Fatores imunomodulatórios em Cistanche Salsa

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Shinjiro MARUYAMA", Koji YAMADA, Hirofumi TACHIBANA

Salsa cistanche(C.A.Mever) G.Beck, Orobanchaceae é uma planta parasitária que é usada como um tônico medicinal oriental no Japão. Em nosso estudo anterior, descobrimos que c, extrato de salsa melhorou a produção de IgM e IgG em linfócitos de nódulo ivmph humano. Além disso, c, dialise de salsa (CSD) preparado usando uma membrana de diálise com um a3.500-Da peso molecular cortado produção de IgM na linha de células B humana BALL-1; além disso, induziu a proliferação de células leves. No entanto, em contraste, o CSD induziu a inibição do crescimento acompanhada de apoptose na linha de células linfoma humanas de Burkitt, Namalwa. Esses resultados indicam a possível presença de constituintes ativos no CSD específicos aos linfócitos, até agora, as propriedades químicas desses constituintes não foram elucidadas. Neste estudo, foram investigadas as propriedades químicas dos constituintes ativos em CSD. Ambas as atividades acima mencionadas nas linhas de células B não foram inativadas pelo tratamento autoclave de CSD. Utilizando cromatografia da coluna de filtragem de gel, descobrimos que os picos das frações ativas estavam concentrados em diferentes frações. Nossos resultados sugerem que existem pelo menos 2 tipos de constituintes ativos em CSD, e eles podem ser polissacarídeos, uma vez que são constituintes solúveis em água de alto peso molecular e termostable.

Keywords: Salsa cistanche, alto peso molecular, IgM, inibição do crescimento.

Introdução

Salsa cistanche(C.A. Meyer) G.Beck, Orobanchaceae é uma planta parasitária que é usada como um tônico medicinal oriental no Japão. Na China, esta planta é um importante medicamento tradicional usado para o tratamento da deficiência renal e neurasthenia. Através de estudos in vitro, já relatamos os efeitos da C. salsa no sistema imunológico. Primeiro. demonstramos que o extrato de C. salsa melhorou a produção de IgM e IgG em linfócitos linfáticos humanos. Em segundo lugar, mostramos que c. salsa dialise (CSD) preparado usando uma diálise de corte de peso molecular de 3.500 da mem-brane melhorou a produção de IgM na linha de células B humanas BALL-1; além disso, induziu a proliferação celular em pequena medida.2Further more, O CSD tem um efeito oposto pelo qual induz a inibição do crescimento acompanhada de apoptose na linha celular de Burkitt humano, Namalwa.3)Esses achados sugerem que esse efeito do CSD estava relacionado à ativação de células B, enquanto a apoptose resultou da falta de outros sinais que são necessários para a diferenciação de células B, como citocinas e contato celular;; no entanto, as propriedades químicas do CSD não foram elucidadas em nenhum dos estudos anteriores. Por isso, neste estudo, foram investigadas as propriedades químicas dos constituintes ativos em CSD.

Materiais e Métodos

O CSD foi preparado pelo mesmo método em nosso estudo anterior. O CSD foi dissolvido em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) a 20 mg/ml. A solução preparada (0,8 ml) foi passada através de um filtro(0,22 um)antes da aplicação e, em seguida, eluvada com a mesma solução através de colunas contendo TOYOPEARL HW-40F(1.0×96,5 cm; Tosoh Corp, Japão),TOYOPEARL HW-55F (1.0 × 98,0 cm; Tosoh Corp., Japão) e Sephacryl S-400HR (1.0×98,0 cm; GE Healthcare UK Ltd.,. Inglaterra); e 1 ml (30 gotas) frações foram então coletadas. Para determinar o volume vazio dos géis e o peso molecular aproximado (MW) dos constituintes fracionados, dextran azul (BD)(Sigma-Aldrich Japan K.K., Japão); e dextrans de MW conhecidos obtidos de Leuconostoc spp.(Sigma-Aldrich Japan K.K., Japão), ou seja, de MW2.000kDa(D1),500kDa(D2),70 kDa (D3)e 6 kDa (D4); e cyanocobalamina (VB12, MW:1355.4)(Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japão) foram utilizadas. O teor total de açúcar e proteína de cada fração foi determinado utilizando-se o método de ácido fenol-sulfúrico e o método Lowry com o kit de ensaio de proteínas de ácidos bicinchonínicos PIERCETM (BCA) (Thermo Fisher Scientific Inc., EUA), respectivamente. A glicemia e a gânbio bovino foram utilizadas como respectivos padrões. Além disso, foi medida a absorvância de 320nm (A:2o)de cada fração. Os picos de eluição do dextran azul e da cianocobalamina foram determinados pelo seu valor de absorção em 260 nm, e os picos de dextrans de MW conhecidos foram determinados utilizando-se o método de ácido fenol-sulfúrico. O CSD foi autoclavado a 120°C por 20 minutos para avaliar sua termoestabilidade. Em bioensadias, a cultura celular e a medição do IGM foram feitas pelo mesmo método em nosso estudo anterior.

