestino delgado. 5-Os antagonistas de HT3 inibem o canal iônico controlado por ligante ionotrópico nos nervos aferentes do vago e previnem o reflexo do vômito [6]. Ondansetron foi o primeiro antagonista 5-HT3 aprovado para prevenir náuseas e vômitos induzidos por quimioterapia [7,8]. Desde então, drogas adicionais desta classe (incluindo tropisetron, granisetron, dolasetron e palonosetron) foram desenvolvidas [9]. Embora a principal indicação terapêutica de 5-antagonistas de HT3 tenha sido a prevenção de quimioterapia e vômitos induzidos por radiação, eles também são aprovados para o tratamento de náuseas e vômitos pós-operatórios e são usados off-label para tratar enjoos matinais, hiperêmese gravídica , delírio pós-operatório e prurido [10-14].
Dada a natureza catiônica dos antagonistas 5-HT3 (Figura 1), eles surgiram como substratos e inibidores de transportadores OCT e MATE. Estudos in vitro revelaram que ondansetron e tropisetron são substratos e inibidores de OCT1 e OCT2 [15-20]. Além disso, indivíduos com variantes de perda de função no gene OCT1/SLC22A1 demonstraram ter farmacocinética alterada do tropisetron e eficácia clínica melhorada [16]. Da mesma forma, a ondansetrona pode inibir os transportadores de MATE, levando ao acúmulo renal da droga antidiabética metformina, bem como ao aumento da nefrotoxicidade da droga anticancerígena cisplatina [19]. Em humanos, a ondansetrona diminui a depuração renal da metformina, presumivelmente por inibir o efluxo de MATE1 [21]. Juntos, esses dados apontam para o potencial dos antagonistas de 5-HT3 para inibir a secreção transepitelial de drogas via OCT2 e MATE1. Portanto, procuramos comparar sistematicamente cinco antagonistas de 5-HT3 por sua capacidade de inibir o transporte humano mediado por OCT2 e MATE1-de um substrato catiônico de sonda usando transfectados simples e duplosrimcélulas. É importante notar que o estudo atual se concentrou principalmente no MATE1, pois os níveis de proteína MATE2-K no organismo humanorimcórtex foram previamente demonstrados estar abaixo do limite inferior de quantificação usando espectrometria de massa [22].
2. Resultados
2.1. Caracterização de ASP plus como substrato fluorescente em células HEK293 que superexpressam OCT2 e MATE1
Os estudos iniciais caracterizaram a captação de ASP plus em células que superexpressam um vetor vazio (EV), OCT2 ou MATE1 (Figura 2). ASP plus exibiu captação dependente do tempo (Figura 2A) e dependente da concentração (Figura 2B) nas células expressando OCT2- e MATE1-e exibiu cinética saturável (OCT2: Vmax 8,1 nmol/mg/min , Km 2,9 uM, R2 0,95; MATE1: Vmax 3,4 nmol/mg/min, Km 8,2 uM, R2 0,96). As células EV exibiram acúmulo mínimo de ASP plus (Vmax 1,9 nmol/mg/min, Km 37,3 uM, R2 0,92). Com base nesses achados, a captação de ASP plus foi quantificada após 1 min (faixa linear para transporte de OCT2 e MATE1) a uma concentração de 10 uM, que forneceu sensibilidade suficiente para detecção de fluorescência e triagem de antagonistas de 5-HT3 como inibidores.
Para garantir que essas condições refletissem o transporte ativo por cada transportador, foram determinados os valores de IC5{{10}} da cimetidina, um inibidor bem estabelecido de OCT2 e MATE1 (Figura 3 e Tabela 1). O IC50 para cimetidina foi de 24,5 土 4,0 uM em células que expressam OCT2-e 0,23 土 0,2 uM em células que expressam MATE1-, de acordo com dados publicados mostrando inibição de MATE1 em concentrações mais baixas [18,20]. A cimetidina não teve influência na captação de ASP mais nas células EV.
