Projeto in silico de uma vacina quimérica multiepítopo promíscua contra Mycobacterium Tuberculosis Parte 2

 2.15. Visão geral do desenho da vacina multiepítopo

A Fig. 1 resumiu o conceito geral deste projeto de vacina multiepítopo. Resumidamente, analisamos a antigenicidade de proteínas de M. tuberculosis obtidas do IEDB e selecionamos oito candidatos antigênicos para a construção de vacinas multiepítopos, considerando sua classificação funcional e localização subcelular. Em seguida, previmos os epítopos antigênicos dessas oito proteínas e selecionamos 15 epítopos CTL, 16 epítopos HTL e 10 epítopos de células B, que foram posteriormente ligados ao adjuvante HBHA e PADRE por meio de ligantes adequados. Além disso, previmos a antigenicidade, alergenicidade, propriedades físico-químicas e perfil imunogênico da vacina multiepítopo projetada. Enquanto isso, também previmos as estruturas secundárias e terciárias da vacina e analisamos sua potencial interação com o receptor imune TLR4.

Mycobacterium tuberculosis é um patógeno comum que causa a tuberculose. A proteína do Mycobacterium tuberculosis é um dos principais componentes do Mycobacterium tuberculosis, que é muito crítico para a função do sistema imunológico humano.

A proteína Mycobacterium tuberculosis pode ativar o sistema imunológico humano e aumentar a imunidade do corpo. Quando o corpo é infectado pelo Mycobacterium tuberculosis, o sistema imunológico humano produz uma série de respostas imunes, incluindo a ativação e proliferação de células T específicas e células B. Essas células podem liberar uma variedade de fatores imunológicos, como interferon, interleucina, etc., bem como anticorpos para ajudar o corpo a resistir à invasão do Mycobacterium tuberculosis.

Além disso, a proteína Mycobacterium tuberculosis também pode regular o equilíbrio do sistema imunológico e evitar danos imunológicos causados ​​pela ativação excessiva da resposta imune do corpo. Nos últimos anos, a pesquisa e o desenvolvimento de vacinas contra a tuberculose também se concentraram principalmente na aplicação da proteína Mycobacterium tuberculosis, que pode aumentar a imunidade do sistema imunológico humano por meio da vacinação e prevenir efetivamente a ocorrência e disseminação da tuberculose.

Portanto, a proteína do Mycobacterium tuberculosis é muito importante para o efeito da imunidade humana. Ao fortalecer ativamente o sistema imunológico, por meio de exercícios adequados e nutrição razoável, você pode prevenir melhor a tuberculose e outras doenças infecciosas e manter uma boa saúde. Desse ponto de vista, precisamos melhorar nossa imunidade. Cistanche pode melhorar significativamente a imunidade porque os polissacarídeos na carne podem regular a resposta imune do sistema imunológico humano, melhorar a capacidade de estresse das células imunes e aumentar a imunidade das células imunes. Efeito bactericida.

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3. Resultados

3.1. Recuperação de proteínas de M. tuberculosis para construção de vacina multiepítopo

Para construir uma vacina multiepítopo contra a tuberculose, primeiro analisamos a antigenicidade das proteínas em M. tuberculosis H37Rv. Um total de 492 proteínas com propriedades imunológicas validadas foram obtidas do banco de dados IEDB, das quais 402 proteínas (81,70 por cento) foram consideradas antigênicas. Para a caracterização funcional dessas 492 proteínas, 353 foram enriquecidas no banco de dados DAVID, enquanto 139 não foram. A análise de localização mostrou que 97 das 353 proteínas enriquecidas estavam localizadas no compartimento extracelular, o espaço fora da superfície celular. As proteínas localizadas no compartimento extracelular incluem proteínas da membrana externa e proteínas secretadas.

Dentre as 97 proteínas, 49 são proteínas de secreção. O enriquecimento adicional de 49 proteínas secretadas revelou que cinco proteínas foram secretadas para o espaço extracelular e cinco foram necessárias para a patogênese (validado experimentalmente por BioCyc) [48]. Além disso, quando essas dez proteínas foram alinhadas com as proteínas totais de H. sapiens, duas proteínas (Mpt83 e Mpt70) foram altamente semelhantes às proteínas de H. sapiens. Portanto, as oito proteínas restantes não semelhantes às proteínas do H. sapiens (Tabela 1) foram consideradas candidatas finais para a construção de uma vacina multiepítopo.

