Projeto in silico de uma nova vacina peptídica polivalente com múltiplas subunidades que potencializa a imunidade cruzada contra a leishmaniose visceral e cutânea humana: uma abordagem baseada em imunoinformática

Abstrato

Contexto A leishmaniose é um grupo de doenças infecciosas transmitidas por vetores, causadas por mais de 20 espécies patogênicas de Leishmania, endêmicas em muitos países tropicais e subtropicais. O surgimento de cepas resistentes aos medicamentos, os efeitos colaterais adversos dos medicamentos anti-Leishmania e a ausência de uma estratégia de vacinação preventiva ameaçam a população sensível. Recentemente, muitos grupos de investigadores exploraram o campo da vacinologia reversa para desenvolver vacinas, concentrando-se principalmente na indução de imunidade contra a leishmaniose visceral ou cutânea.

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MétodosEste presente trabalho envolve a recuperação de doze sequências de proteínas antigênicas de leishmania validadas experimentalmente do banco de dados UniProt, seguidas de seu perfil de antigenicidade empregando servidores ANTIGENpro e Vaxijen 2.0. Os epítopos de ligação ao MHC para o mesmo foram previstos usando servidores NetCTL 1.2 e SYFPEITHI, enquanto os epítopos para células B foram calculados usando servidores ABCpred e BepiPred 2.0. Os epítopos selecionados com pontuações significativamente mais altas foram utilizados para projetar a construção da vacina com ligantes apropriados e adjuvantes naturais. As estruturas secundárias e terciárias do peptídeo sintético foram determinadas por campos aleatórios condicionais, redes neurais superficiais e alinhamento de perfil de perfil com simulações de montagem de estrutura iterativa, respectivamente. O modelo de vacina 3-D foi validado por meio do refinamento10-testado pelo CASP e do servidor da web MolProbity. Ancoragem molecular e simulação de análise em modo normal em múltiplas escalas foram realizadas para analisar o melhor complexo vacina-TLR. Finalmente, os resultados da simulação imunológica computacional revelaram respostas imunes celulares e humorais promissoras, sugerindo que o peptídeo quimérico projetado é uma potencial vacina de amplo espectro contra a leishmaniose visceral e cutânea.

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Palavras-chave Leishmaniose · Vacinologia reversa · TLR · Vacina multiepítopo · Simulação de dinâmica molecular · Modelagem de homologia

Introdução

A leishmaniose é um grupo de doenças parasitárias causadas por vários membros do gênero Leishmania, um protozoário parasita intracelular dimórfico [1]. A leishmaniose afeta a maioria das populações de baixo status socioeconômico de países tropicais e subtropicais em todo o mundo [2]. É uma doença transmitida por vetores e os parasitas são transmitidos pela picada de flebotomíneos fêmeas infectadas (OMS, 2019). De acordo com os últimos relatórios da Organização Mundial da Saúde, 700, 000 a 1 milhão de novos casos e cerca de 26,000 a 65, 000 mortes ocorrem anualmente (OMS, 2019). Na África Oriental, ocorrem frequentemente surtos de leishmaniose visceral. A região do Mediterrâneo Oriental é responsável por 70% dos casos de leishmaniose cutânea em todo o mundo (OMS, 2019). Em 2017, 20.792 dos 22.145 (94%) novos casos notificados à OMS ocorreram em sete países: Brasil, Etiópia, Índia, Quénia, Somália, Sudão do Sul e Sudão (OMS, 2017). Devido ao cenário alarmante, medidas de controle e erradicação da doença também merecem destaque em nosso país. A leishmaniose tem uma variedade de manifestações clínicas e existem três formas primárias da doença: visceral (também conhecida como calazar e a forma mais grave da doença), cutânea (a mais comum) e mucocutânea (OMS, 2019) . A evidência de autocura em alguns casos de leishmaniose cutânea (LC) e a imunidade resultante à reinfecção infere o possível escopo da vacinação como um método viável para controlar a leishmaniose durante o período [3]. No entanto, até à data, não existe nenhuma vacina licenciada disponível contra a leishmaniose humana. Embora algumas potenciais vacinas candidatas tenham avançado para ensaios clínicos, muitas ainda estão na fase inicial de investigação e desenvolvimento [4]. A geração de vacinas peptídicas é uma área de pesquisa predominante e promissora neste campo. Em contraste com parasitas inteiros vivos ou atenuados ou com suas vacinas baseadas em subunidades, os peptídeos sintéticos têm várias vantagens que incluem a ausência de materiais potencialmente prejudiciais, menor complexidade do antígeno, boa estabilidade e baixo custo para aumento de escala [1, 5]. O desenvolvimento de novas vacinas exige conhecimentos mais profundos sobre imunologia, biologia molecular e engenharia química. Portanto, cientistas de todas essas áreas trabalham lado a lado para projetar e produzir vacinas seguras e eficazes [6]. Uma vacina ideal contra a leishmaniose deve provocar imunidade duradoura e uma resposta imunológica equilibrada mediada por TH-1 e TH-2-[4, 7]. A abordagem baseada em imunoinformática para projetar uma nova vacina candidata é uma estratégia mais recente que emprega principalmente ferramentas computacionais para prever uma vacina peptídica de múltiplas subunidades estruturalmente estável e imunogênica dentro de um curto espaço de tempo. As proteínas que foram encontradas principalmente como tendo características imunogênicas necessárias para conferir imunidade contra a doença em estudos imunológicos anteriores envolvendo modelos experimentais de animais ou outras análises in silico foram os melhores candidatos possíveis ao epítopo [1, 8–10]. Entre as proteínas sob investigação, a proteína LACK (antígeno C-quinase ativado por Leishmania) é uma proteína altamente conservada em todas as espécies de Leishmania e é considerada uma vacina candidata viável contra a leishmaniose humana [11]. Foi comprovado que é um alvo chave da resposta imune em camundongos BAL b/c sensíveis [12]. KMP-11 (proteína de membrana cinetoplastídica-11) está presente em todos os protozoários cinetoplastídeos e também é considerada uma potencial candidata a vacina que demonstrou aumentar os níveis de IL-10 em modelos murinos, indicando seu potencial imunogênico [13]. A leishmanolisina, ou GP63, é uma proteinase de superfície que foi postulada como um fator de virulência envolvido na interação direta do parasita com o receptor macrófago hospedeiro [14]. As proteínas de membrana LCR1 e GP46 também aumentam a produção de IFN-gama e, portanto, são consideradas úteis no desenvolvimento de uma vacina geral contra infecções por Leishmania [5, 15]. As proteínas de choque térmico (HSPs) são moléculas altamente conservadas que são altamente imunogênicas para induzir as vias MHC-I e MHCII de imunidade adaptativa e acredita-se que tenham um papel pertinente no desenvolvimento de vacinas contra a leishmaniose infecciosa [16]. A proteína B de superfície acilada hidrofílica de Leishmania (HASP-B) é expressa apenas em parasitas infecciosos, sugerindo um papel na virulência do parasita e, portanto, um potencial candidato a vacina [17]. As proteínas do bastão parafagelar cinetoplastídeo (PFR) também são de importância terapêutica e profilática devido à sua distribuição evolutiva restrita, organização de alta ordem e alta imunogenicidade (18). Da mesma forma, as cisteína proteases e os proteofosfoglicanos também atuam como fatores de virulência essenciais para os parasitas em hospedeiros mamíferos e são alvos atraentes de medicamentos para a leishmaniose [19–21]. Além disso, a proteína beta-tubulina também já havia sido caracterizada como um antígeno estimulador de células T de Leishmania, embora sua eficácia como candidata a vacina ainda não tenha sido testada [22]. A beta-tubulina de L. donovani também é considerada um potencial alvo de medicamento contra a leishmaniose visceral [23]. Por último, foi demonstrado que o fator de tradução da proteína eIF5A de L. braziliensis induz proteção heteróloga contra leishmaniose em animais quando administrado como vacina em combinação com outra proteína recombinante. Aumenta a secreção de citocinas específicas do parasita em animais vacinados. A proteína eIF5A também é conservada em todos os eucariotos [24]. Anteriormente, Khatoon et al. descreveram uma abordagem baseada em imunoinformática para projetar uma vacina peptídica de múltiplas subunidades contra a leishmaniose visceral (LV), explorando as proteínas secretoras de L. donovani [6]. Aqui, selecionamos vários antígenos de leishmania em várias espécies infecciosas do parasita. Ao mesmo tempo, todas estas proteínas já foram identificadas (seja por estudos in vitro em animais ou pela utilização de ferramentas computacionais) para instigar uma resposta imunitária, provocando imunidade protetora. As sequências proteicas selecionadas pertenciam a qualquer uma das cinco espécies patogênicas de Leishmania, a saber, Leishmania major, Leishmania Mexicana, Leishmania donovani, Leishmania chagasi e Leishmania amazons, entre as quais L. donovani é o principal parasita causador da leishmaniose visceral (LV), enquanto os demais são os principais responsáveis ​​por causar a leishmaniose cutânea (LC) ou mucocutânea (LCM). A lógica por trás da escolha de tipos tão diversos de proteínas conservadas e imunogênicas em diferentes espécies de Leishmania foi projetar uma vacina peptídica geral que conferisse imunidade cruzada de amplo espectro contra ambas as formas de leishmaniose (VL e CL) que comumente afetam humanos. .