2.2. Inibição de OCT2- e MATE1-Transporte Mediado por Droga Antiemética em Células HEK293
Cinco diferentes antagonistas 5-HT3 (ondansetron, palonosetron, granisetron, tropisetron e dolasetron) foram avaliados quanto à inibição do transporte de OCT2 e MATE1 em células HEK293 usando ASP plus como substrato (Figura 3). Uma diminuição dependente da concentração em ASP mais captação foi observada em células que expressam OCT2- e MATE1-na presença de todos os cinco antagonistas de 5-HT3 testados em uma faixa de concentrações. Os valores de IC50 para a inibição de ASP mais acúmulo por antagonistas de 5-HT3 usando as faixas de concentração testadas são mostrados na Tabela 1. Com exceção de granisetron, os outros antagonistas de 5-HT3 inibiram MATE1 mais potente do que eles OUT2. O transporte mediado por OCT2-foi inibido em até ~90%, enquanto o transporte mediado por MATE1-foi inibido em até ~70% nas concentrações testadas.
Em geral, a captação de ASP plus pelas células EV não foi alterada em grande medida pelos antagonistas 5-HT3. No entanto, notou-se que o palonossetrom e o tropisetron estimularam a captação adicional de ASP mais nas células EV e a maior concentração de granisetron causou uma pequena diminuição no acúmulo de ASP mais.
2.3. Caracterização do Transporte Transcelular e Acumulação Intracelular de ASP plus em OCT2/MATE1-Expressão de Células MDCK
Para investigar a contribuição combinada de OCT2 e MATE1 na secreção transepitelial, experimentos subsequentes foram realizados em células MDCK que polarizam com superfícies basolateral (OCT2) e apical (MATE1). A expressão da proteína OCT2 e MATE1 foi confirmada em células MDCK duplamente transfectadas usando Western blotting (Figura 4A). O transporte transcelular do substrato de sonda catiônica ASP plus (25 uM) foi testado nestas células usando inserções Transwell. O transporte basolateral para apical (B para A) de ASP plus foi muito maior (até 2.{14}}vezes em 120 min) do que o transporte apical para basolateral (A para B) nas células transfectadas duplamente OCT2/MATE1 (Figura 4B). A razão de efluxo B-para-A/A-para-B em 120 min foi estimada em 2,7 para células OCT2/MATE1 que suportam a secreção ativa de ASP plus . Em contraste, as células de controle exibiram muito menos ASP mais transporte em ambas as direções em comparação com as células OCT2/MATE1. O transporte B-para-A de ASP plus foi apenas significativamente maior em comparação com o transporte A-para-B em células de controle em 90 (1.3-vez) e 120 min (1.7-vez) ). Todos os ensaios de inibição adicionais foram realizados na direção B-para-A.
A capacidade de produtos químicos para inibir ASP mais fluxo e acumular em células transfectadas OCT2/MATE1 nas condições de teste especificadas foi avaliada usando três inibidores de controle positivo (cimetidina 5 e 50 uM, pirimetamina 1 uM e olanzapina 20 uM) (Figura 4C). A cimetidina é um conhecido inibidor de OCT2 e MATE1, com maior potência para MATE1 (Tabela 1) [18]. A pirimetamina é um inibidor específico de MATE1 [23], enquanto a olanzapina inibe o OCT2 de forma mais potente (Figura S1 suplementar) [18,20]. Todos os três produtos químicos inibiram o fluxo transcelular de ASP plus (18 por cento cimetidina 5 uM, 40 por cento cimetidina 50 uM, 36 por cento pirimetamina 1 uM e 28 por cento olanzapina 20 uM a 120 min).
O acúmulo de ASP mais intracelularmente também foi quantificado em lisados em 120 min. A cimetidina e a pirimetamina aumentaram o acúmulo intracelular de ASP plus em 1.8- vezes e 1.3-vez (devido à inibição de MATE1 principalmente), respectivamente, enquanto a olanzapina diminuiu o acúmulo intracelular de ASP plus em 51 por cento (devido à inibição de OCT2). Nas células de controle, nenhuma inibição significativa do transporte B-para-A de ASP plus foi observada em nenhum dos pontos de tempo. Nas células de controle, também não houve alterações significativas no acúmulo intracelular de ASP plus em comparação com as células de controle do veículo, exceto por uma modesta diminuição no acúmulo de ASP plus na presença de olanzapina 20 uM.
