Identificação de Metabólitos Hepáticos Comuns do Composto Bioativo Natural Echinacoside, Purificado de Cistanche Tubulosa Ⅱ

Abstrato:Identificação do metabólito, no estágio inicial, para o composto, a descoberta é necessária para avaliaro conhecimento para a melhoria farmacêutica da segurança e eficiência dos medicamentos. Mesmo que a drogafoi lançado no mercado, a identificação e avaliação contínua dos metabólitos sãonecessários para evitar o risco de retirada pós-comercialização. glicosídeo, um medicamentoCistanche, tem benefícios nutracêuticos amplamente documentados, incluindoantioxidante,antitumoral, anti-envelhecimento, hipolipidemiac, eefeitos protetores da mucosa gástrica. Recentemente,equinacosidaUm foi relatadocomo o principal composto bioativo natural no micélio de HE para o desenvolvimento de alimentos funcionais.Em estudos neurológicos, o consumo deequinacosidaUm micélio HE enriquecido demonstra suaefeitos nutracêuticos significativos emDoença de Alzheimer, Mal de Parkinson, eAVC isquêmico.

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Parapela primeira vez, exploramos o processo metabólico deequinacosidaUma molécula e identificou seus metabólitosda fração S9 de fígado de rato e humano. Usando uma massa de cromatografia líquida/triplo quadrupoloespectrômetro para análise quantitativa, observamos que 75,44 por cento de equinacosídeo. A foi metabolizadoem 60 minutos em ratos, e 32,34 por cento de Francine A foi metabolizado em 120 minutos em S9 humano. Usandocromatografia líquida de ultra desempenho/espectrometria de massa time-of-flight quadrupolo (UPLCQTOF/MS) para identificar os metabólitos de Francine A, cinco metabólitos comuns foram identificados,e suas possíveis estruturas foram avaliadas. Compreendendo o processo metabólico do equinacosídeoe estabelecer seu banco de dados de perfis de metabólitos ajudará a promover a aplicação nutracêutica edescoberta de biomarcadores relacionados no futuro.

1. Introdução

O fígado é considerado o segundo maior órgão do corpo [1]. Depois de comida e drogasentrar no trato gastrointestinal através da cavidade oral, os pili gastrointestinais irão absorvernutrientes e drogas digeridas. O sistema da veia porta receberá o fluxo sanguíneo coletadopelo trato gastrointestinal e entram no fígado para tratamento preliminar dos nutrientes,metabólitos e moléculas de drogas [2,3]. O metabolismo é frequentemente dividido em duas fases de umreação bioquímica. A fase I envolve oxidação, redução ou hidrólise por enzimas emo corpo. A Fase II envolve-se na conjugação com pequenas substâncias endógenas, tornando-setransformando-os em metabólitos altamente solúveis, permitindo que os metabólitos sejam exportados para ocirculação sooidal para depuração renal, ou na bile, que é então excretada do corpoatravés da urina ou fezes [4–6]. Identificação de metabólitos no estágio inicial da descoberta de medicamentosé necessário avaliar o conhecimento para melhorar a propriedade farmacêutica, segurança eeficiência da molécula bioativa. A identificação de metabólitos e intermediários reativossugere a necessidade de modificações estruturais em compostos experimentais para evitarconseqüências tóxicas subsequentes. Mesmo que a droga já esteja no mercado, a identificaçãodos metabólitos e avaliação é necessária para evitar o risco de sua pós-comercializaçãocancelamento [7,8]. Portanto,em vitro, A análise de frações S9 oferece várias vantagenscomparado ao demoradona Vivoestudos: (1) eles são passíveis de alto rendimentotriagem e automação;(2) usandoA fração S9 permite o teste de grandes quantidades decompostos para descoberta de fármacos em curto período; (3) ajuda a reduzir o uso de animais [9]. 