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Materiais e métodos

Seleção e recuperação de sequências proteicas antigênicas de Leishmania

As sequências completas de aminoácidos de doze proteínas antigênicas específicas de Leishmania foram recuperadas do banco de dados Uniprot (Universal Protein Resource) (https://www.unipr ot.org/uniprot/) no formato FASTA (acessado em 21.{{16} }3.2022). Como afirmado anteriormente, todas essas proteínas foram relatadas como imunogênicas, altamente conservadas e potenciais candidatas a vacinas, conforme encontrado em estudos imunológicos anteriores envolvendo modelos animais ou métodos computacionais de predição in silico. A antigenicidade das proteínas selecionadas foi calculada empregando o servidor ANTIGENpro (// scratch.proteomics.ics.uci.edu/) que calcula a antigenicidade de uma sequência de proteína de entrada explorando um classificador de dois estágios baseado em SVM validado por dez vezes abordagem de validação cruzada [25]. As proteínas foram então submetidas à análise de peptídeos de sinal usando o servidor SignalP 4.1 (SignalP — 4.1 — Services — DTU Health Tech) para discriminar entre proteínas clássicas secretoras e não secretoras (transmembrana). Este método incorpora uma previsão de locais de clivagem e uma previsão de peptídeo sinal / peptídeo não sinal com base em uma combinação de várias redes neurais artificiais [26]. As previsões de localização para todas as proteínas foram realizadas em seguida usando DeepLoc (DeepLoc — 1.0 — Services — DTU Health Tech), um algoritmo sem modelo que usa redes neurais profundas para prever a localização subcelular de proteínas explorando apenas informações de sequência, alcançando boa precisão [27]. Todas as sequências proteicas funcionais, obtidas do servidor SignalP 4.1, foram em seguida submetidas para prever a presença de determinantes antigênicos (epítopos) que serão reconhecidos pelos receptores de células B e T. Isto foi feito para garantir que a construção da vacina concebida contém apenas epítopos de células T e células B imunodominantes e, assim, seria capaz de conduzir uma resposta imunitária eficiente envolvendo vias de mecanismos imunitários tanto humorais como mediadas por células.

Predição de epítopos de linfócitos T citotóxicos (CTL)

A previsão do epítopo do linfócito T citotóxico (CTL) é um aspecto essencial da concepção de um peptídeo ideal [28]. Um servidor web de acesso gratuito, nomeadamente NetCTL1.2 (//www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL), foi utilizado para prever os epítopos CTL para todas as proteínas selecionadas. O método integra a previsão da ligação do peptídeo MHC classe I, clivagem do terminal C proteasomal e eficiência de transporte TAP [29], todas características essenciais que uma sequência de epítopo de ligação a CTL deve possuir. O servidor permite previsões de epítopos de CTL restritos a 12 supertipos de MHC classe I, entre os quais apenas o supertipo A1 foi utilizado para o presente estudo. A ligação do MHC classe I e a clivagem proteasomal são realizadas usando redes neurais artificiais. A eficiência do transporte TAP é prevista usando uma matriz de peso [29]. As sequências com pontuações de ligação mais elevadas são consideradas epítopos de CTL potentes. Além do NetCTL 1.2, outra abordagem baseada em servidor web disponível publicamente, a saber, SYFPEITHI (//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm), também foi utilizada para a previsão de epítopos CTL de todas as proteínas de Leishmania selecionadas. A previsão é baseada em motivos publicados e considera os aminoácidos nas posições âncora e âncora auxiliar e outros aminoácidos frequentes [30]. Da lista de tipos de MHC fornecidos neste servidor, HLA-A*01, HLA-A*02:01 e HLA-A*03 foram escolhidos para a predição. A pesquisa de epítopos foi especificada para sequências não-nomeadas para comparação uniforme com os resultados fornecidos pelo servidor NetCTL 1.2. Apenas os epítopos comuns de cada proteína (se houver), que foram previstos pelos servidores NetCTL 1.2 e SYFPEITHI com pontuações mais altas compatíveis, foram selecionados para a construção final da vacina.

Predição de epítopos de linfócitos T auxiliares (HTL)

Os linfócitos T auxiliares são as células imunológicas mais importantes, pois são necessários em todos os tipos de respostas imunes adaptativas. A previsão de epítopos HTL (principalmente do tipo Th-1), portanto, torna-se um elemento essencial para a concepção de uma vacina peptídica eficaz. No presente estudo, a ferramenta de análise de ligação MHC-II no servidor IEDB (Immuno Epitope Datan base and Analysis) (//tools.iedb.org/mhcii/) foi empregada para a predição de 15-mer HTL epítopos para um conjunto de três alelos humanos, nomeadamente, HLA-DRB1*01:01, HLADRB1*01:02 e HLA-DRB1*01:03. Alelos HLA humanos foram escolhidos para uma estimativa mais realista da afinidade de ligação dos epítopos ao MHC-II enquanto a vacina estava sendo desenvolvida contra a leishmaniose humana. A saída prevista é dada em unidades de IC50nM para a biblioteca combinatória e alinhamento SMM. Portanto, um número menor indica maior afinidade. O método de predição recomendado pela IEDB foi utilizado nesta abordagem, em que a classificação baixa ajustada é indicativa de ligantes de MHC-II adequados e, portanto, pode ser definida como potentes epítopos de HTL.

Identificação e seleção de epítopos de HT indutores de citocinas

As citocinas são de imensa importância para o bom funcionamento do sistema imunológico. Uma bateria de citocinas como IL-2, IL-4, IL-6 e interferon- pode induzir respostas imunes humorais e mediadas por CTL [31]. Assim, os epítopos HTL que podem desencadear a produção de citocinas são preferíveis para a concepção de uma vacina imunoprofilática. Com esta visão, o servidor IFNepitope (//crdd.osdd.net/raghava/ifnepitope/) foi utilizado para a identificação de epítopos HTL com habilidades indutoras de citocinas. IFNepitope é um servidor de predição on-line que visa prever os peptídeos de sequências de proteínas que podem induzir a liberação de IFN-gama de células T CD4+. O servidor web foi desenvolvido com base em um conjunto de dados que compreende ligantes MHC classe II indutores e não indutores de IFN-gama [32]. Os epítopos HTL previstos pelo servidor IEDB com maiores afinidades de ligação ao MHC-II (classificações ajustadas mais baixas) foram fornecidos como entrada para verificar a sua capacidade de produção de citocinas pelo servidor IFNepitope. Os epítopos assim identificados foram então submetidos ao próximo nível de análise pelo servidor IL4pred (IFNepitope(iiitd.edu.in) e também pelo servidor IL10Pred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3 .php) para garantir que os epítopos HTL selecionados também evocariam a secreção de IL-4 e IL-10, respectivamente. Eles também consideram a conservação posicional dos resíduos de aminoácidos e a composição de aminoácidos do peptídeos para uma previsão mais precisa [33, 34]. Os epítopos HTL de ligação ao MHC-II previstos como positivos por todos os três servidores foram selecionados para incorporação na construção final da vacina. Esta estratégia foi adotada para melhorar a eficácia da vacina, uma vez que poderia instigar uma resposta intensa envolvendo uma ampla variedade de citocinas (IFN-gama, IL-4 e IL-10), levando a uma imunidade acelerada e duradoura.

Análise de conservação de epítopos

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100% (padrão).

Projeto de sequência de vacina multiepítopo

Com base na análise imunoinformática, construiu-se uma sequência primária da vacina de subunidade incorporando as sequências de epítopos CTL e HTL selecionadas. Esses epítopos foram ligados entre si pelos ligantes AAY e GGPPG, respectivamente [28, 31]. Os ligantes são inseridos para a separação adequada dos epítopos individuais que são necessários para o funcionamento eficiente da construção da vacina [28, 36]. Em segundo lugar, a adição de um adjuvante apropriado é crucial numa vacina de subunidade para aumentar a resposta imunitária [31]. A escolha de um adjuvante adequado é fundamental na concepção de vacinas para testes em humanos. A IL-12 produzida por várias células do sistema imunológico é essencial no desenvolvimento da imunidade mediada por células contra a leishmaniose, e o potencial da IL-12 como adjuvante em vacinas contra a leishmaniose foi relatado em modelos murinos [3, 37, 38]. Esta IL-12 foi selecionada como adjuvante para o desenho da vacina, e a sequência da mesma foi incluída no terminal N da construção da vacina usando o ligante EAAK [28, 31]. A sequência da cadeia alfa de IL -12 humana foi recuperada do banco de dados Uniprot (www.uniprot.org; número de acesso P29459). Finalmente, a construção de vacina peptídica foi obtida tendo adjuvante, ligante, epítopos CTL e epítopos HTL (com ligantes intra-epitópicos AAY e GGPPG) em uma sequência que se move do terminal N para o terminal C.