2.4. Inibição do transporte transcelular de ASP plus por 5-antagonistas HT3 em OCT2/MATE1-expressando células MDCK
Os cinco antagonistas 5-HT3 (ondansetron, palonosetron, granisetron, tropisetron e dolasetron) foram avaliados quanto à sua capacidade de afetar o transporte transcelular e o acúmulo intracelular de ASP plus em células transfectadas com OCT2/MATE1 (Figuras 5 e 6). A cimetidina (50 uM) foi incluída em cada experimento em um conjunto paralelo de Transwells como controle positivo. Curiosamente, todos os cinco antagonistas de 5-HT3 exibiram vários graus de inibição no transporte transcelular B-para-A de ASP plus (Figura 5). Comparado com as células tratadas com veículo, o ondansetron inibiu o transporte B-para-A de ASP plus de maneira dependente da concentração, com 36 por cento de inibição em 120 min na concentração mais alta testada (20 uM). Palonosetrona e tropisetrona também exibiram uma inibição dependente da concentração de ASP mais secreção, que foi significativa em 10 e 20 uM para todos os pontos de tempo. A inibição da secreção de ASP mais foi observada com palonossetrom e tropisetron a 20 uM. Dolasetron a 10 e 20 uM inibiu ASP mais transporte em apenas 120 min. Por último, o granisetron não alterou o transporte B-para-A de ASP plus em nenhuma concentração testada. As células de controle não mostraram inibição significativa no transporte B-para-A de ASP plus com qualquer um dos antagonistas 5-HT3 (dados não mostrados).
2.5. ASP mais acumulação intracelular em OCT2/MATE1-Expressão de células MDCK a seguir
Tratamento com 5-antagonistas HT3
Baixas concentrações (0,5 e 2,5 uM) de ondansetron resultaram em um aumento de 1.3-vez no ASP intracelular mais acúmulo em células que expressam OCT2/MATE1-, enquanto não houve diferença em comparação com veículos em concentrações mais elevadas (10 e 20 uM) (Figura 6). No entanto, nas células controle, houve uma diminuição (40 por cento) no acúmulo de ASP plus em altas concentrações de ondansetron. Em células OCT2/MATE1, tropisetron e granisetron aumentaram o acúmulo de ASP mais (1,5 e 1.{17}}vezes, respectivamente) na concentração mais alta (20 uM). Não foram observadas alterações significativas na acumulação de ASP mais com palonossetrom ou dolasetron.
3. Discussão
OCT2 e MATE1 são os principais transportadores que coordenam a secreção renal de cátions orgânicos. Eles compartilham vários substratos sobrepostos, incluindo metformina, cisplatina, lamivudina e entecavir, bem como 5-drogas antagonistas de HT3 [15–20,24]. Estudos anteriores sugeriram que os antagonistas de 5-HT3 também podem inibir o transporte por OCT2 e MATE1. Mais notavelmente, o ondansetron demonstrou reduzir o transporte de cisplatina e metformina pelo MATE1 [19]. O presente estudo teve como objetivo estender este trabalho anterior para comparar cinco antagonistas 5-HT3 por sua capacidade de inibir OCT2 e MATE1 individualmente quando superexpressos em células HEK293 e quando coexpressos em células MDCK e cultivados em inserções Transwell. Ondansetron e palonosetron foram capazes de inibir a absorção de um produto químico catiônico de sonda, ASP plus, em células HEK293 que expressam OCT2 ou MATE1, principalmente em concentrações tão baixas quanto 0.1–0.5 uM . Da mesma forma, granisetron, tropisetron e dolasetron também foram capazes de inibir cada transportador (em concentrações mais altas, no entanto). Usando células MDCK transfectadas duplamente com OCT2/MATE1, o ondansetron inibiu a secreção de ASP mais basolateral para apical em todas as concentrações testadas (0,5-20 uM), o que foi observado apenas em concentrações mais altas para palonossetrom, tropisetron e dolasetron. Esses dados obtidos usando um substrato fluorescente de sonda, sugerem o potencial para interações medicamentosas mediadas por OCT2- e MATE1-com 5-antagonistas de HT3.
