Atividades antienvelhecimento in vitro de extratos etanólicos de rambutan rosa (Nephelium Lappaceum Linn.) para aplicações na pele, parte 1

abstrato

O envelhecimento da pele é caracterizado por características como rugas, perda de elasticidade, flacidez, aparência de textura áspera, melasma e sardas. Vários tipos de pesquisa se concentraram na prevenção e tratamento do envelhecimento da pele com muitos ingredientes naturais. Este estudo teve como objetivo avaliar as atividades antienvelhecimento para o envelhecimento da pele dos extratos etanólicos de rambutan rosa (PR) (Nephelium lappaceum Linn.) de folhas (L), ramos (B), sementes (S) e cascas de frutos maduros (R) e jovens (Y). Os rendimentos de extração de todo o Rambutan Rosa (PR) extraído pela Maceração (M) e a extração Soxhlet (Sox) usando 95 por cento de etanol como solvente, variaram de 10,62 por cento a 30 0,63 por cento . Os flavonoides foram encontrados como os principais fitoquímicos em quase todos os extratos de PR. Os extratos PR-YM e PR-Y-Sox forneceram os maiores teores de fenólicos totais pelo ensaio de Folin-Ciocalteu de 67,60 ± 4,38 mgGAE/ge teores de flavonoides totais pelo ensaio colorimétrico de cloreto de alumínio modificado de 678,72 ± 23,59 mgQE/g, respectivamente. Os extratos de PR-LM apresentaram as três maiores atividades antioxidantes; eliminação de radicais livres (SC50 de 0.320 ± 0.{{40}}70 mg/mL) , inibição da peroxidação lipídica (LC50 de 00,274 ± 0,029 mg/mL) e atividade de quelação de metais (MC50 de 0,203 ± 0,021 mg/mL). Todos os extratos de PR a 0,01 e 0,1 mg/mL não mostraram citotoxicidade em células B16F10 e fibroblastos de pele humana, respectivamente. Da mesma forma, o extrato PR-R-Sox exibiu a maior anti-melanogênese em células B16F10 (52,7 ± 0,9 por cento), e a atividade de inibição da tirosinase de cogumelo (IC50 de 0,04 ± 0,02 mg/mL), que foi significativamente comparável ao ácido kójico (p < 0,05). O extrato PR-Y-Sox mostrou biossíntese de colágeno pelo método Sirius Red, e a estimulação de genes antienvelhecimento (Sirt1 e Foxo1) em fibroblastos da pele humana pelo método RT-PCR, que foi semelhante aos padrões de ácido ʟ-ascórbico e resveratrol, respectivamente. Este estudo sugere que os extratos PR-R-Sox e PR-Y-Sox podem ser desenvolvidos como agentes antienvelhecimento naturais para clareamento e antirrugas nas indústrias cosmética, cosmecêutica e farmacêutica. 2023 O(s) autor(es). Publicado pela Elsevier BV em nome da King Saud University.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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1. Introdução

Globalmente, o envelhecimento da população no mundo está crescendo mais rápido do que todos os outros grupos etários. A Organização Mundial da Saúde estimou que a população mundial com mais de 60 anos ou mais seria de 2,1 bilhões em 2050 e enfrentará condições comuns, incluindo osteoartrite, diabetes, perda auditiva, doença de Alzheimer, doenças pulmonares obstrutivas crônicas (DPOCs), depressão e demência , cânceres e doenças neurológicas e cardiovasculares (Darawsha et al., 2021, OMS, 2021). A pele é um dos órgãos mais visíveis durante o processo de envelhecimento. O envelhecimento da pele está relacionado com a comunicação social porque a boa aparência causa uma impressão favorável e melhora a autoconfiança. O envelhecimento da pele é afetado por fatores ambientais ou externos, como poluentes atmosféricos, xenobióticos, radiação ultravioleta e tabagismo, e por fatores internos, como genética, metabolismo celular, hormônios e processos metabólicos (Darawsha et al., 2021). Muitos tipos de pesquisas recentes se concentraram em manter a pele saudável, adiando, prevenindo e tratando o envelhecimento para melhorar a aparência da pele, regenerando e estimulando processos fisiológicos naturais para proteger a pele do envelhecimento.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) provenientes do estresse oxidativo celular podem causar a indução de morte celular apoptótica pela ativação de processos inflamatórios e suas vias de sinalização, aumentando os níveis de metaloproteinases (MMPs), a degradação de lipídeos insaturados e alterando as estruturas de células fibrilares proteínas, incluindo colágeno e elastina, devido ao envelhecimento da pele (Miastkowska e Sikora, 2018, Darawsha et al., 2021). Após a melanogênese, a melanina é um pigmento polifenólico produzido nos melanossomos dos melanócitos que estão localizados nos olhos, pelos e peles dos animais e pode proteger a pele danificada pela radiação ultravioleta (Ali e Naaz, 2018). A tirosinase é a enzima contendo cobre, que pode transformar L-tirosina em L-dopa e L-dopa em odopaquinona-H plus por reações de hidroxilação e oxidação, e então passa por intermediários finalmente para melanina (Solano, 2018). As ERO também desempenham um papel significativo na regulação do estresse oxidativo celular nos melanócitos, que são células dendríticas que se localizam na camada basal da epiderme na pele. Os mediadores inflamatórios na pele, como interleucina (IL), prostaglandina E2, fator de necrose tumoral e interferon-gama, que são secretados principalmente por células Th, linfócitos, células dendríticas e monócitos, regulam a atividade estimulante da tirosinase e regulam positivamente o TYRP{{11 }} e expressão de TYRP-2 e promoção da proliferação de melanócitos relacionados à produção de melanina (Fu et al., 2020). No entanto, a superprodução e o alto acúmulo de melanina causam envelhecimento da pele, como melasma, sardas, manchas escuras, lentigo e distúrbios de hiperpigmentação, que podem ser esteticamente indesejáveis ​​(Ali e Naaz, 2018).