Predição de epítopos de células B conformacionais e lineares

A imunidade humoral envolve a síntese e secreção de anticorpos específicos pelas células B ativadas, o que requer a presença de determinantes antigênicos que são reconhecidos pelos receptores de células B presentes na superfície dos linfócitos B. Uma vacina peptídica imunoprotetora ideal deve ter tais componentes para interagir e, assim, estimular as células B. Portanto, dois servidores, a saber, ABCpred e BepiPred 2.0, foram aplicados para a previsão precisa de epítopos de células B na sequência primária da vacina projetada. O servidor ABCpred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html) é uma abordagem baseada em rede neural artificial (ANN) que prevê epítopos de células B em uma determinada sequência de antígeno usando parâmetros de comprimento fixo. O conjunto de dados de treinamento usado neste método contém epítopos de células B do banco de dados de epítopos de células B (BCIPEP). O servidor é capaz de prever epítopos com 65,93% de precisão usando uma rede neural recorrente [39]. A sequência primária da construção final da vacina foi fornecida como entrada em um formato simples, e os parâmetros padrão do servidor ABCpred, incluindo um valor limite de 0.51 com um comprimento de janela de 16 resíduos de aminoácidos, foram usados ​​para a previsão. O servidor BepiPred 2.0 (BepiPred—2.0—Services—DTU Health Tech), por outro lado, prevê epítopos sequenciais de células B a partir de uma sequência de entrada por um algoritmo de floresta aleatório treinado em epítopos e aminoácidos não epítopos determinados a partir de estruturas cristalinas seguidas por uma suavização de predição sequencial [40]. A sequência primária da vacina foi fornecida em formato FASTA como entrada. A aplicação de dois servidores diferentes que prevêem epítopos de células B com base em dois algoritmos diferentes torna a previsão mais realista. A maioria dos determinantes antigênicos reconhecidos pelo receptor de células B e pelos anticorpos são descontínuos, o que significa que contêm resíduos de aminoácidos localizados distantemente na estrutura primária do imunógeno, mas são colocados adjacentes uns aos outros durante o dobramento da proteína [41]. A previsão de tais epítopos descontínuos de células B na estrutura terciária validada da vacina foi realizada utilizando o servidor ElliPro (//tools.iedb.org/ellip ro/) incorporado no portal IEDB. ElliPro é uma ferramenta web de acesso gratuito que implementa o método de Thronton modificado e leva em consideração o centro de massa de cada resíduo em vez dos átomos de C. Fazer isso relaciona cada um dos epítopos a uma pontuação atribuída definida como PI (índice de protrusão) calculada em média sobre os resíduos de epítopos. Os epítopos descontínuos são determinados com base nos seus respectivos valores de PI e agrupados com base na distância entre os centros de massa do resíduo (R). Valores maiores de R correlacionam-se com a previsão de epítopos descontínuos mais significativos (42). Ao mesmo tempo, epítopos lineares de células B no modelo de proteína de entrada também podem ser previstos e visualizados usando ElliPro. A detecção de epítopos de células B lineares e descontínuos no modelo 3D refinado da vacina garante uma estratégia bem-sucedida de projeto de vacina.

Perfil de antigenicidade, alergenicidade e toxicidade da construção da vacina

A antigenicidade é um critério essencial para uma vacina imunoprofilática. Para garantir que a construção da vacina projetada provocaria uma resposta imune duradoura ao interagir com os receptores de células B e T, a antigenicidade da mesma foi avaliada usando servidores ANTIGENpro e VaxiJen 2.0. O servidor ANTIGENpro (//scratch.proteomics.ics.uci. edu/) classifica corretamente 82% dos antígenos protetores conhecidos quando treinados usando apenas os conjuntos de dados de microarranjos de proteínas. A precisão do conjunto de dados combinado é estimada em 76% por experimentos de validação cruzada dez vezes maiores que permitem um reconhecimento significativamente melhor de peptídeos antigênicos. Ele é executado em uma arquitetura de dois estágios, incluindo um classificador de segundo estágio baseado em SVM. Para uma nova sequência de proteína de entrada, a probabilidade calculada pelo preditor SVM de segundo estágio é a pontuação final de predição do ANTIGENpro [25]. VaxiJen2.0 (http://www. dog-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) é outro servidor web acessível ao público que avalia a antigenicidade de uma sequência de proteína por uma abordagem livre de alinhamento que é baseada na transformação de autocovariância cruzada (ACC) de sequências de proteínas em vetores uniformes de propriedades principais de aminoácidos e permite a classificação de antígenos apenas com base em várias propriedades físico-químicas da proteína, sem se referir ao alinhamento de sequências (43). Em segundo lugar, para descartar qualquer possibilidade de a construção da vacina desencadear uma resposta alérgica num indivíduo, o servidor AlgPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) foi utilizado para determinar sua alergenicidade. A ferramenta de servidor fornece uma variedade de abordagens, incluindo mapeamento de epítopos de IgE, motivo MEME/MAST, método SVM baseado na composição de dipeptídeos e BLAST ARPs, todos explorados para uma previsão precisa. O limite foi definido em 0.4 (padrão) para maior precisão de previsão. Além disso, AllerTop v.2.{{20}} (https://www. dog-pharmfac.net/AllerTOP/index.html), uma ferramenta baseada em servidor web de acesso gratuito, também foi aplicada para confirmar a natureza não alérgica da construção da vacina. Este método é baseado na transformação de autocovariância (ACC) de sequências de proteínas em vetores uniformes de comprimento igual. Ele foi aplicado em estudos quantitativos de relações estrutura-atividade (QSAR) de peptídeos com diferentes comprimentos, e as proteínas são classificadas pelo algoritmo k-vizinho mais próximo [44]. A toxicidade, se houver, foi prevista utilizando o servidor ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/prote in.php). Esta ferramenta de previsão funciona com base na técnica de aprendizado de máquina e no método quantitativo que é treinado em um conjunto de dados de vários peptídeos tóxicos e não tóxicos obtidos de SwissProt e TrEMBL [45]. O perfil de toxicidade é crucial para avaliar a segurança da vacina e de outros peptídeos imunoterapêuticos destinados a testes em humanos. A análise foi realizada escolhendo a abordagem baseada em motivo SVM (TrEMBL) + com um limite de valor E de 10,0 para o método baseado em motivo e um limite de SVM de 0,1.

Avaliação de propriedades físico-químicas

Descrever as características físicas e químicas de um peptídeo quimérico torna-se vital uma vez que, quando administrado como vacina, deve ser capaz de induzir uma resposta imune adequada. O servidor ProtParam disponível no portal ExPASY (Expert Protein Analysis System) (https://web.expasy.org/program/) foi usado para calcular vários parâmetros físico-químicos da construção da vacina primária que incluíam características como peso molecular, pI teórico, índice de instabilidade, índice alifático, meia-vida in vivo e in vitro, grande média de hidrofobicidade (GRAVY), entre outros.

Previsão da estrutura secundária do peptídeo da vacina

Os elementos estruturais secundários da construção da vacina projetada foram previstos aplicando o servidor PSIPRED (//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) e o servidor de propriedade RaptorX (//raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/ prever/), ambos servidores de análise de estrutura de proteínas on-line de acesso gratuito. A sequência primária do peptídeo da vacina foi fornecida como entrada. PSIPRED prevê a estrutura secundária da sequência da proteína de entrada explorando duas redes neurais feed-forward que funcionam com base em matrizes de pontuação específicas de posição (PSSM) geradas pelo PSI-BLAST [46]. Incorpora a identificação de sequências homólogas à nossa construção de vacina por PSI-BLAST, seguida pela geração de PSSM. Verificou-se que o PSIPRED 3.2 e versões superiores alcançaram uma pontuação média no terceiro trimestre de 81,6%, conforme avaliado por um rigoroso método de validação cruzada tripla, o que torna esta abordagem significativamente precisa e precisa. O servidor web de propriedades RaptorX utiliza uma técnica de aprendizado de máquina muito recente chamada DeepCNF (campos neurais convolucionais profundos) para prever vários recursos como estrutura secundária, acessibilidade a solventes e regiões desordenadas simultaneamente. DeepCNF é uma abordagem integrada que combina campos aleatórios condicionais (CRFs) e redes neurais superficiais que modela relacionamentos sequência-estrutura complexos por uma arquitetura hierárquica profunda e pode obter aproximadamente 84% de precisão do terceiro trimestre para uma estrutura secundária de classe 3- [47] .

Previsão da estrutura terciária

A estrutura terciária do peptídeo final da vacina foi prevista usando o servidor web online I-TASSER (//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/). I-TASSER é uma abordagem hierárquica de modelagem de estrutura de proteína baseada no alinhamento de threading de perfil (PPA) e simulações iterativas de montagem de estrutura seguidas de refinamento de estrutura em nível atômico. Funciona em três etapas: identificação do modelo estrutural, montagem iterativa da estrutura e anotação da função baseada na estrutura. Os modelos de estrutura mais bem classificados com estimativas de precisão global e local são retornados com suas pontuações C e pontuações TM representativas, que são correlacionadas com a qualidade do modelo previsto. O programa I-TASSER representa um dos métodos mais bem sucedidos demonstrados no CASP para previsões automatizadas de estrutura e função de proteínas [48, 49].

Refinamento da estrutura terciária da vacina

A modelagem computacional convencional de uma estrutura proteica por si só não garante a autenticidade e precisão do modelo previsto, uma vez que tais estratégias de modelagem dependem em grande parte do grau de probabilidade da entrada (alvo) com as estruturas modelo disponíveis. O aprimoramento da qualidade do modelo baseado em modelo além da precisão foi, portanto, considerado necessário, e isso poderia ser alcançado refinando toda a estrutura da proteína. Com esta perspectiva, a saída do modelo tridimensional do servidor I-TASSER com melhor pontuação C foi submetida a refinamento adicional pelo servidor GalaxyRefne (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type{ {4}} REFINAR). É uma abordagem de refinamento testada10-pelo CASP, na qual as cadeias laterais das proteínas são reconstruídas primeiro e, em seguida, o reempacotamento da cadeia lateral e o relaxamento geral da estrutura são realizados por simulação de dinâmica molecular. Isso leva à melhoria precisa das estruturas terciárias locais e globais das proteínas alvo (50).