Os dados gerados nas células transfectadas duplamente OCT2/MATE1 concordam amplamente com os dados HEK293, com exceção do granisetron. Ondansetrona, palonossetrom e tropisetrona exibiram inibição dependente da concentração do transporte B-para-A de ASP plus com a ordem de potências refletindo aquela observada com a inibição de MATE1 observada em células HEK293. Surpreendentemente, o granisetron não exibiu nenhuma inibição significativa em células OCT2/MATE1 MDCK, mesmo em concentrações cinco vezes acima da concentração de IC50 observada em células HEK293 expressando OCT2 ou MATE1. Como as células MDCK se assemelham a células tubulares nativas em maior extensão do que as células HEK293, existe a possibilidade de a disposição de granisetron ser alterada devido à expressão de ortólogos de transportadores endógenos de OCT2 ou MATE1, ou potencialmente outros transportadores. Por exemplo, as células MDCK expressam altamente o transportador da glicoproteína P canina [25], o que pode levar ao efluxo de granisetron. Apoiando esta especulação está o fato de que um polimorfismo de nucleotídeo único no transportador MDR1/ABCB1 humano melhorou a eficácia clínica do granisetron para o tratamento de vômitos [26]. Esses dados sugerem que o granisetron pode ser um substrato para a glicoproteína P canina, causando uma alteração na concentração intracelular exposta ao transportador MATE1.
Embora haja muita sobreposição entre os substratos e os inibidores dos transportadores OCT e MATE, existem distinções. As interações medicamentosas baseadas no transportador podem muitas vezes depender da identidade do substrato da vítima que está sendo avaliada, como foi demonstrado para OCT2 [27-29]. Para OCT2, a seleção do substrato catiônico tem um impacto quantitativo e qualitativo na extensão e tipo de inibição [27,28]. Em contraste, a constante de Michaelis aparente do substrato transportado e os valores de IC50 para a inibição de MATE1 em quatro substratos diferentes foram semelhantes [30]. Esses dados sugerem que existe um sítio de ligação compartilhado para a interação de substratos e inibidores na superfície externa de hMATE1. Como resultado, as interações de drogas antagonistas de 5-HT3 com OCT2 e MATE1 podem ocorrer por meio de diferentes mecanismos, apesar de sua natureza catiônica compartilhada. Estudos futuros são necessários para avançar o estudo atual usando um substrato de sonda e avaliando as interações com substratos específicos de drogas, como cimetidina, metformina e cisplatina.
Classes adicionais de drogas além dos 5-antagonistas de HT3 também são usadas para prevenir náuseas e vômitos. Em estudos preliminares, avaliamos a capacidade de outras drogas antieméticas de inibir o transporte de ASP plus mediado por OCT2 e MATE1-em células HEK293. Curiosamente, a olanzapina, a proclorperazina e a metoclopramida inibiram a atividade de OCT2 em uma faixa de concentrações (Figura complementar S1). Nenhuma dessas drogas inibiu a atividade de MATE1 em uma concentração de 10 uM (dados não mostrados). Outros antieméticos, incluindo aprepitant e dexametasona, não tiveram impacto na absorção de ASP mais em OCT2- ou MATE{10}}expressando células HEK293 (dados não mostrados). Como resultado, pode haver o potencial de outros medicamentos antieméticos (olanzapina, proclorperazina e metoclopramida) coadministrados com 5-antagonistas de HT3 também impactarem a secreção renal de cátions, principalmente por sua capacidade de inibir a captação de OCT2.
É importante considerar quão bem os modelos in vitro recapitulam características do transporte endógeno em humanos.rins. Os níveis de proteína humana OCT2 e MATE1 foram previamente quantificados em células MDCK duplamente transfectadas por LC-MS/MS (hOCT2 e hMATE1 foram 28,6 e 6,9 fmol/ug de proteína de membrana, respectivamente) [31]. Em comparação, os estudos que determinam a expressão da proteína no córtex renal humano e nas membranas renais humanas revelam uma diferença mais modesta na expressão entre os dois transportadores ou ainda maior expressão de MATE1 (OCT2 7,4 pmol/mg, MATE{{14 }},1 pmol/mg) [22] e (OCT2 5 fmol/ug, MATE1 10 fmol/ug) [32]. Essas diferenças entre os modelos in vitro e a expressão humana endógena de OCT2 e MATE1 devem ser consideradas e levadas em consideração no desenvolvimento de modelos farmacocinéticos de base fisiológica para potenciais interações medicamentosas catiônicas nos rins.