3.2. Previsão de epítopos de células T e células B de proteínas candidatas

Antes da previsão do epítopo, os peptídeos de sinal foram identificados e excluídos das proteínas candidatas. Um total de 623 epítopos CTL de oito proteínas candidatas com 135 ligantes fortes (16 de A1, 40 de A2, 22 de A3, 19 de A24 e 38 de supertipos B7 de MHC classe I) foram previstos pelo NetMHCpan{{12} }.1 servidor (Fig. 2A, B). Entre os 135 ligantes fortes, 36 eram antigênicos e imunogênicos. Finalmente, selecionamos 15 dos 36 epítopos CTL de acordo com os seguintes critérios: três epítopos por supertipo e pelo menos um por proteína candidata (Nota: EsxA não tinha um ligante forte que fosse antigênico e imunogênico) (Tabela 2).

Além disso, previmos seus epítopos HTL (epítopos MHC classe II). {{0}}mer epítopos de quatro alelos (HLA_DRB, HLA_DP, HLA_DQ e H-2-I) com um classificação percentual Menor ou igual a 2.0 foram considerados ligantes fortes e classificados da pontuação mais baixa para a mais alta. Os alelos HLA-DR tiveram o maior número de ligantes MHC II (2990), enquanto o HLA-DP teve o menor (601) (Fig. 2C, D). Deve-se notar que a resposta imune em distúrbios granulomatosos, como tuberculose, hanseníase e sarcoidose, é dominada por células T-helper-1 (Th1) produtoras de IFN [97]. Além disso, relatórios anteriores revelaram que a expressão de citocinas Th1 (IFN- e IL2) diminuiu em pacientes com tuberculose [98]. Portanto, para estimular células Th1, previmos peptídeos indutores de 15-mer IFN- -dessas proteínas. Um total de 534 epítopos com atividade indutora de IFN foi previsto usando NetMHCIIpan 4.0, dos quais 315 epítopos são antigênicos. Destes 315 epítopos, 103 mostraram forte atividade de ligação a pelo menos um alelo HLA.

Além disso, o polimorfismo nos alelos HLA resulta em variação alélica, levando a especificidades de ligação de peptídeos amplamente distintas [55]. Como resultado, selecionamos um epítopo com a atividade de ligação mais forte (o epítopo mais promíscuo) de cada uma das oito proteínas candidatas. Além disso, os 95 epítopos restantes foram classificados com base na força de ligação e, em seguida, foram selecionados oito epítopos adicionais, com um máximo de dois epítopos por proteína candidata. Finalmente, selecionamos 16 dos 103 epítopos HTL de acordo com os seguintes critérios: pelo menos um epítopo e no máximo três epítopos por proteína candidata, atividade de ligação mais forte por proteína candidata e mais antigênica e indutora de IFN. Em seguida, nós os usamos para construir esta vacina multiepítopo (Tabela 2).

Quanto à predição linear de epítopos de células B, dois servidores (BepiPred2.0 e ABCpred) foram usados ​​e 166 epítopos foram obtidos. Prevemos a antigenicidade dos cinco principais epítopos para cada proteína e, em seguida, selecionamos dez epítopos antigênicos (16-mer, pelo menos um de cada proteína candidata) (Tabela 2).

3.3. Construção de vacina multiepítopo

Para a construção de vacina multiepítopo, epítopos HBHA, PADRE, 16 HTL (15-mer), 15 CTL e 10 células B lineares (16-mer) foram conectados por meio de ligadores apropriados e seguidos por um His Marcação × 6 (Fig. 3). Os adjuvantes são componentes importantes das vacinas que podem aumentar as respostas imunes inatas e adaptativas [99]. Muitas proteínas de M. tuberculosis têm propriedades adjuvantes e foram usadas para projetar vacinas [17,27,87,100–105]. Um dos mais amplamente utilizados é o HBHA [100–105], que é um potente imunoestimulante que induz a maturação das células dendríticas (DCs) por meio do processamento de TLR4 [105,106]. Descobriu-se que DCs tratadas com HBHA ativam células T virgens, polarizam células T CD4 plus e CD8 plus para secretar IFN e induzem citotoxicidade mediada por células T [47].