As sirtuínas são histonas desacetilases de classe III dependentes de nicotinamida adenina (NAD plus) que regulam a senescência e apoptose celular e o crescimento celular controlando p53, fatores de transcrição forkhead (FOXOs) e receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama (PPAR-c) envolvendo regulações do metabolismo, diferenciação celular, sobrevivência e envelhecimento. (Filho et al., 2021). O SIRT1, SIRT6 e raramente o SIRT7 na família das sirtuínas foram regulados para problemas dermatológicos, incluindo inflamação da pele, infecção cutânea, câncer, doenças autoimunes, doenças dermatológicas hereditárias, especialmente envelhecimento da pele (Son et al., 2021). Além disso, FOXO1 é um fator de transcrição localizado no citoplasma. SIRT1 desacetila FOXO1 e ativa a transcrição de FoxO1 em várias vias, como MAPK (proteína quinase ativada por mitógeno), proteína quinase (AKT) e vias homeobox pancreática e duodenal-1 (Pdx1) (Sin et al., 2015) . O aumento da expressão do mRNA de Sirt1 e Foxo1 regula o metabolismo da glicose, reparo do DNA, neuroproteção, diferenciação, proteção vascular e secreção de insulina; e diminui o envelhecimento e doenças relacionadas à idade, como estresse oxidativo, senescência celular, neurodegeneração, inflamação, resistência à insulina, doenças cardiovasculares, adiposidade e esteatose hepática, bem como envelhecimento da pele (Son et al., 2021).

O Pharmaceuticals (Drugs) and Cosmetics Act de 1940 define uma droga como “todos os medicamentos para uso interno ou externo por seres humanos ou animais, e todas as substâncias destinadas a serem usadas para, ou no diagnóstico, tratamento, mitigação ou prevenção de qualquer doença ou distúrbio em humanos ou animais." Cosmético é qualquer artigo destinado a ser esfregado, derramado, borrifado ou pulverizado, introduzido ou aplicado a qualquer parte do corpo humano para limpeza, embelezamento, promoção de atratividade ou alteração do aparência, e inclui qualquer artigo destinado a ser usado como componente de cosméticos. Cosmecêuticos são híbridos cosmético-farmacêuticos destinados a melhorar a saúde e a beleza por meio de ingredientes que influenciam as texturas e funções biológicas da pele (Joshi e Pawar, 2015). cosméticos, cosmecêuticos e produtos farmacêuticos contêm compostos ativos que neutralizam os radicais livres, como vitamina E, vitamina C, glutationa e coenzima Q10; e retardam o envelhecimento da pele devido a rugas e melasma, como ácidos nucleicos, hidrolisados ​​de proteínas, extratos de algas, óleos vegetais, fitohormônios , citocinas e neuropeptídeos (Kim et al., 2015, Miastkowska e Sikora, 2018), bem como polifenóis e flavonoides de vários extratos naturais de plantas, como os extratos de Vigna subterrânea, Stichopus japonicus, Citrus aurantifolia, Ananus comosus e Manihot esculenta (Chutoprapat et al., 2020; Ding et al., 2020 Boonpisuttinant et al., 2022, Jampa et al., 2022).

O rambutan rosa ou Ngo See Chom Pu (Nephelium lappaceum L.) é uma planta da família das Sapindaceae, que é a planta indígena do distrito de Klung, província de Chanthaburi, na parte oriental da Tailândia. Os frutos do rambutan rosa (PR) são doces e de bom gosto. Possuem casca fina com casca rosa-amarelada e espinha rosa-claro com ponta verde-clara, diferente de outras espécies como Ngo Rongrien e Ngo Nasarn, que possuem casca e espinhas vermelho-claro. Os principais fitoquímicos encontrados nas plantas de rambutan são ácido elágico, corilagina, geraniina, quercetina e rutina (Phuong et al., 2019, Phuong et al., 2020). Foi relatado anteriormente que as cascas de rambutan de outras espécies têm um alto nível de compostos fenólicos e muitas atividades biológicas, como eliminação de radicais DPPH, anti-inflamatória, antiviral, anticancerígena e antibacteriana (Chingsuwanrote et al ., 2016; Hernández-Hernández et al., 2019; Rohman, 2017; Sukmandari et al., 2017; Thitilertdecha e Rakariyatham, 2011). No entanto, os extratos de rambutan rosa não têm nenhum relatório científico para atividades biológicas, especialmente atividade antienvelhecimento para fins estéticos e de saúde da pele. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar e avaliar o potencial dos extratos de PR em aplicações cutâneas em cosméticos, cosmecêuticos e farmacêuticos. As investigações de atividades biológicas antienvelhecimento in vitro, incluindo inibição da tirosinase e antimelanogênese, biossíntese de colágeno e estimulação das expressões de mRNA de Sirt1 e Foxo1, e as três atividades antioxidantes, bem como a citotoxicidade em fibroblastos dérmicos humanos, indicam a eficiência e segurança dos extratos de PR que podem ser posteriormente desenvolvidos para produtos naturais para a pele.