O estudo atual concentrou-se principalmente na secreção renal de drogas catiônicas. No entanto, é importante reconhecer que o fígado também expressa OCT1 e MATE1, que permitem a depuração biliar de produtos químicos catiônicos. Isso é importante porque os antagonistas de 5-HT3 diferem em sua estrutura, metabolismo, ligação a proteínas e vias de depuração. Estruturalmente, os antagonistas do receptor 5-HT3 contêm uma amina básica, um sistema de anel aromático ou heteroaromático e uma carbonila (ou estrutura similar) que é coplanar à região aromática (Figura 1) [33]. Notavelmente, a estrutura da fração amina difere para ondansetron e inclui um imidazol, enquanto 6-anéis de membros são incorporados nos outros 5-antagonistas de HT3. A relevância dessas diferenças estruturais na interação com OCT2 e/ou MATE1 requer mais investigação, mas pode explicar os efeitos mais significativos do ondansetron em concentrações mais baixas. Além disso, alguns 5-antagonistas de HT3 são eliminados extensivamente pelarinscomo pais ou metabólitos (como palonossetrom e tropisetron). Muitos dos antagonistas 5-HT3 (incluindo ondansetrona, tropisetrona, palonossetrom e granisetrona) são altamente metabolizados (48-95 por cento) pelas enzimas do citocromo P450 no fígado. Recentemente, estudos mostraram que os metabólitos podem desempenhar um papel maior nas interações medicamentosas do que se pensava anteriormente [34]. Testes adicionais do transporte de OCT2 e MATE1 com os principais metabólitos de antagonistas de 5-HT3 que excedem 25 por cento da exposição sistêmica original são garantidos. Da mesma forma, dentro da classe química, existem drogas com meias-vidas curtas (< 6="" h,="" ondansetron,="" and="" tropisetron),="" moderate="" half-lives="" (8–9="" h,="" granisetron,="" and="" dolasetron),="" and="" a="" long="" half-life="" (40="" h,="" palonosetron).="" these="" factors="" should="" be="" considered="" when="" evaluating="" potential="" drug-drug="" interactions="" using="" in="" vitro="" transporter="">
Com base no 2020 FDA Guidance for In Vitro Metabolism and Transport-Mediated Drug-Drug Interaction Studies [35], um medicamento tem o potencial de inibir o transportador in vivo se: o valor Cmax (não ligado)/IC50 é Maior ou igual a 0,1. Com base nessas diretrizes, os valores de MATE1 Cmax/IC50 para ondansetron indicam potenciais interações medicamentosas in vivo usando ASP plus como substrato de sonda. A comparação dos valores de IC50 para os outros 5-antagonistas de HT3 com seus valores de Cmax (variando de nanomolar alto a micromolar baixo) não sugeriria um risco de interação medicamentosa, pelo menos com ASP plus como substrato da vítima. Da mesma forma, atualmente não conhecemos as concentrações intrarrenais de 5-antagonistas de HT3, o que seria importante para avaliar potenciais interações medicamentosas de MATE1. Existem dados clínicos limitados avaliando as interações medicamentosas relacionadas ao ondansetrom com substratos OCT/MATE. Por exemplo, os níveis de creatinina e metformina são aumentados em indivíduos saudáveis por ondansetrona devido à inibição do transportador renal [21,36]. Curiosamente, o ondansetron não apenas reduziu a depuração renal da metformina, mas também melhorou as medidas de tolerância à glicose [21]. Em outros estudos clínicos, foi relatado que ondansetrona aumenta a nefrotoxicidade de um medicamento substrato, alterando potencialmente a secreção mediada por transportador dentro dorim[37-39]. Juntos, esses dados garantem uma investigação mais aprofundada das interações medicamentosas de ondansetron através da inibição dos transportadores OCT e MATE.