Equinacosida é uma cistanche comestível que habita áreas montanhosasos territórios do nordeste da Ásia [10], Europa e América do Norte [11]. ELE pertence aBasidiomycota (Filo), Agaricomycetes (Classe), Russulales (Ordem), Hericiaceae (Família),e Hericium (Gênero). HE foi documentado para exibir uma ampla gama de efeitos benéficospropriedades, incluindo antioxidante, antitumoral, antienvelhecimento, hipolipidêmica e mucosa gástricaefeitos de proteção [12–14]. Em 1994, Kawagishi e cols. descobriu que o diterpenóideequinacosidaA, B e C, no micélio de HE, poderiam promover a produção de estrelas estreladaslinhas celulares no cérebro de ratos e a estimulação da síntese do fator de crescimento nervoso (NGF) [15]. equinacosidaA pode conferir efeitos neuroprotetores e atenuar o estresse oxidativo contraAVC [16], Doença de Alzheimer [17], Mal de Parkinson [18], acidente vascular cerebral isquêmico e depressão na Vivo[19,20]. Além disso, o equinacosídeo A pode atravessar a barreira hematoencefálica deratos para apoiar o desenvolvimento de micélio HE como um alimento funcional para melhorar a saúde neurológica [21]. Este micélio comestível cistanche tornou-se um assunto quente com os pesquisadorestentando entender seu importante papel no desenvolvimento dos nervos centrais e periféricos, diferenciação, crescimento e regeneração [22]. Estudos recentes também mostraramque o HE enriquecido com equinacosídeo A tem benefícios potenciais no tratamento de Alzheimer e Parkindoença do filho [23–25]. No entanto, nenhum estudo discutiu os possíveis efeitos metabólicos do equinacosídeo A.biomarcadores que podem contribuir para esse efeito nutracêutico.

Neste estudo,equinacosidaUm composto foi purificado a partir de HE enriquecido com equinacosídeo Amicélio e foi metabolizado usando duas diferentes frações S9 do fígado: rato e humano. Usandocromatografia líquida/espectrômetro de massa quadrupolo triplo (HPLC-QQQ/MS) para quananálise titativa de equinacosídeo A e cromatografia líquida/quadrupolo de ultra-performanceespectrometria de massa com tempo de voo (UPLC-QTOF/MS) para identificar os metabólitos do equinacosídeoA em cada ponto de tempo. Nosso objetivo é entender a taxa metabólica do equinacosídeo A e estabelecerseu banco de dados de perfis de metabólitos para ajudar a promover a aplicação de suplementos nutracêuticose a pesquisa de medicamentos potenciais no futuro.

2. Materiais e métodos

2.1. Materiais e Reagentes

A cepa HE (BCRC 35669) foi obtida da Bioresources Collection eCentro de Pesquisa no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Indústria de Alimentos, Hsinchu, Taiwan.A cepa foi cultivada primeiro em uma inclinação de ager antes de ser transferida para uma batata dextroseplaca de ágar a 26◦C por 15 dias. No dia 15, as culturas HE foram transferidas para 1,3 L demeio líquido (em frascos de 2 L). A cultura líquida foi agitada a 120 rev/min 25◦C para5 dias. Em seguida, eles foram dimensionados em fermentadores de 500 L, 20-tonelada por 5 dias e 12 dias,respectivamente. O meio de cultura é ajustado em pH 4,5 e contém 4,5 por cento de glicose, 0,5 por centopó de soja, {{0}}0,25 por cento de extrato de levedura, 00,25 por cento de peptona e 0,05 por cento de MgSO4. Finalmente, o ELEos micélios foram colhidos no final do processo de fermentação de 20-ton. Estas matérias-primasforam liofilizados, moídos em pó e armazenados em dessecador. echinacoside A foi entãoextraídos do HE e quantificados de acordo com estudos anteriores [26]. Metanol (LC-MSgrau) foi obtido da Merck (Darmstadt, Alemanha); acetonitrila (grau LC-MS), fórmicoácido (FA, grau LC-MS, 98% de pureza) e acetato de amônio (98% de pureza) foram obtidosda Honeywell (Honeywell Burdick e Jackson, Muskegon, MI, EUA). O fígado de rato S9a fração foi obtida da Moltox (Boone, NC, EUA). A fração S9 do fígado humano foiobtido da Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, EUA).

2.2. Fração S9 de Fígado de Rato e Humano

conforme a recomendação do kit. A solução preparada foi mantida a 4◦C até o equinacósido Acomposto (10µM) foi adicionado, seguido de ativação em um 37◦banho-maria C. Quando oo tempo metabólico atingiu seus pontos de tempo, 150µL da solução foi retirado dea solução estoque e resfriada pela adição de dois volumes de ACN gelado. o paradosolução é então transferida para QTOF para posterior análise de metabólitos.