2. Materiais e métodos

2.1. Preparação e extração

As cinco partes do rambutan rosa (PR), incluindo folhas (L), galhos (B), sementes (S) e cascas de frutas maduras (R) e jovens (Y), foram coletadas no distrito de Klung, Chantaburi, Tailândia, de junho a Agosto de 2017. Os espécimes foram identificados por um botânico no Forest Herbário da Tailândia e registrados no herbário (Código: RSPG-RMUTT-0102) de Produtos Naturais Inovadores da Thai Wisdom Research Unit, Faculdade de Medicina Integrativa, RMUTT , Pathum Thani, Tailândia. Todas as partes do rambutan rosa foram cortadas, lavadas com água da torneira, secas a 60 graus em um forno de ar quente e moídas em pó usando um moedor. Todas as partes dos rambutans rosa foram extraídas por maceração e extração de Soxhlet usando 95 por cento de etanol como solvente, que é o mais usado para a extração de plantas medicinais por ser seguro e econômico. Resumidamente, 10 g de cada um dos pós PR foram extraídos por (1): Maceração (M) em 100 mL de etanol 95 por cento (v/v) (Bangkok Alcohol Industrial, Tailândia) com agitação a 200 rpm à temperatura ambiente (25 ± 2 graus) por 48 h; e (2): a extração Soxhlet (Sox) com 100 mL de etanol 95 por cento (v/v) a 80 ± 5 graus C por 24 h. Em seguida, os extratos foram primeiramente filtrados em algodão e depois passados ​​por um papel de filtro conectado a uma bomba de vácuo. Os filtrados foram coletados, reunidos e secos por um evaporador rotativo. Os extratos brutos de PR foram acondicionados em frascos de vidro e armazenados a 4 graus em geladeira até o momento de sua utilização. Os rendimentos da extração foram realizados com base no peso seco. O etanol 95 por cento foi usado como solvente para dissolver os extratos PR antes dos experimentos.

2.2. Fitoquímicos, fenólicos totais e flflavonóides e conteúdo de quercetina

Fitoquímicos como antraquinonas, alcalóides, carotenóides, glicosídeos, flavonóides, taninos e xantonas dos extratos de PR foram investigados conforme descrito anteriormente (Boonpisuttinant et al., 2022). Os resultados qualitativos são expressos como ( mais ) para a presença e (-) para a ausência de fitoquímicos. Os conteúdos fenólicos totais (TPC) foram analisados ​​pelo ensaio de Folin-Ciocalteu conforme descrito anteriormente (Boonpisuttinant et al., 2022). Resumidamente, 50 lL dos extratos de PR, 75 lL do reagente Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, EUA) e 75 lL de Na2CO3 a 7,5% (p/v) (Loba Chemie, Índia) foram adicionados a um {{13} } microplaca bem, misture delicadamente e depois incube à temperatura ambiente em um local escuro por 90 min. Em seguida, as absorbâncias no comprimento de onda de 725 nm foram medidas por um leitor de microplacas. Os teores fenólicos foram calculados a partir da curva padrão do ácido gálico (Sigma-Aldrich, EUA). Os resultados foram expressos em mg de equivalentes de ácido gálico (GAE)/g de extrato.

O conteúdo total de flavonoides (TFC) pelo método do cloreto de alumínio modificado foi analisado seguindo Shraim et al. (2021). Resumidamente, 50 lL dos extratos de PR, 25 lL de AlCl3 a 10 por cento (BDH Prolabo Chemicals, Bélgica) e 100 l de NaNO2 a 5 por cento (Loba Chemie, Índia) foram adicionados em uma microplaca 96-poço. Após 5 min de incubação, as placas foram adicionadas 25 l de NaOH 1 M (BDH Prolabo Chemicals, Bélgica). A reação foi permitida por incubação à temperatura ambiente por 10 min. Em seguida, as absorbâncias no comprimento de onda de 450 nm foram medidas por um leitor de microplacas. Os conteúdos de flavonoides foram calculados a partir da curva padrão da quercetina (Sigma-Aldrich, EUA). Os resultados foram expressos em mg de equivalentes de quercetina (QE)/g de extrato.

O conteúdo de quercetina nos extratos de PR foi investigado pelo método HPLC (Shaikh e Jain, 2018). Resumidamente, uma quantidade precisamente pesada da quercetina padrão foi dissolvida em metanol em um balão volumétrico de 100 mL, para obter uma solução estoque de 1,000 lg/mL. As soluções padrão foram subseqüentemente diluídas em série 2-vezes para 3,125 mg/mL. Para o preparo das amostras, 2,5 g dos extratos foram dissolvidos em 25 mL de metanol em 25 mL do balão volumétrico para obter 1,000 mg/mL. Todas as análises foram realizadas em um sistema HPLC infinito Agilent 1260 (Waters, Milford, MA, EUA) equipado com um detector de matriz de fotodiodos. A coluna analítica utilizada foi uma coluna estendida Agilent Zorbax C18 (5l × 100 mm × 4,6 mm) com uma fase móvel de metanol: 0,1 por cento de ácido ortofosfórico (75:25) a uma taxa de fluxo de 0,6 mL/min. A temperatura da coluna foi mantida a 25 graus e o comprimento de onda de detecção foi ajustado para 370 nm. Todas as soluções e solventes foram filtrados através de um filtro de 0,22 lm e desgaseificados. O volume de injeção da amostra foi de 10 l, e o tempo de execução foi de 8 min.