Em resumo, esses dados in vitro indicam que muitos dos 5-antagonistas de HT3 têm maior potência de inibição de MATE1, aumentando o potencial de concentração tubular aumentada de drogas catiônicas. Além disso, o ondansetron foi suficientemente potente para aumentar a concentração intracelular de um substrato de sonda, ASP plus em concentrações próximas da Cmax clinicamente relevante. Esses dados estão de acordo com estudos anteriores in vivo em camundongos onde foi observado aumento da nefrotoxicidade mediada por cisplatina com a administração concomitante de ondansetrona [19]. Com base nos critérios atuais para avaliar o potencial clínico de interação medicamentosa, os outros 5-antagonistas de HT3, bem como os medicamentos antieméticos testados em nosso estudo, provavelmente representam menos risco de interação medicamentosa clinicamente relevante devido a concentrações plasmáticas e constantes de inibição mais altas.
4. Materiais e Métodos
4.1. Produtos químicos
4-(4-(dimetilamino)estiril)-N-metil piridínio iodeto (ASP plus ) foi adquirido da Life Technologies (Grand Island, NY, EUA). O tropisetron foi adquirido da Abcam (Cambridge, MA, EUA). Todos os outros produtos químicos são da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
4.2. Linhas de células e cultura de células
O controle Empty Vector (EV) (pcDNA5-transfectado) e as linhas de células Flp-In de rim embrionário humano (HEK)293 expressando de forma estável os transportadores MATE1 e OCT2 humanos foram generosamente fornecidas pela Dra. Kathy Giacomini da Universidade da Califórnia, San Francisco. As células HEK293 foram cultivadas em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 ug/mL de estreptomicina e 200 ug/mL de higromicina B. Vector (pcDNA3. 1 plus e pcDNA3.1/Hygro(plus)) e linhagens de células de rim canino (MDCK) transfectadas duplamente com OCT2/MATE1 humano foram generosamente fornecidas pela Dra. Joanne Wang da Universidade de Washington, Seattle, WA. As células MDCK foram mantidas em meio mínimo essencial (MEM) suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino, 500 ug/mL de G418 e 200 ug/mL de higromicina B. Todas as linhagens celulares foram cultivadas em uma incubadora umidificada a 37oC com 5 por cento de CO2.
4.3. Ensaios de Inibição de Captação e Efluxo em Células HEK293
Células HEK293 superexpressando OCT2- e MATE{1}}foram semeadas em placas de poços 24-revestidos com poli-D-lisina (Fisher Scientific, Hanover Park, IL, EUA) e cultivadas por 24 h até aproximadamente 90% confluente. Após lavar uma vez com solução salina tamponada de Hank (HBSS) pré-aquecida, as células foram pré-incubadas por 30 min a 37oC com vários antagonistas 5-HT3 para células OCT2 ou em uma solução de NH4Cl 30 mM em HBSS a pH 6,5 para células MATE1 para células intracelulares acidificação. A captação em células OCT2 foi iniciada através da exposição a 10 uM de substrato fluorescente ASP plus diretamente no meio de incubação. A captação em células MATE1 foi iniciada pela aplicação de HBSS em pH 7,4 contendo 5-antagonistas de HT3 e 10 uM de substrato fluorescente ASP plus . Após incubação por 1 min a 37oC em um agitador, a absorção de substrato foi interrompida pela adição de HBSS gelado contendo 500 uM de cimetidina. O meio foi removido e lavado quatro vezes com HBSS gelado. As células foram lisadas com 1 por cento de Triton X-100. A fluorescência foi detectada usando um leitor de microplacas Spectramax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) nos seguintes comprimentos de onda (Excitação 485 nm/Emissão 495 nm). A fluorescência intracelular foi normalizada para a concentração total de proteínas de lisados celulares de cada poço usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA). Os experimentos foram repetidos três vezes separadas, com três a quatro repetições em cada experimento.