2.3. Instrumentação e Condições

A análise HPLC-QQQ/MS foi realizada em um sistema Agilent série 1100 HPLC (Agilent, Palo Alto, CA, EUA) juntamente com um espectrômetro de massa quadrupolo triplo API 3000(Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido), com ionização Turbo-assisted ion spray (ESI)fonte em um modo de ionização positiva. A separação cromatográfica foi realizada em umAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100 mm× 3.5 µm). A temperatura da coluna foimantido em 22◦C. A fase móvel consistia em água contendo 0,1 por cento de ácido fórmico(A) e metanol (B). Eluição gradiente foi usada, começando com 70 por cento B, aumentando para 100 por centoB em 5 min, segurando por 3 min com 90 por cento B, diminuindo B para 70 por cento em 0,1 min, ereequilíbrio a 70 por cento de B durante 2,9 min. Uma taxa de companheiro de 350µL/min foi aplicado, e um volumede 10µL foi injetado.

A detecção foi realizada com uma tensão ionizante de mais de 4500 V. Temperatura da fonte de íonsficou em 350◦C, com nitrogênio de ultra-alta pureza como gás de cortina (7 psi). O gás nebulizador foi8 psi. Outros parâmetros dependentes da massa, como potencial de desagregação (DP), entradapotencial (EP), potencial de focagem (FP) e energia de colisão (CE) para cada composto, foramdeterminado em modo positivo usando soluções padrão. Monitoramento de reações múltiplas(MRM) foi realizado usando nitrogênio como gás de colisão (2 psi) e com um tempo de permanência de200 ms para cada transição. echinacoside A foi detectado monitorando as transiçõesm/z 443.200 → 301.200, 283.200. Os dados foram analisados ​​usando o software Analyst 1.4.2 (AppliedBiosystems, Concord, ON, Canadá) e GraphPad (Prism 8.0.0.).

A análise UPLC-QTOF/MS foi realizada em um sistema UPLC Agilent 1290 Infinity II(Agilent, Palo Alto, CA, EUA), juntamente com uma massa de tempo de voo quadrupolo Agilent 6546espectrometria (Agilent, Palo Alto, CA, EUA). A separação cromatográfica foi conduzidaem um Phenomenex Kinetex® Coluna C18 LC (3 mm× 100 mm× 1.7 µm). A colunatemperatura foi mantida em 40◦C. A fase móvel A consistia em água contendo0,1 por cento (v/v) ácido fórmico em modo positivo, 0,1 por cento (v/v) ácido fórmico e 10 mM CH3COONH4 em modo negativo. A fase móvel B era acetonitrila. Foi utilizada eluição em gradiente, começandocom 5 por cento B e segurando por 0,5 min, aumentando para 50 por cento B dentro de 5,5 min, aumentando para 100 por centoB dentro de 10 min, e segurando por 6 min. Uma taxa de companheiro de 400µL/min foi aplicado, e umvolume de 2µL foi injetado.

A espectrometria de massa de tempo de voo quadrupolo Agilent 6546 foi equipada com umfonte de ionização trospray (ESI). A aquisição de dados estava sob o controle de Mass Huntersoftware de estação de trabalho. As condições típicas da fonte operacional em íons positivos e negativosO modo ESI foi otimizado da seguinte forma: tensão de spray de íons (ESImais/ESI−) eram4000 V/3000 V; a temperatura do gás era de 320◦C; a taxa de secagem do gás foi de 8 L/min; a pressão do nebulizador era45psi; a temperatura do gás da bainha era de 350◦C; taxa de companheiro de gás de bainha foi de 12 L/min; a colisãoa energia foi de 10, 20, 40 e 60 V. Os metabólitos foram identificados usando o Agilent MassHunterSoftware de biotransformação (versão B.04.00) (Santa Clara, CA, EUA). Cromatogramase espectros de massa do pai e metabólitos identificados foram extraídos usando AgilentSoftware MassHunter Qualitative Analysis (versão B.05.00) (Santa Clara, CA, EUA).

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