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Validação da estrutura terciária da vacina

A estrutura terciária refinada da vacina precisava ser validada para detectar possíveis erros que pudessem ocorrer no modelo 3D previsto. O modelo refinado obtido do servidor GalaxyRefne foi fornecido como estrutura de entrada em formato.pdb. Além disso, o gráfico de Ramachandran é outra abordagem muito útil para visualizar regiões energeticamente permitidas e não permitidas de ângulos diédricos phi (ϕ) e psi (ψ) das cadeias laterais de aminoácidos que são consideradas componentes cruciais para validação de uma estrutura proteica. Portanto, o servidor MolProbity [página principal - MolProbity (duke.edu)] foi empregado para gerar um gráfico Ramachandran para o modelo fornecido da vacina com base na validação Phenix do estilo MolProbity baseada em Python [51]. Usamos ainda o servidor ERRAT [SAVESv6.0—Structure Validation Server (UCLA. edu)] que analisa as estatísticas de interações não ligadas entre diferentes átomos no modelo e traça o valor da função de erro versus um {{ 6}}deslizamento de resíduos [52]. O servidor web ProSA (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php), uma plataforma interativa baseada na web baseada no programa ProSA padrão, foi usado para esse fim [53]. Esta etapa foi realizada para obter uma validação mais sofisticada e precisa da estrutura modelada.

Engenharia dissulfeto do peptídeo da vacina

As ligações dissulfeto contribuem para a estabilidade da proteína, diminuindo a entropia conformacional e também aumentando a energia livre do estado desnaturado. A introdução de novas ligações dissulfeto tem sido considerada uma ferramenta biotecnológica crítica para melhorar a termoestabilidade de proteínas dobradas nativas. O servidor Dissulfide by Design 2 (DbD 2) v 2.12 foi usado para melhorar a estabilidade estrutural geral da vacina projetada, introduzindo ligações dissulfeto. Este método utiliza geometria nativa e calcula um valor de energia para cada dissulfeto potencial, fornecendo assim um meio para classificar as ligações dissulfeto candidatas. As ligações dissulfeto que conferem estabilidade máxima foram as candidatas com alto valor de chi3, energia de ligação e fator B [54]. As regiões flexíveis do peptídeo foram selecionadas com base nos parâmetros mencionados anteriormente, e as mutações estabilizadoras correspondentes foram criadas formando ligações dissulfeto entre os pares de resíduos escolhidos.

Ancoragem molecular da construção da vacina com receptores imunológicos (TLRs-2, 4, 5, 8 e TLR-9 de camundongo humanos)

Os receptores Toll-like (TLR) são atributos importantes das respostas imunes celulares que reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e evocam respostas imunes inatas contra infecções. A ativação direta de TLR-2 com componentes de Leishmania foi posteriormente relatada [55]. Em outros estudos experimentais relacionados, a falta de TLR-4 resultou em aumento do crescimento parasitário e retardo na cicatrização de lesões cutâneas causadas por infecções por L. major, indicando o papel plausível do TLR-4 na indução de imunidade contra Leishmania [56 ]. Por outro lado, descobriu-se que TLR -2, 4 e 9 estão envolvidos em um espectro imunopatológico de CL causado por L. braziliensis e L. amazonensis (57). O TLR-9 também foi avaliado como um ator-chave na ativação de células dendríticas na patogênese da LV em humanos [58]. Foi demonstrado que alguns dos componentes derivados da Leishmania ativam TLR-2, 4 e 9 na maioria dos estudos realizados neste campo. Estas observações enfatizam o fato de que vários TLRs estão envolvidos no desencadeamento da imunidade protetora contra a Leishmania. Portanto, uma interação entre os TLRs e a construção da vacina projetada foi considerada necessária para induzir imunidade eficaz contra infecções por Leishmania. Isso foi verificado realizando docking molecular do peptídeo da vacina multiepitópica com TLRs humanos -2, 4, 5, 8 e TLR de camundongo -9 usando o servidor PatchDock [PatchDock Server (tau.ac.il )]. O algoritmo PatchDock possui três estágios principais, a saber, representação da forma molecular, correspondência de patches de superfície e filtragem e pontuação. É um algoritmo de acoplamento molecular baseado em geometria que opera principalmente na complementaridade da forma molecular entre o receptor e o ligante. Os patches complementares são combinados e as transformações candidatas são geradas. Cada uma dessas transformações é ainda classificada atribuindo-se uma função de pontuação que considera tanto a energia de dessolvatação atômica quanto os pés geométricos [59, 60]. Em nosso estudo, TLR humano-2 (id do PDB: 6NIG), TLR-4 (id do PDB: 4G8A), TLR-5 (id do PDB: 3J0A), e TLR-8 (PDB id: 4QC0) e TLR de camundongo-9 (PDB id: 3WPF) foram selecionados como receptores, e seus arquivos PDB separados foram recuperados do Protein DataBank (www .rcsb.org). O modelo 3D refinado do peptídeo da vacina foi utilizado como ligante para todas as simulações de acoplamento. O servidor PatchDock foi configurado com parâmetros padrão (clustering RMSD: 4.0). Analisamos ainda o melhor modelo de acoplamento usando o servidor Cluspro com base em um possível algoritmo de rotação de títulos, e os títulos foram avaliados usando o software PyMOL [61].

Otimização de códons, previsão de estrutura de mRNA e clonagem in silico para expressão de proteína de vacina

A otimização do códon é necessária para atingir a expressão máxima de genes estranhos no organismo hospedeiro quando o uso de um códon pelo hospedeiro difere significativamente daquele do hospedeiro nativo do qual as sequências originais para a construção final da vacina foram selecionadas. JCat (Java Codon Adaptation Tool), disponível publicamente em (//www. jcat.de/), foi usado para tradução reversa e otimização de códons, fornecendo uma sequência primária da construção final da vacina como entrada. O uso de códons foi otimizado para o organismo procariótico mais sequenciado, E. coli K12 [6]. Três opções adicionais fornecidas pela ferramenta foram selecionadas para evitar terminadores de transcrição independentes de rho, locais de ligação ao ribossomo procarióticos e locais de clivagem de restrição indesejados. O índice de adaptação de códons (CAI) e o conteúdo de GC, calculados pela ferramenta JCat, indicam quão boa foi a otimização. Uma melhor otimização garante maior expressão da proteína da vacina. Além disso, locais de restrição para as enzimas XhoI e NdeI foram incorporados na sequência de cDNA otimizada fornecida pela ferramenta JCat para facilitar a clonagem. A sequência modificada (com locais de restrição) foi então inserida no vetor plasmídico pET 28-a(+) de E. coli usando o módulo de clonagem de restrição da ferramenta SnapGene [6, 31, 62, 63]. O software SnapGene está disponível na web em (https://www.snapgene.com/). Além disso, também utilizamos o servidor web mfold (//unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form) para a predição da estrutura secundária do mRNA codificado por os genes do peptídeo quimérico. A sequência otimizada traduzida reversamente obtida da ferramenta JCat foi fornecida como entrada. O programa mfold é baseado em um algoritmo central que prevê energia livre mínima, ∆ G, e energias livres mínimas para dobramentos contendo qualquer par de bases específico. Várias restrições de dobramento também são aplicadas para a previsão precisa das energias de dobramento. A energia de dobramento para o dobramento do RNA é fixada em 37 graus, enquanto as condições iônicas são fixadas em [Na+]=1 M e [Mg++]=0 [64].

Simulação imunológica baseada em C‑immsim

C-immsim (https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index. php?page=1) é uma ferramenta de previsão de resposta imunológica baseada em servidor que utiliza classe baseada em agente e sua previsão depende de redes neurais. Pode prever respostas imunes humorais e mediadas por células. C-immsim utiliza o modelo Celda Seiden, modelo de rede policlonal de cadeia de bits e índice de Simpson para caracterizar a previsão de células ativas, em repouso e de memória e sua longevidade. Ajuda a prever o perfil de citocinas de uma determinada reação para avaliar respostas inflamatórias [65].

Extrato de cistanche em pó

Simulação dinâmica molecular

A simulação dinâmica molecular foi realizada para avaliar a estabilidade do nosso melhor complexo, ou seja, TLR, com a vacina proposta usando iMOD (servidor iMod Server home page (csic.es). Este servidor baseado na web usa análise de modo normal melhorada (NMA) para a caracterização de diversas propriedades dinâmicas de biomoléculas, como flexibilidade e estabilidade de proteínas, por meio de um campo de força intra-atômico.No presente estudo, analisamos as principais deformidades da cadeia, fator B, autovalores, fator de covariância e modelo de rede elástica como parâmetros padrão de NMA para a avaliação de complexos proteína-proteína obtidos por abordagens in silico [66–69].