4.4. Estudos Transwell em Células MDCK-OCT2/MATE1
Control and OCT2/MATE1-expressing MDCK cells were evaluated for protein expression of OCT2 and MATE1 using SDS-PAGE and western blotting with specific primary antibodies (OCT2, sc292622 1:500 and MATE1, sc133390 1:250, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), followed by an antirabbit HRP-conjugated secondary antibody (1:1000, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) and Super Signal Western Dura Extended Duration Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Detection was performed with a FluorChem imager (ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA). Both MDCK cell lines were seeded on 0.4 um transwell inserts (VWR, Radnor, PA, USA) at a density of 2 × 105 cells/cm2. Transport experiments were performed 3 to 5 days after seeding. The integrity of MDCK monolayers was verified by measuring transepithelial electrical resistance (TEER) >150 o*cm2 usando um ohmímetro de volt epitelial, EVOM2 (World Precision Instruments, Sarasota, FL). A formação adequada de junções apertadas também foi verificada pela medição da permeabilidade passiva do amarelo lúcifer na direção basolateral-apical (B-to-A). Lúcifer amarelo (20 uM) foi aplicado na câmara basolateral por 1 h, e o meio foi coletado da câmara apical. A fluorescência amarela de Lúcifer foi lida em um comprimento de onda de excitação de 430 nm e um comprimento de onda de emissão de 538 nm. Os valores médios de permeabilidade passiva (Papp) foram de 7 × 10-7 cm/s, o que está de acordo com os valores da literatura [40].
Depois de lavar as células uma vez com solução salina tamponada de Hank (HBSS) pH 7,4, os estudos de transporte foram iniciados após a aspiração do tampão de lavagem das câmaras apical e basal. As células foram incubadas com 5-antagonistas de HT3 na câmara apical em HBSS pH 6.0 e 5-antagonistas de HT3 com ASP plus (25 uM) na câmara basolateral em HBSS pH 7,4 e incubadas a 37 oC por 120 min. Para medir o transporte transcelular dependente do tempo, uma alíquota do meio de incubação (100 uL) da câmara apical (câmara receptora) foi coletada em 40, 60, 90 e 120 min e substituída por um volume igual de tampão fresco contendo {{ 19}}antagonista de HT3 ou o produto químico de controle positivo na concentração original. Após 120 min, o meio de tratamento foi removido e os Transwells foram lavados três vezes com HBSS gelado. As células foram lisadas com 1 por cento de Triton X-100. A fluorescência foi detectada usando o Spectramax Microplate Reader nos seguintes comprimentos de onda (Excitação 485 nm/Emissão 495 nm). A fluorescência intracelular foi normalizada para a concentração de proteína total de lisados celulares de cada transwell usando o ensaio BCA. As experiências foram realizadas em três inserções individuais de Transwell.
4.5. Análise estatística
GraphPad Prism v6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA) foi usado para análise estatística. Km e Vmax foram calculados usando regressão não linear (equação de cinética enzimática de Michaelis–Menten, (Y=Vmax × X/(Km mais X), ajuste para mínimos quadrados). Os dados com duas variáveis foram analisados usando um modelo de dois way ANOVA seguido de one-way ANOVA e/ou teste posthoc de Dunnett para comparações múltiplas. Os valores de IC50 foram calculados por meio de uma regressão não linear para mínimos quadrados. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas em p <>
Materiais Complementares:Os itens a seguir estão disponíveis on-line em https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22126439/s1.
Contribuições do autor:Conceituação, BG, MSJ, LMA; metodologia, BG, XW; análise formal, BG, LMA; recursos, LMA; redação—preparação do rascunho original, BG, LMA; redação — revisão e edição, MSJ, LMA; administração de projetos, LMA; aquisição de financiamento, MSJ, EAJ, LMA Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento:Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (Grant GM123330) e pelo Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental (subvenções ES005022, ES007148), Instituto Nacional do Câncer (Subsídios CA072720, CA046934, CA008748) e o Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (Grant DK093903), componentes dos Institutos Nacionais de Saúde.
Declaração do Conselho de Revisão Institucional: Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado:Não aplicável.
Declaração de disponibilidade de dados:Não aplicável.
Agradecimentos:Apreciamos muito as generosas linhas de células transportadoras HEK293 de Kathy Giacomini e as linhas de células MDCK transfectadas de Joanne Wang.
Conflitos de interesse:Os autores declaram não haver conflito de interesses.
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