2.3. Atividade antioxidante

2.3.1. Atividade de eliminação de radicais livres

A atividade de eliminação de radicais livres dos extratos de PR foi avaliada pelo método 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) de Boonpisuttinant et al. (2019). Uma quantidade de 100 lL de extratos de PR ou ácido ʟ-ascórbico (Sigma-Aldrich, EUA) como controle positivo e 100 lL de solução de 0,1 mg/mL de DPPH (Sigma-Aldrich, EUA) em etanol absoluto foram adicionados a uma Microplaca de 96 poços. Após incubação à temperatura ambiente em local escuro por 30 min, as absorbâncias foram medidas no comprimento de onda de 515 nm usando um leitor de microplacas. As porcentagens de atividade de eliminação do radical DPPH foram calculadas de acordo com a seguinte fórmula:

porcentagem de atividade de eliminação de radicais DPPH {{0}}[A0 -A1/A0]×100 (1)

Onde A0 é a absorbância do controle e A1 é a absorbância das amostras. As concentrações fornecendo 50 por cento de eliminação (SC50) foram então calculadas a partir do gráfico plotado entre a porcentagem de eliminação de radicais livres e as concentrações da amostra.

2.3.2. Inibição da peroxidação lipídica

A inibição da peroxidação lipídica dos extratos de PR foi avaliada pelo método do tiocianato férrico Boonpisuttinant et al. (2019). Uma quantidade de 50 L de extratos PR ou a-tocoferol (Sigma-Aldrich, EUA) como controle positivo e 50 L de ácido linoleico em 50 por cento (v/v) DMSO (Sigma-Aldrich, EUA) foram adicionados a uma Microplaca de 96 poços. A reação foi iniciada pela adição de 50 lL de 5 mM NH4- SCN e 50 lL de 2 mM FeCl2. Após incubação a 37 graus em um local escuro por 60 min, as absorbâncias em um comprimento de onda de 490 nm foram medidas usando um leitor de microplacas. As porcentagens de inibição da peroxidação lipídica foram calculadas de acordo com a seguinte fórmula:

Onde A0 é a absorbância do controle e A1 é a absorbância das amostras. As concentrações que fornecem 50 por cento de inibição da peroxidação lipídica (LC50) foram calculadas a partir do gráfico traçado entre a porcentagem de inibição da peroxidação lipídica e as concentrações da amostra.

2.3.3. Quelação de metais

A quelação de metais dos extratos de PR foi testada pelo método de quelação de íons ferrosos (FIC) por Boonpisuttinant et al. (2019). Uma quantidade de 50 lL dos extratos de PR ou EDTA (Loba Chemie, Índia) como controle positivo, 1 mg/mL de FeCl2 e 50 lL de 1 mg/ml de ferrozina em 1 por cento de HCl (TCI, EUA) foi adicionado ao uma microplaca de 96 poços. Após incubação à temperatura ambiente em local escuro por 60 min, as absorbâncias no comprimento de onda de 570 nm foram medidas usando um leitor de microplacas. As porcentagens de quelação de metais foram calculadas de acordo com a seguinte fórmula:

Onde A0 é a absorbância do controle e A1 é a absorbância das amostras. As concentrações que fornecem 50 por cento de quelação de metal (MC50) foram calculadas a partir do gráfico traçado entre a porcentagem de quelação de metal e as concentrações da amostra.

2.4. Inibição da tirosinase de cogumelos

A atividade de inibição da tirosinase de cogumelo dos extratos de PR foi testada pelo método dopacromo modificado (Boonpisuttinant et al., 2022). Uma quantidade de 50 lL dos extratos de PR ou ácido kójico (Sisco Research Laboratories (SRL), Índia) como controle positivo, 50 lL de 0,1 mg/mL de L-tirosina (Sigma- Aldrich, EUA), 50 lL de tampão fosfato 0,1 mM e 50 lL de tirosinase de cogumelo 0,1 mg/mL (Sigma-Aldrich, EUA) foram adicionados a uma microplaca 96-poço. Antes e após a incubação a 37 graus C em um local escuro por 60 min, as absorbâncias no comprimento de onda de 450 nm foram medidas usando um leitor de microplacas. As porcentagens de inibição da tirosinase de cogumelos foram calculadas de acordo com a seguinte fórmula:

porcentagem de inibição da tirosinase de cogumelo=[(A - B)-(C - D)]/=(A - B)×100 (4)

Onde A é a absorbância do branco após a incubação, B é a absorbância do branco antes da incubação, C é a absorbância das amostras após a incubação e D é a absorbância das amostras antes da incubação. As concentrações que fornecem 50% de inibição da tirosinase (IC50 mg/mL) foram calculadas a partir do gráfico traçado entre a porcentagem de inibição da tirosinase e as concentrações da amostra