Resultados

Seleção e recuperação de sequências proteicas antigênicas de Leishmania

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0,51), refletindo sua maior potência para o desenho de vacinas (Tabela 1). As proteínas foram discriminadas como secretoras e não secretoras com base na previsão de locais de clivagem de peptídeos de sinal pelo servidor SignalP 1.4. Duas das proteínas de Leishmania selecionadas, viz. Descobriu-se que a cisteína proteinase A de L. mexicana (Uniprot id: P25775) e a glicoproteína de superfície GP-46/M2 de L. amazoensis (Uniprot id: P21978) contêm peptídeos de sinal e, portanto, previstas como proteínas secretoras. O restante dos dez antígenos de Leishmania não apresentou nenhum peptídeo sinal indicando sua natureza não secretora. A análise de localização previu que a proteína cisteína proteinase A de L. mexicana (Uniprot id: P25775) estaria localizada no lisossomo/vacúolo, as proteínas leishmanolisina C1 e proteofosfoglicano de L. mexicana (Uniprot ids: P43150 e Q9TW13, respectivamente) seriam proteínas de membrana , FALTA de antígeno protetor de L. donovani (Uniprot id: Q9BIJ5) para estar no núcleo e proteína 1 relacionada ao choque térmico 70 de L. major (Uniprot id: P12076) para estar localizada nas mitocôndrias. Todas as outras proteínas foram previstas como citoplasmáticas (Tabela 1). Além disso, a sequência de aminoácidos da cadeia alfa da IL humana -12 também foi obtida do banco de dados Uniprot (Uniprot id: P29459) para ser utilizada como adjuvante na construção final da vacina.

Predição de epítopos CTL e HTL

De todas as proteínas investigadas, um número total de 59 epítopos CTL não-americanos comuns foram identificados em conjunto pelos servidores NetCTL 1.2 e SYFPEITHI. A cada um dos epítopos CTL previstos foi atribuída uma pontuação específica calculada pelos respectivos servidores. Apenas 26 destes motivos CTL 9-mer comuns foram selecionados devido às suas pontuações mais altas (indicando maior afinidade de ligação ao MHC I). Estes vinte e seis epítopos de CTL identificados comumente por ambos os servidores com pontuações mais altas compatíveis foram incluídos na construção final da vacina (Tabela Suplementar S1). Da mesma forma, a ferramenta de análise de ligação ao MHCII IEDB previu epítopos 15-mer HTL de todas as proteínas selecionadas contra um conjunto de três alelos HLA humanos (HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*01:02 e HLADRB1* 01:03). Os epítopos HTL previstos com a classificação ajustada mais baixa para cada um destes alelos estão documentados como na Tabela S2 suplementar. Deste conjunto, foi escolhido um número total de nove sequências com base nas suas classificações baixas ajustadas (Tabela 2) que tornam estes epítopos de HTL os ligantes de MHC-II mais potentes para qualquer um dos três alelos HLA. Os epitopos HTL seleccionados foram em seguida submetidos a análises computacionais adicionais, a fim de prever as suas capacidades de produção de citocinas.

Tabela 1 Doze peptídeos antigênicos potenciais de diferentes espécies de Leishmania foram explorados para a construção de vacinas e selecionados com base em seu alto escore de antígeno, conforme previsto pelo servidor ANTIGENpro

Triagem de epítopos HTL com habilidades indutoras de citocinas

Todos os nove epitopos HTL escolhidos (Tabela 2) foram avaliados quanto à sua capacidade de produzir interferão empregando um servidor IFNepitope. O servidor previu (IFN- vs. nonIFN, usando SVM e análise híbrida baseada em motivos) apenas três peptídeos como FRRLYKTLGQLVYKK da proteína de bastonete parafagelar 2C de L. major, DNGAYLGMEPSSVAA do proteofosfoglicano de L. mexicana e RLHFFMMGFAPLTSR da cadeia beta de tubulina de L. mexicana como "positiva" com pontuações inferiores a 1.0 (Tabela 3). Esses três peptídeos foram verificados posteriormente quanto às suas capacidades de produção de IL-4 e IL-10-usando o servidor IL4pred e o servidor IL10pred, respectivamente. Ambos os servidores utilizam um classificador SVM e consideram vários parâmetros de entrada do SVM, como composição de aminoácidos, composição de dipeptídeos, propensão de aminoácidos e propriedades físico-químicas para a previsão [32, 33]. Os respectivos servidores previram que esses três epítopos produtores de 15-mer IFN- -eram indutores para IL-4 e IL-10 também (Tabela Suplementar S3). Portanto, esses três epítopos HTL 15-mer de ligação ao MHC-II foram finalmente selecionados para a construção da vacina considerando sua capacidade de induzir a produção de citocinas IFN-, IL-4 e IL{{24 }} mediando assim uma resposta imunológica intensificada.

Análise de conservação de epítopos

O módulo IEDB "conservação através do antígeno" disponível no servidor IEDB foi aproveitado para encontrar o grau de conservação dos epítopos CTL e HTL selecionados que seriam incorporados na construção final da vacina. Cada um dos vinte e seis epítopos de CTL e três epítopos de HTL foi testado individualmente contra um conjunto específico de sequências de proteínas homólogas obtidas pelo Uniprot BLAST. Os resultados do BLAST mostraram um alto grau de conservação das proteínas selecionadas em diversas espécies de Leishmania e também em outros protozoários parasitas relacionados, principalmente Trypanosoma. Descobriu-se que todos os epítopos HTL são altamente conservados (100%) em todo o conjunto de proteínas relacionadas de Leishmania usadas na análise, enquanto a faixa de conservação para epítopos CTL selecionados variou de 0 a 100% (Tabela Suplementar S4). A incorporação de tais epítopos conservados de CTL e HTL na construção final da vacina garantiria imunidade cruzada de amplo espectro contra múltiplas espécies de Leishmania patogênica que comumente infectam humanos.

Tabela 2 Detalhes dos epítopos HTL selecionados (15 mer) com suas proteínas de origem, alelos de ligação correspondentes e classificações ajustadas previstas pela ferramenta de ligação ao MHC-II do IEDB

Tabela 3 O servidor IFNepitope previu epítopos indutores de MHC II que são capazes de produzir interferon

Construção de sequência de vacina multiepítopo

A sequência primária da vacina peptídica de múltiplas subunidades foi construída fundindo as sequências de vinte e seis epítopos CTL e três epítopos HTL seleccionados com base na sua antigenicidade, afinidade de ligação ao MHC e capacidade de indução de citocinas. Os epítopos CTL e HTL individuais foram amalgamados utilizando ligantes AAY e GPGPG, respectivamente, e o comprimento total do péptido da vacina resultante foi de 369 aminoácidos. O adjuvante, cadeia alfa longa de 219 aminoácidos de IL humana -12 (Uniprot id: P29459), foi adicionado ao terminal N do peptídeo projetado pelo ligante EAAK. A adição de IL -12 como adjuvante natural deveria aumentar a eficácia da vacina, acelerando a resposta imunológica, conforme já validado em estudos com animais [3, 37]. Além disso, um marcador 6XHis também foi adicionado ao terminal C do peptídeo para facilitar a identificação e purificação da proteína após a sua produção por tecnologia de DNA recombinante. Após a adição de ligantes, adjuvante e marcador de histidina, o comprimento do peptídeo final da vacina foi de 598 resíduos de aminoácidos (Fig. 1).

Predição de epítopo de células B linear, contínuo e descontínuo

A presença de determinantes antigênicos na sequência primária da vacina projetada foi identificada pelo emprego de dois servidores diferentes, a saber, ABCpred e BepiPred 2.0, para uma previsão mais eficaz. O servidor ABCpred prevê epítopos de células B usando uma rede neural recorrente treinada e representa as sequências candidatas como peptídeos 16-mer classificados de acordo com suas pontuações de ligação (Tabela Suplementar S5). Uma pontuação mais elevada do péptido significa uma probabilidade mais elevada de ser um epítopo. Descobriu-se que o peptídeo da vacina projetado tem sete peptídeos 16-mer não sobrepostos com pontuações previstas de 0,90 e acima, com um valor limite padrão de 0,51 , refletindo sua potência muito alta para ligar e estimular células B. O outro servidor, BepiPred 2.0, prevê a probabilidade de cada resíduo de aminoácido na sequência de entrada fazer parte do epítopo da célula B e representa a saída como uma ilustração com uma gradação de cor laranja indicando o grau de probabilidade. Os resíduos previstos que pertencem aos epítopos das células B estão marcados como "E". O servidor identificou um grande número de resíduos como sendo epítopos lineares de células B com alta probabilidade dentro de um trecho de resíduo de 380–53{{20}} posição do peptídeo (Fig. 2) quando o limite de epítopo foi definido em 0,5 (padrão). Assim, a identificação de determinantes antigênicos para receptores de células B por dois servidores independentes estabeleceu o fato de que o peptídeo, quando administrado como vacina, seria capaz de estimular a produção de anticorpos pelas células B para proteger os indivíduos contra infecções por Leishmania. O traje Ellipro (disponível no portal IEDB) previu um total de 323 resíduos de aminoácidos localizados em oito epítopos descontínuos de células B na estrutura terciária refinada da vacina peptídica, com pontuações variando de 0,509 a 0,802. Entre eles, o maior epítopo conformacional continha 107 resíduos de aminoácidos com uma pontuação prevista de 0,772. Os parâmetros padrão do servidor foram utilizados para a análise. Ellipro também previu doze epítopos lineares de células B com um número total de 324 resíduos dentro de uma faixa de pontuação de 0,535 a 0,885 (Tabela Suplementar S6 e imagem suplementar M1).