Neste estudo, colocamos o HBHA como um adjuvante de proteína no terminal N porque é adequado para iniciar a síntese da construção da vacina a partir do HBHA, uma proteína de ocorrência natural. O HBHA foi previamente colocado no terminal N de algumas vacinas multiepítopos como um adjuvante [105,107]. Além dos adjuvantes, o PADRE, que é seguro para humanos, pode aumentar significativamente a imunogenicidade da vacina porque se liga com alta afinidade a múltiplos alelos MHC-II de camundongos e humanos com alta afinidade para induzir respostas mediadas por células Th [47,62]. HBHA e PADRE foram conectados por um linker PEAK helicoidal, que fornece rigidez enquanto separa os dois componentes da proteína para aumentar a eficiência e reduzir a interferência. Além disso, uma ponte salina Glu-Lys formada dentro dos segmentos estabilizou o ligante.

Como o PADRE pode aumentar a atividade dos epítopos HTL da vacina [54], colocamos os 16 epítopos HTL após o PADRE. O ligante GPGPG foi usado para ligar os epítopos HTL uns aos outros e ao PADRE, uma vez que facilita a progressão das células imunes e a apresentação dos epítopos [108,109]. Além disso, o GPGPG induz a resposta imune HTL, que pode interromper a imunogenicidade juncional e restaurar a imunogenicidade de epítopos individuais após o processamento [108].

Para os 15 epítopos CTL, o epítopo individual foi unido por um ligante AAY, que ajuda o epítopo a produzir locais adequados para se ligar ao transportador TAP e melhorar a apresentação do epítopo [47]. Além disso, toda a subunidade do epítopo CTL foi ligada aos epítopos HTL upstream por meio do linker HEYGAEALERAG que possui cinco locais de clivagem apropriados (A7-L8, A5-E6, Y3-G4, R 10-A11 e L8-E9) essenciais para os sistemas de degradação eucariótica proteassômica e lisossômica. Em eucariotos, proteassomas e lisossomos são a maquinaria proteolítica mais importante, que utiliza o sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) e a via de autofagia, respectivamente [110].

O linker HEYGAEALERAG também foi usado para ligar a subunidade do epítopo CTL aos 10 epítopos de células B lineares a jusante ligados entre si por ligantes KK. De acordo com estudos anteriores, o ligante KK impede a indução de anticorpos na sequência de aminoácidos resultante da combinação dos dois peptídeos, facilitando assim a apresentação específica de cada peptídeo ao anticorpo [111]. Finalmente, uma etiqueta His× 6 foi anexada ao terminal C do último epítopo linear da célula B para subsequente purificação e caracterização da vacina (Fig. 3).

A proteína quimérica final consiste em 933 resíduos de aminoácidos, começando com o adjuvante HBHA, seguido por 41 epítopos e terminando com uma etiqueta His× 6 (Fig. 3). Uma vez que esta proteína quimérica é composta por antígenos multiepítopos de oito proteínas, nós a denominamos MTBV8, a Vacina Multiepítopo para TB derivada de 8 proteínas candidatas.

3.4. Análise da antigenicidade, alergenicidade e parâmetros físico-químicos do MTBV8

Estudos anteriores demonstraram que a antigenicidade é necessária para vacinas humanas para provocar respostas imunes humorais, levando à geração de células de memória direcionadas contra epítopos de agentes infecciosos [112]. Portanto, previmos a antigenicidade da vacina multiepítopo MTBV8 usando o servidor VaxiJen 2.0 e obtivemos uma antigenicidade de 0.97, que é significativamente maior do que o valor limite ({{7} }.4) [45,46] para uma proteína bacteriana ser considerada antigênica. Notavelmente, o MTBV8 foi mais antigênico do que todas as proteínas componentes (Fig. 4), sugerindo que poderia efetivamente estimular respostas imunes do hospedeiro