2.5. Atividades antienvelhecimento in vitro em culturas de células

2.5.1. Culturas de células

Melanomas murinos (B16F10) e fibroblastos de pele humana foram usados ​​para investigar a antimelanogênese, biossíntese de colágeno e antienvelhecimento da expressão do mRNA de Sirt1 e Foxo1, respectivamente. Estas duas células foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC), Virgínia, EUA. As células foram cultivadas em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich Biotechnology, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 10 por cento de soro bovino fetal (FBS) (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, EUA ), 100 UI/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina (Gibco BRL, Gaithersburg, EUA) nas condições padrão a 37 C sob a incubadora de 5% de CO2 antes dos experimentos.

2.5.2. Teste de citotoxicidade em fibroblastos de pele humana

As várias concentrações dos extratos de PR foram investigadas quanto à citotoxicidade nos melanomas murinos (B16F10) e fibroblastos da pele humana pelo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il )-2,5-ensaio de brometo de difenil tetrazólio (MTT) como descrito anteriormente por Boonpisuttinant et al. (2022). Os fibroblastos de pele humana na densidade de 1 × 104 células por poço foram semeados em 96-placas de poços, ajustados o volume para 180 l com o DMEM e incubados a 37 graus sob uma atmosfera de 5 por cento de CO2 por 24 h. Os extratos em várias concentrações foram então adicionados. As células foram incubadas a 37 graus C sob uma atmosfera de 5% de CO2 por 24 horas. Em seguida, as células foram lavadas com PBS 10 mM em pH 6,8 por 3 vezes e adicionado 1 mL de solução de MTT 0,5 mg/mL (Sigma-Aldrich, EUA). Após incubação em temperatura ambiente por 3 h, a solução de MTT foi removida e 100 l de dimetil sulfóxido (DMSO) foram adicionados a cada poço. As placas foram agitadas suavemente a 200 rpm por 15 min. As absorbâncias no comprimento de onda de 570 nm das soluções foram medidas usando um leitor de microplacas. As porcentagens da viabilidade celular foram calculadas de acordo com a seguinte fórmula:

Onde Acontrol é a absorbância do controle e A sample é a absorbância das amostras.

2.5.3. Antimelanogênese em células B16F10

A anti-melanogênese nas células B16F10 dos extratos de PR foi examinada usando o método descrito anteriormente por Boonpisuttinant et al. (2022). As células B16F10 na densidade de 2,5 × 105 células por poço foram semeadas em 6-placas de poços e incubadas a 37 graus sob uma atmosfera de 5 por cento de CO2 durante a noite. Em seguida, foram adicionados os extratos na concentração de 0,01 mg/mL. O ácido kójico foi usado como controle positivo. As células foram incubadas a 37 graus sob uma atmosfera de 5% de CO2 por 72 h. Depois disso, os sobrenadantes foram coletados nos tubos de microcentrífuga limpos, enquanto as células foram lavadas com tampão fosfato salino (PBS) 10 mM a pH 6,8 por 3 vezes, dissolvidas em 200 l de NaOH a 10 por cento e incubadas a 60 graus 1 h . As absorvências no comprimento de onda de 450 nm dos sobrenadantes e dos lisados ​​celulares foram medidas usando um leitor de microplacas. As porcentagens do conteúdo de melanina foram calculadas de acordo com a seguinte fórmula:

2.5.4. Biossíntese de colágeno em fibroblastos de pele humana

A biossíntese de colágeno dos extratos de PR foi examinada pelo método previamente descrito por Boonpisuttinant et al. (2022). Os fibroblastos de pele humana com uma densidade de 5 × 105 células por poço foram semeados em 6-placas de poços e incubados a 37 graus sob uma atmosfera de 5 por cento de CO2 durante a noite. Os extratos na concentração de 0,1 mg/mL foram então adicionados. O ácido ʟ-ascórbico foi usado como controle positivo. As células foram incubadas a 37 graus sob uma atmosfera de 5% de CO2 por 24 h. Em seguida, as células foram lavadas com PBS 10 mM em pH 6,8 por 3 vezes, adicionado 1 mL de solução de vermelho Sirius 0,1 por cento (p/v) (Sigma-Aldrich, EUA) em ácido pícrico saturado (Sisco Research Laboratories (SRL ), Índia) e, em seguida, incubados à temperatura ambiente por 1 h. O corante foi removido e as placas foram lavadas com 1 mL de HCl 10 mM (Merck Millipore, Alemanha) 5 vezes. Em seguida, as células foram dissolvidas pela adição de 1 mL de NaOH 0,1 M. As absorvências no comprimento de onda de 450 nm dos sobrenadantes e dos lisados ​​celulares foram medidas usando um leitor de microplacas. As porcentagens da quantidade de colágeno foram calculadas de acordo com a seguinte fórmula:

Onde, Csample era o conteúdo de colágeno das amostras e Ccontrol era o conteúdo de colágeno do controle.