Extrato de salsa cistanche

Resultados e Discussão

A Figura 1 mostra os cromogramas da coluna de filtragem de gel de CSD em HW-40F. A partir da Figura la, estima-se que os MW dos constituintes ativos sejam superiores a 6 kDa com base no marcador D4 do Dextran. Além disso, ambas as atividades de CSD, ou seja, melhorar a produção de IgM e induzir a inibição do crescimento, não foram inativadas pelo tratamento autoclave (Figura 2), embora alguns constituintes tenham se somado e perdido após a aprovação do DSC através do filtro 0,22-um. Os padrões de elução do CSD e do CSD autoclaved foram quase idênticos, no entanto, a atividade relativa de aumentar a produção de IgM no CSD autoclavado foi menor do que o CSD não tratado. Algumas das razões parecem que os agregados mantiveram os constituintes ativos ou alguns dos constituintes ativos foram inativados. Os resultados da cromatografia em HW-55F mostraram a possível presença de 2 tipos de fatores imunomodulatórios: o primeiro, concentrado em fr. no.32. era um constituinte ativo de alto peso molecular (HCS) que poderia melhorar a produção de IgM, enquanto o segundo, concentrado em fr. no.50, era um constituinte ativo de peso molecular médio (MCS) que poderia inibir a proliferação celular (Figura 3). No entanto, os picos obtidos tanto para o HCS quanto para o MCS (fr.no.32 e 50, respectivamente), não foram tão acentuados quanto os dos dextranss de MW (dados não apresentados). Essas observações indicam a possibilidade de haver subprodutos gerados artificialmente durante a preparação da DSC, polímeros de constituintes ativos que são facilmente destruídos e compreendem múltiplas unidades, ou vários constituintes ativos que possuem diferentes MWs originais. Os padrões de elução nos cromatógrafos mostram que não é fácil obter constituintes puros de HCS e MCS, uma vez que parecem haver vários constituintes que têm MWs ligeiramente diferentes como mencionado acima. Embora ambos sejam misturas de constituintes ativos, parece que o HCS compreende constituintes de MW superiores a 70 kDa, enquanto o MCS compreende os de MW superiores a 6 kDa. O HCS foi elucido em HW-55F em uma fração que estava além da faixa de separação. Em Sephacryl-S400.a parte do HCS (fr.no.36) foi elucidada na mesma fração do marcador D1, que é de MW 2.000 kDa (Figura 4). Em geral, polissacarídeos e proteínas são levados em conta como constituintes de MW elevados solúveis em água em extratos vegetais. Como quase todas as proteínas funcionais são inativadas pelo tratamento térmico, parecem ser polissacarídeos. No entanto, Park et. al. relataram a pequena proteína citotóxica termotável chamada viscotoxina, que é preparada a partir de visco (álbum Viscum L., Viscaceae)extrato.4Furthermore, viscotoxinas têm sido demonstradas para aumentar a atividade imunomodulatória das células assassinas naturais humanas.5In Figura 3, o MCS, que tem um MW mais baixo, mostra maior teor de proteína. Considerando esses fatos, o MCS pode ser polissacarídeo 8or ligado à proteína pode ser uma proteína termoestável como as viscotoxinas. Esses resultados mostram que os dois constituintes ativos podem ser polissacarídeos. Caso contrário, o MCS pode ser proteínas termostáveis.

Referências

1) Deng, M., Zhao, J.Y., Ju, X.D., Tu, P.F, Jiang, Y., Li, Z.B.: Efeito protetor da tubuloside B na Apoptose induzida por alfa da TNF em células neuronais. Acta Pharmacol. Sin.,25, 1276-1284,2004.

2) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H.:Extrato de salsa cistanchemelhor produção de IgM na linha celular B humana, BALL-1.J. Trad. Med., 24.209-211.2007.

3) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H:Salsa cistancheextrato induziu apoptose na linha celular de linfoma humano de Burkitt Namalwa. Trad. Med.,25,24-27.2008.

4) Estacione. JH,Hyun, C.K., Shin H.K: Efeitos citotóxicos dos componentes no visco tratado pelo calor (álbum viscum). Cancer Let, 139, 207-213,1999.

5) Tabasco, J., Pont, F, Fournic, J.J, Vercellone, A.: As viscotoxinas mistletoe aumentam a citotoxicidade mediada por células assassinas naturais. Eur.J. Biochem.,269,2591-2600, 2002.

6) Fisher, M., Yang, L.X.: Efeitos anticancerígenos e mecanismos de poli sacarida-K (PSK): implicações da imunoterapia do câncer. Res anticancerígenos.,22.1737-1754.2002.

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