Perfil de antigenicidade, alergenicidade e toxicidade da construção da vacina

A antigenicidade da sequência final da vacina (com adjuvante) foi avaliada pelos servidores ANTIGENpro e VaxiJen 2.0. O servidor ANTIGENpro previu que o mesmo seria um antígeno provável com uma pontuação de antigenicidade de 0,745396. O servidor VaxiJen 2.0 avaliou o peptídeo da vacina como um antígeno provável com uma pontuação de 0,5325 em um limite de {{10}},5 quando o organismo alvo foi selecionado para ser um parasita (Tabela 4). No entanto, quando a sequência original da vacina sem o adjuvante foi analisada pelo VaxiJen 2.0, ela também foi prevista como um antígeno provável com uma pontuação de 0,5768 em modelos de parasitas. A pontuação de previsão do ANTIGENpro para a sequência original foi 0,714582. Assim, verificou-se que ambas as sequências de vacina construídas (com e sem adjuvante) eram de natureza antigénica, apoiando o facto de os componentes peptídicos da vacina serem antigénicos por si próprios, mesmo na ausência do adjuvante adicionado (Tabela 4). No que diz respeito à alergenicidade, a sequência final da vacina foi considerada não alergênica pelo AlgPred com uma pontuação prevista de 0,4018 com um limite de 0,4. Além disso, não foi encontrado nenhum epítopo de IgE experimentalmente comprovado na sequência da proteína, e não foram encontrados resultados do BLAST para peptídeos representativos de alérgenos (ARPs), indicando a natureza não alergênica da vacina. O servidor AllerTOP v.2.0 também definiu a proteína como um provável não alérgeno. A análise de toxicidade pelo servidor ToxinPred previu que o peptídeo não era tóxico quando a abordagem baseada em motivo SVM (TrEMBL) + foi adotada em um limite de SVM de 0,1, e o valor de corte E para baseado em motivo foi definido em 10,0. Assim, a sequência da vacina gerada foi prevista como um antígeno provável, não alergênico e não tóxico, sendo todos critérios importantes para uma vacina peptídica de múltiplas subunidades ideal.

Fig. 1 Representação esquemática da vacina peptídica multiepítopo projetada contendo um total de 598 sequências de aminoácidos representando uma possível construção de vacina com adjuvante natural N-terminal (verde) ligado a EAAK (roxo) com 26 CTL (laranja) usando ligante AAY (azul) e 3HTL (amarelo) estão conectados ao vinculador GGPPG (vermelho). Termina com 6-Sua tag no terminal C para fins de purificação

Fig. 2 Epítopo de células B previsto pelo servidor Bepipred 2.0. Estiramentos em diferentes pontos de sequências de 1 a 590 aminoácidos foram previstos com epítopo potencial acima do nível limite padrão. A primeira linha marcada como E mostra a localização prevista do epítopo

Avaliação de parâmetros físico-químicos

Os parâmetros físico-químicos da construção final da vacina foram calculados pelo servidor Protparam com base nos resíduos de aminoácidos presentes na sequência dada. O peso molecular (PM) do péptido concebido foi calculado em 65,68 kDa, o que o torna adequado para induzir uma resposta imunogénica. O pI teórico (ponto isoelétrico) foi calculado como 5,98, o que designa o peptídeo como de natureza ligeiramente ácida. O número total de resíduos carregados positivamente e carregados negativamente no peptídeo foi 48 e 55, respectivamente. A meia-vida foi calculada como 30 h em reticulócitos de mamíferos in vitro, mais de 20 h em leveduras e mais de 10 h em E. coli in vivo. A persistência da proteína durante 30 horas em células de mamíferos (incluindo humanos) foi suficiente para provocar uma resposta imunitária desejável, uma vez que o mecanismo requer processamento e apresentação da proteína pelas células imunitárias. O índice alifático (volume relativo ocupado pelas cadeias laterais alifáticas) foi previsto em 78,34, indicando que a proteína é de natureza termoestável, pois o índice alifático pode ser considerado um fator positivo que contribui para o aumento da termoestabilidade das proteínas globulares. O índice de instabilidade foi calculado em 47,10. O valor da média geral prevista de hidropatia (GRAVY) da construção da vacina foi previsto em -0,140; o valor negativo o define como de natureza hidrofílica e irá interagir com moléculas de água [28, 70–72]. Para concluir, a análise imunoinformática previu a construção peptídica concebida como antigénica, termoestável, persistente em células de mamíferos e hidrofílica. Todos estes factores têm impacto na eficácia da construção como uma provável vacina candidata.

Previsão da estrutura secundária

A previsão da estrutura secundária para o peptídeo quimérico de 592 resíduos pelo servidor PSIPRED revela a presença de 45,77% de hélice alfa, 4,89% de folha beta e 49,32% de bobinas, conforme representado na Figura 3 a seguir. O servidor de predição analisou a acessibilidade relevante ao solvente para o peptídeo no qual 36% dos resíduos foram previstos para serem expostos, 28% foram previstos como meio enterrados e 35% dos resíduos foram previstos como enterrados, indicando que a proteína terá um contato geral justo com água (solvente). Apenas 32 resíduos (5% do peptídeo) foram previstos como estando no domínio desordenado da proteína pelo servidor RaptorX.

Previsão da estrutura terciária

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5 indica um modelo com a dobra correta. A pontuação TM é um parâmetro independente do comprimento da sequência para medir a similaridade estrutural do modelo previsto com outras proteínas idênticas na mesma família de dobras SCOP / CATH (47).

Tabela 4 Resultados de antigenicidade calculados a partir do servidor ANTIGENpro e do servidor Vaxijen2.0 com e sem antígeno

Fig. 3 Previsão da estrutura secundária para a sequência linear da vacina pelo servidor PSIPRED

Fig. 4 Predição e refinamento da estrutura terciária 3-Modelagem D da estrutura da vacina conforme previsto pelo servidor I-TASSER. b Refinamento do modelo 3-D bruto pelo servidor GalaxyRefne

Refinamento e validação do modelo 3-D da vacina

O modelo terciário "bruto" para a vacina peptídica foi refinado subsequencialmente, processando-o através do servidor GalaxyReone. O GalaxyRefne produziu cinco modelos, dos quais o modelo 1 foi considerado o melhor após a avaliação e comparação dos parâmetros associados, como GDT-HA (0.8826); RMSD (0.608); MolProbidade (2.398); pontuação do confronto (21,1); rotâmeros ruins (0.6); e região favorecida por Rama (88,8) com o restante dos modelos (Fig. 4b). O gráfico Ramachandran gerado pelo servidor MolProbity mostrou que o modelo 3-D refinado tem 88,8% de resíduos na região favorecida, 98,6% de resíduos na região permitida e apenas 0,013% de outliers. Em contraste, descobriu-se que o modelo bruto inicial tinha 77,1%, 94,2% e 0,057% de resíduos nas regiões favorecidas, permitidas e atípicas, respectivamente. Estes resultados concluem claramente que a qualidade do modelo terciário refinado foi significativamente melhorada. O servidor ERRATA também foi explorado para validação adicional do modelo refinado. O servidor ERRATA analisou o modelo com um fator de qualidade geral de 43,542, que na verdade representa a porcentagem do modelo de proteína de entrada que fica abaixo do limite de rejeição de 95%. Assim, obtivemos com sucesso uma estrutura terciária sensivelmente refinada e validada para a construção da vacina. A estrutura terciária refinada da vacina, juntamente com os gráficos obtidos do servidor MolProbity e do servidor ERRAT, está representada na Fig. 5. O servidor web ProSA mostrou um escore Z de -1,08 (imagem suplementar M2), em que o negativo o valor indica que o modelo está fora da faixa de pontuações de proteínas semelhantes com tamanhos comparáveis, cujas estruturas foram determinadas por difração de raios X ou por RMN [51].

Engenharia dissulfeto do peptídeo da vacina

O servidor Dissulfide by Design 2.12 retornou 45 pares de resíduos de aminoácidos que são locais prováveis ​​para a formação de ligações dissulfeto. Identificamos os quatro pares de resíduos candidatos mais cruciais que podem estar localizados na região da alça flexível da proteína da vacina com base em sua alta energia de ligação e valores de Chi3 (Tabela Suplementar S7). Esses resíduos, THR58-PHE61 (chi3:+126.18), LEU216-ALA234 (chi3:+125.92), THR323-GLU359 (chi3 :+121.54) e TYR472-ARG504 (chi3: + 125.75), foram substituídos por cisteína no modelo terciário refinado da proteína final da vacina, melhorando assim a estabilidade térmica de peptídeo (Fig. 6). No entanto, a precisão do fator B é limitada à atenuação do espalhamento de nêutrons ou raios X pelo movimento térmico das moléculas na cristalografia de proteínas. Assim, selecionamos rigorosamente valores elevados de energia de ligação e Chi3 em relação ao fator B para este modelo de vacina refinada assistida por computador [73, 74].