2.5.5. Estimulação de genes antienvelhecimento em fibroblastos da pele humana

A estimulação dos genes antienvelhecimento (Foxo1 e Sirt1) dos extratos PR foi determinada por RT-PCR conforme descrito anteriormente por Polouliakh et al. (2020). Os fibroblastos de pele humana na densidade de 5 × 105 células por poço foram semeados em 6-placas de poços incubadas a 37 graus C sob uma atmosfera de 5 por cento de CO2 durante a noite. Em seguida, foram adicionados os extratos na concentração de 0,01 mg/mL. Após incubação por 24 horas, o RNA total foi extraído com o NucleoSpin RNA Plus (Macherey Nagel, Dueren, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade de RNA total foi quantificada por fluorímetro Qubit 2.0 (Invitrogen, Massachusetts, EUA). Os primers específicos para RT-PCR, incluindo Foxo1, Sirt1 e b-actina, foram adquiridos da Macrogen Oceania, Austrália. As sequências dos primers específicos foram seguidas; Foxo1: 5′ -GAC GCC GTG CTA CTC GTT-3′(Avanço) e 5′-CGG TTC ATA CCC GAG GTG-3′(Reverso); Sirt1: 5′ -TAG CCT TGT CAG ATA AGG AAG GA-3′(Avanço), 5′ -ACA GCT TCA CAG TCA ACT TTG T-3′ (Reverso); e b-actina: 5' TCA TGC AGT GTG ACG TTG ACA TCC GT-3' (Forward), 5' -CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TG -3' (Reverse). As misturas de PCR continham 1x SuperScriptTM III One-Step RT-PCR System com PlatinumTM Taq DNA Polymerase Supermix (Invitrogen, Massachusetts, EUA), 250 nM de primers específicos e 2 lg de RNA. Todas as reações de RT-PCR foram realizadas no TProfessional Basic Gradient 070–601 (Biometra GmbH, Göttingen, Alemanha) sob as condições de amplificação: 60 graus C 30 min para transcrição reversa; depois 40 ciclos a 94 graus por 15 s de desnaturação, 55 graus C por 30 s de anelamento e 68 graus por 30 s de extensão; e finalmente a 68 graus C por 5 min. Após os processos de RT-PCR, os produtos de PCR foram então separados em um gel de agarose a 1,5 por cento misturado com o Novel Juice 6x DNA Loading Buffer (GeneDireXTM, China), visualizados com um transiluminador e depois fotografados usando a Quantidade Um 4.6.8 (básico) (Bio-Rad Laboratories, Inc., Califórnia). Posteriormente, a densidade da banda foi quantificada usando Image J (Versão 1.47, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA) e foi normalizada para o gene housekeeping, b-actina.

2.6. Análise estatística

Todos os experimentos foram expressos como a média ± desvio padrão (DP) dos experimentos independentes (n {{0}}). As diferenças estatísticas foram analisadas pela ANOVA com o teste de Tukey (p < 0,05). As relações entre as bioatividades foram testadas pelo coeficiente de correlação de Pearson.

3. Resultados

3.1. Rendimento de extração, características físicas e teores fitoquímicos dos extratos de PR

Os rendimentos de extração, características físicas e conteúdo fitoquímico dos extratos de PR foram exibidos na Tabela 1. Os rendimentos de extração dos extratos de PR variaram de 10,62 por cento a 30,63 por cento. Os principais componentes fitoquímicos dos extratos de PR foram os flavonoides. Excepcionalmente, os extratos de sementes de rambutan rosa (PR-SM e PR-S-Sox) não continham flavonoides, mas apresentavam apenas glicosídeos como seus fitoquímicos. Somente os extratos PR das cascas maduras e jovens pela Maceração (M) apresentaram a presença de xantonas, que é um polifenol termolábil. Além disso, os rendimentos de extração dos extratos PR pela extração Soxhlet (Sox) pareceram ser maiores do que a Maceração (M).

3.2. Conteúdo fenólico total (TPC), flavonoide (TFC) e quercetina dos extratos PR

O PR extrato de cascas de frutas jovens pela Maceração (PRY-M) apresentou o maior teor de fenólicos totais pelo ensaio de FolinCiocalteu de 67,60 ± 4,38 mgGAE/g, enquanto o PR extrato de cascas de frutas jovens pela A extração de Soxhlet (PR-Y-Sox) forneceu o maior conteúdo total de flavonóides pelo ensaio colorimétrico de cloreto de alumínio modificado de 678,72 ± 23,59 mgQE/g (Fig. 1) (p < 0,05). No entanto, os extratos PR-BM, PR-SM e PR-S-Sox não apresentaram conteúdo fenólico. Foi revelado que todos os extratos de PR demonstraram os teores de quercetina determinados pela análise de HPLC. Além disso, o extrato PR de cascas de frutas maduras pela Maceração (PR-RM) apresentou o maior teor de quercetina de 190,10 ± 0,28 lg/mL. (Figura 2).