Além disso, foi relatado que muitas macromoléculas microbianas têm o potencial de induzir reações de hipersensibilidade em humanos [113]. Para analisar o problema de hipersensibilidade do MTBV8 e das oito proteínas constituintes, previmos sua alergenicidade usando o servidor AllerTOP 2.0. Duas das oito proteínas componentes (LprA e EspC) foram previstas como alérgenos (Tabela 1). Deve-se notar que, embora a vacina multiepítopo projetada (MTBV8) contivesse dez epítopos obtidos a partir dessas duas proteínas, previa-se que não fosse alérgica, indicando que essa vacina é segura.

Para caracterizar ainda mais o MTBV8, analisamos suas propriedades físico-químicas por meio do servidor ExPASy ProtParam. A proteína recombinante tem peso molecular de 94,84 kDa e ponto isoelétrico de 8,91. Além disso, a proteína foi considerada estável com um índice de instabilidade calculado (II) de 26,44 (proteínas com índice de instabilidade > 40 foram consideradas instáveis) [64]. A meia-vida estimada in vitro é de 30 h em reticulócitos de mamíferos, mais longa que in vivo de 20 h em leveduras e in vivo de 10 h em E. coli. Além disso, o índice alifático de MTBV8 foi de 71,91 e o valor médio geral de hidrofilicidade (GRAVY) foi de - 0,32, indicando que a proteína recombinante era hidrofílica. Finalmente, o valor de solubilidade proporcional para MTBV8 (0,54) foi maior que a média para o conjunto de dados da população (0,45), indicando que a vacina candidata era mais solúvel do que metade das proteínas de E. coli [114]. Os resultados acima indicaram que o MTBV8 tem boas propriedades físicas e químicas e é adequado para uso como vacina.

3.5. Perfil imunogênico do MTBV8

Para avaliar o perfil de imunogenicidade do MTBV8, analisamos as respostas imunes in silico por meio do servidor imunológico C-IMMSIM. Conforme mostrado na Fig. 5A, os títulos de IgM e IgG1 aumentaram substancialmente após estimulação imune secundária por MTBV8. Além disso, o nível de células B ativas aumentou e permaneceu em um nível alto após cada imunização (Fig. 5B). Mesmo para as células B no plasma, os isotipos B IgM e IgG1 permaneceram altos após a imunização (Fig. Complementar 1A, B). Quanto ao efeito nas células T, os níveis de células Th de memória (y2) (Fig. 1C suplementar) e células Th ativas (Fig. 5C) aumentaram rapidamente após a imunização primária e foram significativamente aumentados após a imunização secundária. Células T reguladoras (principalmente células ativas) foram estimuladas após a imunização inicial e depois diminuíram rapidamente (Fig. 1D complementar). Curiosamente, o nível de células T citotóxicas ativas (Tc) aumentou rapidamente após a imunização primária, permaneceu alto na segunda imunização e depois diminuiu de forma constante, enquanto as células Tc em repouso mostraram a tendência inversa às células Tc ativas (Fig. 5D). Em contraste, os níveis de células Tc anérgicas (y2) (Fig. 5D) e células Tc de memória (Fig. 1E suplementar) permaneceram inalterados após a imunização. Além disso, deve-se notar que os níveis dos fatores imunes IFN- e IL-2 secretados pelas células T que são críticos para a resposta imune contra M. tuberculosis [115] também aumentaram significativamente após a imunização MTBV8 (Fig. 5E).

Além disso, previmos o efeito da vacinação com MTBV8 em populações de células imunes inatas (Fig. 5F e Fig. 1FH suplementar). Células apresentando -2 em DCs e macrófagos aumentaram rapidamente após a primeira imunização, enquanto apenas um pequeno aumento foi observado após a segunda imunização (Fig. 5F e Fig. Complementar. 1G). Além disso, em macrófagos, a primeira imunização resultou em aumento ou diminuição simultânea de macrófagos ativos e em repouso. Algumas semanas após a segunda imunização, os macrófagos ativos diminuíram rapidamente enquanto os macrófagos em repouso aumentaram rapidamente. (Fig. 1G suplementar). Notavelmente, as células assassinas naturais e as populações de células epiteliais ativas exibiram um padrão bastante constante após a imunização. (Fig. Complementar. 1F, H). Tomados em conjunto, essas previsões sugeriram que o MTBV8 pode estimular de forma potente as respostas imunes inata e adaptativa, tornando-o um candidato a vacina potencialmente eficaz.