Análise das interações de acoplamento do peptídeo da vacina com os TLRs

As interações do peptídeo quimérico com os receptores imunes (TLRs humanos{{0}}, 4, 5, 8 e TLR de camundongo-9) foram estudadas realizando análise de docking usando o servidor PatchDock no qual a ligação foram avaliadas afinidades da vacina (ligante) com vários TLRs (receptores). Foram considerados os dez principais modelos gerados pelo PatchDock para cada docking, dentre os quais foram selecionados os modelos melhor classificados e com maiores pontuações de docking para cada caso. As pontuações representaram a forma e o complemento eletrostático entre os receptores e ligantes. A melhor complementaridade foi encontrada no caso do TLR humano -2 (PDB id: 6NIG) com pontuação de 18.714, área de superfície 3963,1 0 e energia de contato atômico (ACE) 217,99 (Fig. 7a) . A vacina também exibiu ligação eficiente com TLR-5 (ID do PDB: 3J0A) e TLR-9 (id do PDB: 3WPF) com uma pontuação de acoplamento de 18.258; área de superfície 2.879,80 e ACE de −666,94 e pontuação de acoplamento 18.164; e área superficial 4.090,70 e ACE de 495,74, respectivamente. O acoplamento com outros TLRs mostrou afinidades de ligação mais fracas, conforme refletido pelas pontuações de acoplamento mais baixas geradas pelo PatchDock, 16.708 para TLR-4 (id do PDB: 4G8A) e 17.800 para TLR-8 (id do PDB: 4QC0). Assim, a nossa construção de vacina foi capaz de se ligar a diferentes receptores imunes com diversas afinidades de ligação. Isto seria altamente desejável para uma vacina eficaz em termos de indução de uma imunidade adequada e aumentada para prevenir infecções por Leishmania. Além disso, a ferramenta web FireDock foi empregada para refinamento e nova pontuação do melhor complexo (complexo de vacina TLR -2), que refinou o mesmo com energia global mínima de -19,01, associações de Van Der Waals (-25,74), contato atômico energia (-0,03) e energia livre de ligação (-24,26). Estes resultados corroboram o fato de que o peptídeo da vacina interage de forma mais eficiente com o TLR humano -2 e, assim, forma um complexo razoavelmente estável que pode resultar em uma resposta imune marcante contra parasitas Leishmania. Além disso, investigamos ainda mais a ligação entre TLR-2 e vacina; usando o servidor web Cluspro, o modelo superior (Fig. 7b) é selecionado com base em FFT rotacional 5D e CAPRI (avaliação crítica de interações previstas) com a pontuação ponderada balanceada - 1192,5 tendo o maior tamanho de cluster de 42 membros. A Tabela 5 contém uma lista de 10 resíduos de aminoácidos interagindo da Fig. 7b que formam um complexo receptor-ligante estável.

Fig. 5 um gráfico de Ramachandran para o modelo GalaxyRefne. b servidor ERRAT previu avaliação da qualidade da estrutura da proteína

Fig. 6 Dissulfeto por projeto 2.0 previu quatro (denotadas pela seta) potenciais formações de ligações dissulfeto para melhorar a estabilidade térmica da construção final da vacina

Otimização de códons e clonagem in silico para expressão da proteína vacinal

Na tentativa de superar o problema de polarização de códons, a ferramenta JCat foi utilizada para otimização de códons que retornou a sequência de aminoácidos de entrada do peptídeo da vacina na forma de uma sequência de cDNA traduzida reversamente com um valor CAI otimizado de 1. Este valor reside dentro da faixa de valores CAI aceitos de 0,8–1.0 [28], garantindo uma alta taxa de expressão do gene no organismo hospedeiro, E. coli K12. Quanto maior o valor do CAI, melhor será a taxa de expressão do gene estranho. Além disso, o conteúdo de GC da sequência melhorada foi de 51,85%, indicando uma boa otimização de códons. Para melhor expressão gênica, é necessário conteúdo de GC de 35 a 70% (63). Os sítios de restrição para as enzimas XhoI e NdeI foram criados nas extremidades 5/ e 3/ da sequência, seguido pela inserção da sequência modificada no vetor pET28 a(+). A inserção clonada, representada na cor vermelha, fica entre os locais de restrição especificados no vetor. Um trecho de seis resíduos de histidina também está localizado em ambas as extremidades da sequência clonada para facilitar o processo de purificação após a produção da proteína da vacina recombinante [6, 31]. O tamanho da construção final do vetor plasmídico com o fragmento do gene inserido foi de cerca de 7 kb (Fig. 8). O servidor web mfold previu um número total de cinquenta conformações dobráveis ​​do mRNA, entre as quais a estrutura superior foi escolhida devido ao seu menor escore de energia (ΔG= −492,50). Previu-se que esta conformação dobrada específica continha um único loop externo e quatro pilhas com energias livres mínimas indicando a estabilidade da conformação. A alça foi formada por 21 bases de fita simples e duas hélices de fechamento. O gráfico de pontos de energia calculou a energia ideal (δG) em 494,4 kcal/mol. Os diferentes pontos coloridos no campo referem-se aos diferentes graus de energia de um determinado par de bases presente no mRNA, considerando o δG calculado pelo servidor [64]. De acordo com o gráfico, as energias livres da maioria dos pares de bases estão dentro da faixa −487,5<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

Tabela 5 PyMOL gerou dez resíduos de aminoácidos em interação do receptor e ligante da Fig. 7b, e o número em () indica a respectiva posição dos aminoácidos no receptor e ligante

Simulação imunológica

A simulação imunológica in silico usando o servidor web C-immsim previu que a contagem antigênica atingiu até 6,9× 105 /ml dentro de 2 dias após uma dose inicial de injeção, e o nível de antígeno caiu para 0 no quarto dia em diante. Este incremento na contagem de antigénios está correlacionado com um aumento notável na concentração tanto do nível de IgM IgG como do nível de IgM isoladamente durante o período inicial da infecção e atingindo o nível máximo aproximadamente 12 dias após o ciclo de infecção numa escala arbitrária. Outros subtipos de IgG1+nível de IgG2 e IgG1 aumentam acentuadamente como resultado da resposta imune secundária (Fig. 9a). Os perfis de citocinas mostram mediadores inflamatórios como o INF atingindo níveis de até 4 × 106 ng / ml no 12º dia, enquanto outros níveis de citocinas permanecem bastante baixos (Fig. 9b). As respostas imunológicas mediadas por células sugeridas pela presença de linfócitos T citotóxicos ativos e em repouso aumentam após 2 a 3 dias após a injeção inicial, e a presença de células T auxiliares de memória proliferativa também foi proeminente (Fig. 9c e d). A população total de células B também aumenta dentro de 2–3 dias, juntamente com a geração de células B de memória após 1 semana de administração da dose primária (Fig. 9e).

Fig. 8 Sistema de expressão de vacina contra Leishmania usando vetor pET28 a(+), região vermelha indica sequência de ácido nucleico inserida da vacina flanqueada por sítios de restrição NdeI e XhoI

Interpretação da simulação dinâmica molecular

A melhor pontuação de acoplamento alcançada pelo complexo de vacina TLR2-foi analisada posteriormente por simulação dinâmica molecular assistida por NMA. A deformabilidade da corrente principal é representada por dobradiças altas (Fig. 10a), o que significa alta deformabilidade. O fator B (Fig. 10b) foi calculado por NMA, o que significa flexibilidade da proteína com base em parâmetros de deslocamento atômico (73). O autovalor (Fig. 10c) delineia a energia necessária para deformar a estrutura. O complexo de vacina TLR-2 mostra um autovalor de cerca de 7,778× 10−7. A variância (Fig. 10d) está inversamente relacionada ao autovalor. A matriz de covariância (Fig. 10e) ilustra se os pares de resíduos são correlacionados (vermelho), não correlacionados (branco) ou anti-correlacionados (azul). O modelo de rede elástica (Fig. 10f) calcula molas entre pares de átomos correspondentes, pontos no gráfico representados por gradiente de cor indicando rigidez ou flexibilidade da mola, e a cor mais escura reflete uma mola mais rígida. Assim, os resultados da simulação dinâmica molecular sugeriram que a nossa vacina peptídica proposta é estável.