3.3. Atividades antioxidantes e de inibição da tirosinase de cogumelos dos extratos de PR

A Tabela 2 demonstrou as três atividades antioxidantes, incluindo a atividade sequestradora de radicais livres pelo método DPPH, a inibição da peroxidação lipídica pelo método do tiocianato férrico; a quelação de metais pelo método FIC; e a inibição da tirosinase de cogumelos dos extratos de PR. A maioria dos extratos de PR, exceto os extratos de PR-LM, PR-BM e PR-S-Sox, mostraram atividade superior de eliminação de radicais livres com o intervalo SC5{{10}} de 0.{ {18}}23 – {{20}}.045 mg/mL, que foi comparável ao ácido ʟ-ascórbico padrão (SC50 de 0. 036 ± 0.{{40}}03 mg/mL) em p < 0.05. Além disso, o extrato PR-LM apresentou a maior inibição da peroxidação lipídica com o LC50 de 0.274 ± 0.029 mg/mL, e a atividade de quelação de metais com o MC50 de 0,203 ± 0,021 mg/mL, comparável ao a-tocoferol padrão (LC50 de 0,122 ± 0,015 mg/mL) e EDTA (MC50 de 0,518 ± 0,034 mg/mL), respectivamente (p < 0,05). Todos os extratos PR demonstraram a atividade de inibição da tirosinase de cogumelo, enquanto o extrato PR-R-Sox apresentou a maior atividade com IC50 de 0,04 ± 0,02 mg/ml, comparável ao ácido kójico padrão (IC50 de 0,02 ± 0,01 mg /ml) (p < 0,05).

3.4. Citotoxicidade dos extratos de PR

Fig. 3 showed the cytotoxicity on the B16F10 cells (A) human skin fibroblasts by the MTT assay of the PR extracts. All of the PR  extracts at the concentrations of 0.01 and 0.1 mg/mL had no cytotoxicity on the B16F10 cells and human skin fibroblasts, respectively since they gave>80 por cento de viabilidade relativa em comparação com o grupo não tratado. Apesar disso, as maiores concentrações de todos os extratos de PR foram consideradas citotóxicas nessas células. A concentração superior a 1 mg/ml não foi testada, uma vez que não se dissolveu completamente no solvente.

3.5. Antimelanogênese dos extratos de PR

In this study, there is a screening method from many samples,  therefore we highlight only the highest concentration that had no cytotoxicity on both cells and might have the highest anti-melanogenesis activity. This concentration is the highest concentration that showed no cytotoxicity on the B16F10 cells after being treated with the PR extracts and kojic acid (>80 por cento de viabilidade celular) (dados não mostrados). A Fig. 4 exibiu a antimelanogênese nas células de melanomas murinos (B16F10) dos extratos de PR na concentração de 0,01 mg/ml. Todos os extratos de PR exibiram antimelanogênese em células B16F10. O PR extrai de folhas, galhos, sementes e frutos maduros e jovens pela extração Soxhlet (PR-L-Sox, PR-B-Sox, PR-S-Sox, PR-R-Sox e PR-Y-Sox ) mostrou a maior anti-melanogênese de 50,6–54,1 por cento, que foi dramaticamente superior ao ácido kójico padrão (37,9 ± 3,9 por cento) em cerca de 1,5 vezes, enquanto a atividade dos extratos de RB-M e PR-YM foi comparável à do ácido kójico padrão (p < 0,05).

3.6. Estimulação da biossíntese de colágeno dos extratos de PR

Todos os extratos de PR na concentração de {{0}},1 mg/ml mostraram a estimulação da biossíntese de colágeno nos fibroblastos da pele humana determinada pelo método Sirius Red. A concentração de 0,1 mg/ml dos extratos de PR e ácido ʟ-ascórbico é a maior concentração que não apresentou citotoxicidade nos fibroblastos da pele humana. Os extratos PR de folhas e galhos pela extração Soxhlet (os extratos PR-LM e PR-BM) demonstraram a maior biossíntese de colágeno (16,46 ± 0.{{2{23}}}}7 por cento e 14,66 ± 0,09 por cento , respectivamente), que foi inferior ao ácido ʟ-ascórbico padrão (34,07 ± 0,03 por cento ) em cerca de 2 vezes (p < 0,05) (Fig. 5).

3.7. Estimulação de genes antienvelhecimento

A Fig. 6 mostrou a estimulação de genes antienvelhecimento, incluindo os genes Sirt1 e Foxo1 nos fibroblastos da pele humana dos extratos de PR em 0.01 mg/ml foi determinado pela técnica de RT-PCR. A concentração de {{2{26}}}}.01 mg/ml dos extratos de PR e resveratrol é a maior concentração que não apresentou citotoxicidade nos fibroblastos da pele humana. Curiosamente, os extratos PR-L-Sox, PR-S-Sox, PRR-M, PR-R-Sox, PR-YM e PR-Y-Sox a 0,01 mg/ml exibiram a maior estimulação de Foxo1 antienvelhecimento expressão de mRNA (495 pb), que foi dramaticamente superior ao resveratrol padrão em cerca de 2 vezes (p < 0,05). Por outro lado, os extratos PR-S-Sox e PR-Y-Sox exibiram a maior estimulação da expressão do mRNA antienvelhecimento Sirt1 (160 pb), que foi menor que a do resveratrol (p < 0,05). Embora quase todos os extratos de PR tenham demonstrado a estimulação da expressão de genes antienvelhecimento, os extratos de PR-R-Sox e PR-BM não estimularam a expressão de Sirt1 e Foxo1, respectivamente.