3.6. Estruturas secundárias e terciárias previstas de MTBV8

Para melhor caracterizar o MTBV8, previmos suas estruturas secundárias e terciárias, seguidas do refinamento de sua estrutura terciária. A estrutura secundária do MTBV8 consistia em 42,12% de hélices, 11,79% de fios e 46,09% de bobinas (Fig. 2 complementar). De acordo com as previsões do DISOPRED3, 27,11% dos resíduos de aminoácidos estavam desordenados.

A estrutura terciária do MTBV8 foi prevista pelo servidor I-TASSER e foram obtidos 5 modelos com bons escores C. O C-score está entre −5.0 e 2.0 e é proporcional à confiabilidade da previsão. Esses modelos foram submetidos à análise ProSA-web e o modelo 4 foi selecionado devido às seguintes características; Pontuação C=−3,8, pontuação Z=−4,4. A análise do gráfico de Ramachandran dessa estrutura terciária mostrou que menos de 70,0 por cento dos resíduos estavam em regiões preferenciais, portanto, é necessário um maior refinamento da estrutura terciária.

A estrutura terciária obtida pelo I-TASSER foi refinada pelo servidor ModRefiner, seguido pelo servidor GalaxyRefine para gerar cinco modelos. Entre os cinco modelos refinados, o modelo 2 apresentou a melhor estrutura ao considerar os seguintes parâmetros: teste de distância global alta precisão (0.89), RMSD (0.58), MolProbity (2.31), confronto pontuação (14,8), pontuação pobre do rotamer ({{10}},80) e pontuação do gráfico de Ramachandran (86,5 por cento) (Fig. 6A). A análise do gráfico de Ramachandran dessa estrutura usando o PROCHECK revelou que dos 753 resíduos não glicina, não prolina e não terminal, 78,9% deles estavam na região mais favorável [A, B, L], 17,3% estavam na região região adicionalmente permitida [a, b, l, p], e 1,5% na região geralmente permitida [∼a, ∼b, ∼l, ∼p], com apenas 2,4% na região não permitida (Fig. 6B). Ao analisar o gráfico de Ramachandran da estrutura refinada usando Molprobity, descobrimos que 86,5 por cento dos resíduos de aminoácidos estavam localizados na região favorável, que era a mesma obtida pelo servidor GalaxyRefine (Fig. 6C) . Além disso, 98,0 por cento dos resíduos estavam na região permitida, enquanto 19 resíduos eram valores discrepantes (phi, psi) (Fig. 6C). Embora o modelo refinado tenha mais resíduos na região favorecida em comparação com o modelo gerado pelo I-TASSER, ele precisa de validação adicional.

A validação do modelo é uma etapa fundamental no processo de construção do modelo, pois pode identificar possíveis erros em modelos 3D previstos [116]. Para validar o modelo refinado de MTBV8, análises ProSA-web e ERRAT foram realizadas. A análise ProSA-web mostrou um Z-score de - 5,76 para MTBV8 (Fig. 6D), que estava ligeiramente fora do intervalo determinado experimentalmente de pontuações para proteínas de tamanho semelhante. No entanto, a análise ERRAT mostrou um fator de qualidade geral de 70,94 para MTBV8 refinado. Como uma pontuação ERRAT maior que 50 representa um modelo de boa qualidade [117], uma pontuação de 70,94 indica que temos alta confiança na estrutura modelada para análise subsequente.