Discussão

A leishmaniose é considerada uma das doenças tropicais mais negligenciadas que afeta principalmente as pessoas que vivem em áreas pobres dos países em desenvolvimento, incluindo a Índia [2]. De acordo com relatórios da OMS, a Índia é endêmica para ambas as formas da doença, CL e LV. A LC causada por L. tropica e L. major ocorre nos estados do noroeste da Índia, sendo Punjab e Rajasthan os focos (https://www.who.int/leishmaniasis/load/Leishmaniasis_India/en/ ). Além disso, com a ocorrência crescente da epidemia do vírus da imunodeficiência humana (HIV) em todo o mundo, a leishmaniose emergiu como um patógeno oportunista que ressurgiu em pacientes com AIDS, tornando a situação ainda mais terrível [22, 38]. No presente estudo, nosso objetivo foi desenvolver uma nova vacina geral polivalente para leishmaniose que pudesse fornecer proteção heteróloga contra espécies de parasitas patogênicos comuns. Selecionamos doze proteínas específicas de Leishmania abrangendo cinco cepas patogênicas do parasita que causa infecções por LV e CL em humanos. Estas proteínas já tinham sido avaliadas pelo seu papel na virulência e imunogenicidade e pelo seu potencial como candidatas a vacinas em vários estudos imunológicos [1, 8–10, 75]. Portanto, uma construção de vacina projetada in silico, incorporando proteínas imunogênicas bem caracterizadas e altamente conservadas de diferentes espécies patogênicas de Leishmania, poderia fornecer imunidade cruzada contra todas as formas de leishmaniose humana (principalmente LV e CL) e, portanto, poderia ser usada para um programa geral de vacinação para prevenir infecções por Leishmania em humanos. As proteínas selecionadas foram pesquisadas principalmente quanto à presença de potenciais epítopos de CTL e HTL. A detecção de epítopos de células T é importante, uma vez que as células T só podem reconhecer antígenos quando processadas por via endógena ou exógena, complexadas com moléculas de MHC de classe I ou MHC de classe II, e são subsequentemente apresentadas aos receptores de células T pelas células apresentadoras de antígeno. APC). O MHC-I é específico para CD8+CTLs, enquanto o MHC-II se liga especificamente aos receptores CD4+HTL. A identificação de epítopos de CTL foi realizada rigorosamente através do emprego de dois servidores independentes simultaneamente. Apenas os epitopos previstos por ambos os servidores com afinidades de ligação ao MHC significativamente mais elevadas foram finalmente incluídos no péptido da vacina. Os epítopos HTL identificados foram avaliados posteriormente quanto às suas capacidades de indução de citocinas, explorando três servidores web. Aqueles que poderiam estimular a produção de uma ampla variedade de citocinas, a saber, IFN-, IL{{20}} e IL-10, foram selecionados para projetar a vacina peptídica quimérica para garantir que isso instigaria a produção de todas essas citocinas específicas do parasita no hospedeiro. Isto é de extrema importância, uma vez que Kedzierski e colegas propuseram que a secreção de IL-10 é tão importante quanto a secreção de IFN- para determinar se uma vacina pode provocar uma resposta imune protetora e que a imunidade adequada não é induzida se IL -10 níveis não são proporcionalmente elevados [8, 75]. Os epitopos CTL e HTL exclusivos foram em seguida fundidos utilizando ligantes AAY e GGPPG para construir o péptido quimérico. Foi relatado anteriormente que os ligantes AAY e GGPPG são úteis para o projeto de vacinas multiepítopos, pois permitem imunogenicidade juncional mínima e facilitam o processamento e apresentação de epítopos selecionados pelo MHC-II [6, 28, 71]. A cadeia alfa adjuvante da IL humana -12 foi ligada ao terminal N do peptídeo resultante através do ligante EAAK. A IL-12 foi escolhida como adjuvante por ser um dos adjuvantes mais eficazes para a vacina contra Leishmania em modelos animais, conforme documentado em estudos imunogênicos anteriores [3, 37, 71]. Como a vacina se destina à administração humana, espera-se que a incorporação de IL humana-12 como adjuvante natural em vez de qualquer agonista de TLR sintético aumente a imunidade sem causar efeitos colaterais adversos. O papel da IL-12 como adjuvante geral para vacinas também é ressaltado devido à sua potência em melhorar as respostas de anticorpos de vacinas proteicas e polissacarídicas e induzir inflamação local adequada que permite a exsudação de IgG, levando a uma resposta imune aumentada [72]. O ligante EAAK foi adicionado para atingir uma taxa de expressão mais alta e para promover a função biológica do peptídeo de fusão, restringindo a interação entre os domínios da vacina [76, 77]. A análise imunoinformática mostrou que a nossa construção de vacina possui muitos epítopos lineares de células B que são altamente desejáveis ​​para uma vacina feita para uso imunoprofilático. Novamente, usamos duas ferramentas diferentes para previsões mais precisas. Ambos os servidores previram epítopos de células B suficientes na sequência da vacina. Prevê-se que a vacina projetada seja não alergênica, não tóxica e suficientemente imunogênica para desencadear uma reação imunológica adequada. A análise físico-química subsequente revelou que o peptídeo da vacina era ligeiramente ácido (pI 5,98) com um índice alifático consideravelmente mais elevado (78,34), sugerindo a sua natureza termoestável. Um valor GRAVY negativo (-0,14) indica que o peptídeo é hidrofílico, o que contribui ainda mais para sua potência como vacina. Os elementos estruturais secundários da vacina foram determinados pelo servidor PSIPRED v 4.0, que é um dos métodos computacionais mais precisos e amplamente utilizados para previsão da estrutura secundária de proteínas. Além disso, a estrutura 3D do peptídeo desenhado também foi prevista utilizando o servidor I-TASSER que forneceu informações detalhadas sobre as coordenadas dos resíduos importantes da proteína, o que é de suma importância para estudar a dinâmica, bioatividade e interação da vacina. com outros ligantes. A estrutura terciária inicial foi refinada e validada utilizando ferramentas de validação de estrutura proteica para localizar e retificar possíveis erros na cadeia lateral ou espinha dorsal do modelo previsto. A análise do gráfico Ramachandran mostrou que mais de 90% dos resíduos do modelo refinado estão dentro da região permitida com uma pequena porcentagem de valores discrepantes, enquanto o servidor ERRAT mostrou um fator de qualidade de 43,542, todos implicativos de qualidade satisfatória do modelo. Descobriu-se que o modelo 3D validado possui um número adequado de epítopos conformacionais de células B pelo servidor ElliPro, implicando que ele pode gerar uma resposta desejável de células B e estimular a produção de anticorpos específicos no hospedeiro. A ativação das células B também é crucial na memória imunológica e responsável pela imunidade duradoura em indivíduos vacinados. A interação da vacina com os receptores imunes (TLRs) também foi avaliada através da realização de análise de docking. Descobriu-se que o peptídeo da vacina tem a maior afinidade para o TLR-2, seguido pelo TLR-5, embora tenha sido capaz de se ligar a outros TLRs em menor grau. A interação com TLRs é essencial para induzir imunidade protetora, uma vez que estudos anteriores envolvendo modelos animais documentaram que diferentes espécies de Leishmania ou seus componentes antigênicos interagem com vários TLRs levando a uma intensa resposta imune em hospedeiros desafiados. Para atender aos requisitos para expressão satisfatória da proteína vacinal recombinante no sistema hospedeiro de E. coli (K12), a otimização de códons foi realizada aplicando a ferramenta JCat que ajustou o conteúdo de CAI e GC da sequência, tornando-a adequada para expressão em E. coli. A clonagem in silico também foi realizada utilizando o vetor de expressão baseado em plasmídeo pET28a(+) para mostrar a viabilidade da sequência para clonagem e superexpressão para alcançar maior produção de proteína de vacina recombinante. A previsão da estrutura secundária do mRNA codificado pela sequência do gene quimérico foi feita para mostrar a estabilidade da conformação dobrada do mRNA que influenciará o processo de tradução eficiente no hospedeiro bacteriano. Mutações estabilizadoras foram criadas pela adição de novas ligações dissulfeto na proteína da vacina, uma vez que contribuiriam para a força da proteína nativa, tornando-a passível de explorações bioquímicas, imunológicas e biotecnológicas adicionais.

Fig. 9 Simulação imunológica baseada em servidor C-immsim. a Geração total de antígeno e respectivo anticorpo, b perfil de produção de citocinas, c e d geração de células T auxiliares e contagem total de linfócitos T citotóxicos (ativos e em repouso), e resposta de células B após administração da vacina

Fig. 10 Simulação dinâmica molecular. a A deformabilidade da cadeia principal indicada pelas dobradiças, b NMA gerou fator B mostrando estabilidade da proteína, c autovalor para deformar a estrutura do complexo de docking, d individual (roxo)% da variância e cumulativa (verde) da estrutura, e matriz de covariância correlacionada (vermelho), não correlacionado (branco) ou anticorrelacionado (azul) entre pares de átomos, f modelo de rede elástica mostrando molas conectadas entre pares do átomo, cinza mais escuro indica molas rígidas e vice-versa

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Conclusão

No presente trabalho, exploramos uma abordagem de vacinologia reversa para o desenho in silico de uma vacina peptídica polivalente de múltiplas subunidades contra a leishmaniose humana (tanto visceral quanto cutânea) que pode ser capaz de conferir proteção heteróloga contra parasitas comuns de Leishmania que infectam humanos e, portanto, pode ser considerado de natureza de amplo espectro. O mesmo poderia ser utilizado para um programa geral de vacinação para controlar e erradicar a doença como estratégia complementar juntamente com os agentes quimioterápicos actualmente disponíveis. Além disso, usamos IL-12 como adjuvante natural em vez de qualquer peptídeo sintético não humanizado. Usar IL-12 como adjuvante aumentará a imunogenicidade da vacina sem causar quaisquer efeitos colaterais adversos no corpo hospedeiro. Desde que o péptido da vacina seja composto por uma variedade de péptidos altamente conservados e potencialmente imunogénicos obtidos de cinco espécies de Leishmania patogénica, é útil induzir uma imunidade cruzada em indivíduos vacinados, tendo assim também vantagens terapêuticas e profilácticas. Várias análises imunoinformáticas rigorosas utilizando diversas ferramentas computacionais concluíram que a vacina proposta é imunogênica, estável e reprodutível como uma proteína recombinante e segura para testes em humanos. No entanto, a validação experimental ainda precisa ser realizada para garantir a obtenção adequada de imunidade protetora e duradoura e descartar a toxicidade.

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