4. Discussão

Várias plantas naturais têm sido geralmente avaliadas por seus fitoquímicos, compostos bioativos e propriedades biológicas para encontrar novos ingredientes naturais promissores para medicamentos, suplementos alimentares e aplicações cosméticas. Rambutan rosa é uma das frutas locais no distrito de Klung, província de Chanthaburi, Tailândia. Existem alguns relatos científicos sobre suas atividades biológicas e farmacêuticas, especialmente sua atividade antienvelhecimento. Neste estudo, as cinco partes do rambutan rosa, incluindo folhas, galhos, sementes e cascas de frutas maduras e jovens, foram extraídas pela Maceração e extração Soxhlet usando 95 por cento de etanol como solvente. Vários fitoquímicos recém-descobertos, incluindo a quercetina, que são metabólitos secundários de plantas, foram estudados quanto aos efeitos antienvelhecimento em células, animais e humanos (Phuong et al., 2020). A partir dos achados deste estudo, os flavonoides foram os principais fitoquímicos dos extratos de PR. Foi relatado anteriormente que os extratos de outras espécies de rambutan foram apresentados com fitoquímicos, incluindo flavonóides, taninos e carotenóides, que se correlacionam com suas propriedades antioxidantes (Rohman, 2017). A ausência de xantonas pela extração de Soxhlet pode ser devido a altas temperaturas (Yuvanatemiya et al. 2022, Sankeshwari et al., 2018). A quercetina é um dos compostos fenólicos e flavonóides mais abundantes encontrados em muitas frutas e vegetais, bem como no rambutan (Phuong et al., 2020). Neste estudo, a temperatura mais alta (80 graus C) do processo Soxhlet pode extrair uma substância não lábil ao calor, incluindo a quercetina, mais do que o processo a frio. A quantidade de quercetina determinada pela análise de HPLC pode ser usada como marcador para controle de qualidade dos extratos de PR em escala de produção. O coeficiente de correlação de Pearson (R2 ) entre o TFC e o TPC dos extratos de PR foi de 0,825 classificando uma relação muito forte (R2=± 0,80 a ± 1.00) (p < 0,01) o que significa se o TFC for aumentado, o TPC também aumentará dramaticamente. Além disso, o coeficiente R2 entre o TPC e o teor de quercetina dos extratos de PR foi de 0,650, classificando uma forte relação (R2=± 0,60 a ± 0,79) (p < 0,05). A diferença nos rendimentos de extração, fitoquímicos, bem como TPC, TFC e quercetina dos extratos de PR podem ser afetados pelos solventes, processos de extração e temperaturas (Chutoprapat et al., 2020). Vários estudos descobriram que os compostos flavonoides e fenólicos, bem como a quercetina, têm uma ampla gama de atividades biológicas e farmacêuticas, incluindo atividade antimicrobiana, antioxidante, antiinflamatória e antienvelhecimento (Panche et al., 2016, Shahidi e Yeo, 2018, Musika et al., 2021, Wang et al., 2022).

Como afirmado anteriormente, as espécies radicais de oxigênio, ou ROS, podem causar danos relacionados à idade nos níveis celular e tecidual, acelerando o envelhecimento cronológico e ambiental caracterizado por rugas e pigmentação atípica (Papaccio et al., 2022). Os antioxidantes naturais podem eliminar os radicais livres, o que resulta na redução dos efeitos anti-inflamatórios, na prevenção do câncer, diabetes e distúrbios cerebrais, na redução da pressão arterial e da aterosclerose e na desaceleração do envelhecimento da pele (Miracle Uwa, 2{{20} }17). A eliminação de radicais livres, a inibição da peroxidação lipídica e a quelação de metais têm sido amplamente investigadas como sistemas para investigar a atividade antioxidante de produtos naturais. Para a eliminação de radicais livres DPPH, os elétrons ímpares nas moléculas DPPH são reduzidos ao receber um átomo de hidrogênio de antioxidantes para se tornarem moléculas de hidrazina (Ionita, 2021). O método de peroxidação lipídica é baseado na oxidação de íons de cobre (II) a cobre (III) passados ​​por uma emulsão de ácido linoléico (Bakir et al., 2017), enquanto o método de quelação de metais é baseado na oxidação de cobre (II) para formar um complexo férrico-ferrozina (Wong et al., 2014). A presença de conteúdo flavonoide e fenólico nos extratos PR deste estudo pode ter contribuído para as três atividades antioxidantes. Verificou-se que os compostos fenólicos (por exemplo, corilagina, ácido elágico, geraniina e quercetina) dos extratos de rambutan exibem atividade antioxidante pela eliminação do radical DPPH e inibição da peroxidação lipídica (Hernández-Hernández et al., 2019, Phuong et al., 2019, Monrroy et al., 2020, Araujo et al., 2021). Isso é semelhante aos relatórios anteriores de que os extratos de casca de outras espécies de rambutan exibem alto TPC e TFC, além de mostrar atividades antioxidantes mais fortes, como ABTS, DPPH, eliminação de O2-, poder de ensaio de redução férrica (FRAP ), agentes quelantes e peroxidação lipídica (Lurith et al., 2017, Rohman, 2017, Monrroy et al., 2020). Curiosamente, o coeficiente R2 entre a quelação de metais e a inibição da peroxidação lipídica dos extratos de PR mostrou uma correlação positiva muito forte de 0,953, classificando uma forte relação em um nível significativo de p < 0,01.

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