3.7. Docking molecular de MTBV8 com receptores de células imunes

A forte afinidade das vacinas pelos receptores das células imunes produz uma resposta imune estável [118]. Para obter informações sobre as interações potenciais entre MTBV8 e receptores de células imunes, realizamos ancoragem molecular entre MTBV8 e o receptor imune TLR4 (Fig. 7A e B). Estudos anteriores mostraram que ligantes de TLR4 podem ativar DCs, que por sua vez ativam células T virgens, polarizam efetivamente células T (células CD4+ e CD8+) para secretar IFN e induzir citotoxicidade mediada por células T [106]. Esses processos levariam a um aumento no pool de células de memória efetoras [119]. Uma vez que a interação de TLR4 com peptídeos antigênicos leva a respostas contra a infecção por TB, focamos nas interações entre MTBV8 e TLR4 (Fig. 7A). Os resultados de ancoragem molecular de Firedock mostraram que o modelo refinado mais favorecido tinha energia global de − 40,28, uma energia atrativa de van der Waals (aVdW) de − 19.86, energia repulsiva (vermelha) de 2,19, uma energia de contato atômica de 4,70 e uma contribuição de ligação de hidrogênio (HB) de - 1,03 (Fig. 7B). Além disso, o Prodigy previu energia de ligação entre TLR4 e MTBV8 de - 8,6 kcal/mol. Os resultados acima indicaram que o MTBV8 tem uma forte afinidade com o TLR4, permitindo que ele gere uma resposta imune estável.

3.8. Simulação de dinâmica molecular

A simulação de dinâmica molecular foi usada para analisar o movimento dos átomos na vacina [120]. A deformabilidade da cadeia principal revela até que ponto uma molécula pode se deformar em cada resíduo constituinte. As regiões de alta deformação indicaram a posição da "dobradiça" da cadeia (Fig. 7C), e o fator B experimental foi obtido do banco de dados PDB correspondente enquanto o cálculo foi realizado multiplicando a mobilidade NMA por 8pi ^ 2 (Fig. 7D ). O autovalor atribuído a cada modo normal é uma medida de rigidez de movimento, que está diretamente relacionada à energia de deformação de toda a estrutura. O autovalor é diretamente proporcional à facilidade de deformação (Fig. 7E). A variância de cada modo normal é inversamente proporcional ao autovalor. As variações individuais são coloridas em marrom, enquanto as variações cumulativas são coloridas em verde) (Fig. 7F). Na matriz de covariância, há acoplamento entre pares de resíduos, e movimentos correlacionados (vermelho), não correlacionados (branco) e anticorrelacionados (azul) foram exibidos (Fig. 7G). A rede de elasticidade representava pares de átomos conectados por molas, e cada ponto representava uma mola entre pares correspondentes de átomos. A cor dos pontos significava sua rigidez; pontos cinzas mais escuros ilustram molas mais rígidas e vice-versa (Fig. 7H). Simulações de dinâmica molecular usando o servidor iMODS sugeriram que o complexo de encaixe entre MTBV8 e TLR4 era estável.

3.9. Otimização in silico e clonagem de MTBV8

A síntese de proteínas é um pré-requisito para sua atividade [121]. De acordo com isso, o aumento da eficiência transcricional e translacional da vacina é necessário para sua superexpressão em células de E. coli por meio de um plasmídeo autorreplicante pET28a(plus) [103]. A sua optimização foi conseguida pelo Codon Adaptation Index (CAI) de 0,99, e um teor de GC (54,81 por cento ) entre 30 por cento e 70 por cento , que são geralmente considerados favoráveis ​​para a expressão da proteína no hospedeiro. O fragmento de DNA de mtbv8 pode ser clonado em um vetor pET-28a( plus ) entre os locais de restrição NcoI e XhoI usando o SnapGene para gerar um plasmídeo recombinante pET-28a ( plus )-mtbv8 (Fig complementar .3).

4. Discussão

4.1. O surgimento de vacinas multiepítopos contra a tuberculose

A vacinação é a forma mais confiável de combater a infecção por tuberculose. Por muitos anos, os cientistas identificaram várias vacinas candidatas promissoras que poderiam substituir a BCG, a única vacina aprovada contra a tuberculose [8100,122–125]. Recentemente, as vacinas recombinantes contra a tuberculose receberam atenção crescente. Várias vacinas recombinantes demonstraram eficácia em ensaios pré-clínicos e clínicos, incluindo a ID93/GLA-SE, composta por quatro vacinas candidatas Rv2608 (família PE/PPE), Rv1813 (expressa sob estresse/hipóxia), ESXV e ESXW, que são promissoras em ensaio pré-clínico em camundongos [122]. Para ensaios clínicos, GamTBvac, obtido pela fusão de Ag85a e ESAT6-CFP10, foi bem-sucedido em ensaios de fase I [125], enquanto M72, consistindo de dois candidatos [Mtb39A (PPE18) e Mtb32A], rendeu potência significativa na fase II tentativas [123].

Ensaios bem-sucedidos dessas vacinas recombinantes indicam a maior potência das vacinas baseadas em epítopos que simplesmente incorporam as propriedades imunológicas de diferentes proteínas candidatas em uma proteína sintética [124]. Notavelmente, várias vacinas de subunidade de TB foram derivadas de um grande número de vacinas candidatas e surgiram como candidatas potencialmente atraentes em estudos de modelos animais [100]. Por exemplo, o MP3RT, um candidato a vacina de TB de peptídeo multiepítopo que consiste em seis peptídeos HTL imunogênicos, induziu níveis significativamente mais altos de linfócitos T IFN- e CD3 mais IFN-plus e unidades formadoras de colônias (CFUs) inferiores no pulmão e no baço de camundongos humanizados do que camundongos de tipo selvagem [8]. No futuro, a pesquisa de maior potência dessas vacinas levou a um enriquecimento de potenciais candidatos a proteínas.

Além disso, as proteínas secretadas pelo M. tuberculosis também foram consideradas no desenho do MTBV8 (Tabela 1), porque são importantes para a patogênese e virulência da TB [126]. Além disso, algumas proteínas secretadas das camadas externas das células de M. tuberculosis podem servir como antígenos úteis. Por exemplo, EsxA e EsxB foram purificados da cápsula de M. tuberculosis [127] e a retenção de EsxA na cápsula foi implicada na citotoxicidade [128]. Além disso, o EsxA é necessário para a integridade da parede celular bacteriana [129]. No geral, as proteínas secretadas têm superfícies suficientemente expostas para serem alvos das respostas imunes do hospedeiro [130,131].

4.2. Estimulação potencial do sistema imune inato por MTBV8

A triagem de um epítopo em proteínas candidatas envolve a ativação do sistema imune inato seguida pelo reconhecimento do antígeno pelos linfócitos porque ambos os fatores são necessários para a ativação subsequente do sistema imune adaptativo [50]. Para a resposta inata, a formação de um complexo estável entre MTBV8 (auxiliado pelo estimulador de TLR4 HBHA como adjuvante) e TLR4 de DCs (Fig. 5F) é importante porque ligantes de TLR4 podem ativar DCs e DCs ativadas podem, por sua vez, ativar células T virgens, efetivamente polarizam as células T CD4 plus e CD8 plus para secretar IFN- e induzem a citotoxicidade mediada por células T [106] e subsequentemente aumento do pool de células de memória efetoras [119].

Este complexo provavelmente contribuiu para o aumento da população de células de memória (y2) em linfócitos B (Fig. 1A complementar) e linfócitos Th (Fig. 1C complementar) em comparação com células sem memória. A estimulação imune pelo MTBV8 é comparável à obtida com outras vacinas multiepítopos contra a tuberculose [33,37,39] e outras doenças [27,62,107,124,132]. Isso sugeriu a consistência do mecanismo da vacina multiepítopo.

4.3. Estimulação potencial do sistema imune adaptativo por MTBV8

Os linfócitos B e T são as células efetoras primárias que coordenam as respostas imunes adaptativas através da imunidade humoral ou mediada por células, reconhecendo partes de patógenos invasores, referidos como antígenos [50]. Para induzir uma resposta imune adaptativa humoral, incorporamos epítopos de células B de alta pontuação (Tabela 2) para reconhecimento e destruição por anticorpos expressos e secretados por linfócitos B [50,133]. A estimulação vacinal de linfócitos B ativos (Fig. 5B), principalmente células B secretoras de IgM e IgG1- (Fig. 1A complementar), pode resultar em secreção excessiva de IgM e IgG1 (Fig. 5A).

A alta antigenicidade da vacina (Fig. 4) pode ter implicações importantes para aumentar as respostas de anticorpos (Fig. 5A). De fato, as respostas imunes mediadas por células são altamente dependentes da capacidade das células T de reconhecer antígenos [134]. Para conseguir isso, selecionamos epítopos CTL e HTL antigênicos e fortes de ligação ao MHC (Tabela 2), que aumentaram a estabilidade do peptídeo: complexo MHC (pMHC), que é o fator chave que controla a imunogenicidade do peptídeo MHC [135] e desempenha um papel na o priming de células T CD8 plus e CD4 plus por DCs, levando a respostas de linfócitos T (Fig. 5C, Suplementar Fig. 1C) [136].

A incorporação de ligantes apropriados e oligopeptídeos sintéticos (PADRE e HEYGAEALERAG) e o posicionamento preciso de cada componente podem facilitar a apresentação e processamento de epítopos (Fig. 3). Devido à variação de alelos entre humanos, selecionamos epítopos CTL com base no reconhecimento de alelos MHC-I das principais raças humanas.

4.4. As perspectivas de desenvolvimento do MTBV8

Este desenho de vacina in silico é um indicador relevante nas fases de triagem em termos de síntese e eficácia de vacinas candidatas. Para síntese, nossas previsões revelaram que ela pode ser sintetizada no sistema E. coli, no entanto, outros sistemas como células de insetos e mamíferos também podem ser considerados se os sistemas baseados em E. coli apresentarem dificuldades. A validação em laboratório úmido é a próxima etapa na confirmação de vacinas candidatas após estudos in silico. Na verdade, esse método foi usado com eficácia em algumas vacinas candidatas, que também foram projetadas primeiro in silico e depois se mostraram eficazes na fase experimental [137].

5. Conclusão

Um apoio fundamental do Objetivo de Desenvolvimento Sustentável da OMS para a erradicação completa da tuberculose é o acesso a uma vacina potente para prevenir a infecção por M. tuberculosis. Estudos anteriores mostraram que as vacinas quiméricas de múltiplos epítopos podem explorar as propriedades imunológicas/antigênicas de certas proteínas para aumentar a eficácia imunológica. Neste estudo, usamos uma abordagem in silico para projetar uma vacina quimérica (MTBV8) integrando 41 epítopos promíscuos derivados de oito proteínas antigênicas secretadas por M. tuberculosis H37Rv. O MTBV8 foi previsto como estável, solúvel, seguro, altamente antigênico e imunogênico.

A análise imunoinformática mostrou que o MTBV8 exibiu boa afinidade para o principal receptor de células imunes TLR4. É importante ressaltar que a estimulação da vacinação de MTBV8 pode aumentar significativamente os níveis de células B, células T e populações de células imunes inatas e estimular a produção de imunoglobulinas (IgG1, IgM, etc.), bem como fatores imunológicos (IFN-, IL{{6 }}, etc). Em conjunto, a vacina multiepítopo MTBV8 é um indicador relevante na fase de concepção de vacinas anti-TB e pode tornar-se uma pedra angular potencial na realização da 'estratégia Fim da TB'.

Declaração de contribuição de autoria de crédito

Binda T. Andongma: Conceituação, Metodologia, Software, Redação – rascunho original. Yazheng Huang: curadoria de dados, software. Fang Chen: Software, Visualização. Qing Tang: curadoria de dados, análise formal. Min Yang: Software, Visualização. Shan-Ho Chou: Redação – revisão e edição. Xinfeng Li: Conceituação, Metodologia, Software, Aquisição de Financiamento. Jin He: Supervisão, Redação – revisão e edição, Aquisição de financiamento.

Declaração de Interesse Concorrente

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam parecer influenciar o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela National Natural Science Foundation of China (32200026, 31900057), pelos fundos abertos do State Key Laboratory of Agricultural Microbiology (AMLKF202108) e pela China Postdoctoral Science Foundation (2019M662654).

Apêndice A. Informações de suporte

Dados complementares associados a este artigo podem ser encontrados na versão online em doi:10.1016/j.csbj.2023.01.019.

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