Expressão de Alfa Defensina 5 Humana no Rim Humano e no Trato Urinário

Para mais informações: ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer e outros

Abstrato

Fundo:Os mecanismos que mantêm a esterilidade no trato urinário não são completamente compreendidos. Estudos recentes têm implicado a importância dos peptídeos antimicrobianos (AMP) na proteção do trato urinário contra infecções. Aqui, caracterizamos a expressão e a relevância do AMP humano alfa-defensina 5 (HD5) narime trato urinário em indivíduos normais e infectados.

Metodologia/Conclusões Principais:Usando RNA isolado de humanorim, ureter e tecido da bexiga, realizamos PCR quantitativa em tempo real para mostrar que DEFA5, o gene que codifica HD5, é constitutivamente expresso em todo o trato urinário. Com pielonefrite, a expressão de DEFA5 aumentou significativamente norim. Usando análise de immunoblot, a produção de HD5 também aumentou com pielonefrite. A imunocoloração localizou HD5 no urotélio da bexiga e ureter. No rim, HD5 foi produzido principalmente no néfron distal e túbulos coletores. Usando ensaios de imunotransferência e ELISA, HD5 não foi detectado rotineiramente em amostras de urina humana não infectadas, significando que a produção urinária de HD5 aumentou com infecção do trato urinário por E. coli.

Conclusões/Significação:DEFA5 é expresso em todo o trato urinário em indivíduos não infectados. Especificamente, HD5 é expresso em todo o urotélio do trato urinário inferior e nos túbulos coletores dorim. Com a infecção, a expressão de HD5 aumenta norim, e os níveis tornam-se detectáveis ​​na urina. Até onde sabemos, nossos achados representam os primeiros a quantificar a expressão e a produção de HD5 no rim humano. Além disso, este é o primeiro relato a detectar a presença de HD5 em amostras de urina infectadas. Nossos resultados sugerem que HD5 pode ter um papel importante na manutenção da esterilidade do trato urinário.

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Introdução

O trato urinário, além do meato uretral, geralmente é estéril, apesar da proximidade com a flora fecal. Os mecanismos precisos pelos quais o trato urinário mantém sua esterilidade não são bem compreendidos. Os mecanismos propostos que contribuem para a defesa do trato urinário incluem fluxo urinário, alterações no pH e osmolaridade da urina, esvaziamento regular da bexiga, componentes de defesa química do uroepitélio e desprendimento/influxo epitelial de células imunes efetoras com estimulação bacteriana [1]. Além disso, os peptídeos antimicrobianos (AMPs) demonstraram recentemente ter um papel importante na manutenção da esterilidade do trato urinário [2]. Os AMPs, que servem como antibióticos naturais produzidos por quase todos os organismos, são um componente onipresente do sistema imunológico inato. Os AMPs são moléculas catiônicas expressas por células brancas fagocitárias e células epiteliais. Em humanos e outros mamíferos, as defensinas são uma importante família de AMPs. As defensinas normalmente têm atividade antimicrobiana de amplo espectro contra bactérias gram-positivas e gram-negativas, vírus, fungos e protozoários [2,3]. As defensinas são inicialmente sintetizadas como pré-proproteínas e sofrem processamento para se tornarem peptídeos maduros e biologicamente ativos. Em humanos, as defensinas são classificadas em uma das duas famílias, dependendo de seu padrão de ponte de dissulfeto – as alfa-defensinas ou as beta-defensinas [5].

No trato urinário, as beta-defensinas são amplamente expressas em todo o uroepitélio. Células epiteliais que revestem orimalça de Henle, túbulo distal e ducto coletor expressam constitutivamente a beta-defensina 1 humana (hBD1). Embora os níveis urinários de hBD1 sejam insuficientes para matar bactérias invasoras, hBD1 fornece um revestimento antimicrobiano de ação rápida dos lúmens tubulares e previne a infecção por inibir a ligação bacteriana ao urotélio [6]. Estudos recentes indicam que o estado redox de hBD1 afeta significativamente a potência antimicrobiana, de modo que o peptídeo reduzido é muito mais potente do que a forma oxidada ligada por dissulfeto [7]. O significado disso na superfície urotelial não foi determinado. Outra defensina, a beta-defensina 2 humana (hBD2), não é expressa constitutivamente em tecido renal saudável; no entanto, a expressão de hBD2 é induzida por infecção [8].

Ao contrário das beta-defensinas, o papel das alfa-defensinas derivadas do epitélio não é bem descrito no trato urinário. A expressão e a função das alfa-defensinas HD5 e HD6 foram relatadas principalmente no intestino delgado, onde são secretadas pelas células de Paneth nas criptas intestinais e contribuem para o equilíbrio da microbiota intestinal [9]. A HD5 também foi localizada nos tratos genitais masculino e feminino, com evidências sugerindo que é induzível e importante na erradicação da infecção [10,11,12]. HD5 urinário foi detectado em pacientes que foram submetidos à reconstrução da neobexiga ileal e derivação urinária do conduto ileal, em que a fonte de produção de HD5 foi creditada principalmente às células ileais de Paneth [13,14]. HD5 tem atividade antibacteriana contra bactérias gram-positivas uropatogênicas comuns e bactérias gram-negativas [15]. HD5 também tem atividade antimicrobiana contra vírus uropatogênicos como adenovírus e vírus BK [16,17,18]. Neste estudo, fornecemos a descrição inicial e quantificação da expressão de HD5 no ser humanorime definir ainda sua expressão no trato urinário inferior durante a esterilidade e infecção.

Resultados

DEFA5 mRNA é constitutivamente expresso na bexiga humana, ureter e rim

A PCR quantitativa em tempo real demonstra que todos os testes de bexiga, ureter erimamostras sem infecção expressam DEFA5 constitutivamente. A expressão de DEFA5 foi significativamente maior no trato urinário inferior do que no trato urinário superior (p= 0.014). Na bexiga (n=4), a expressão média de DEFA5 foi de 4,656637 transcritos por 10 ng RNA e no ureter (n=4) a expressão média de DEFA5 foi de 4,1126170 transcritos por 10 ngRNA (Figura 1A) . No rim (n=6), a expressão média de DEFA5 foi de 2.9376274 transcritos por 10 ng de RNA. A expressão de DEFA5 foi analisada separadamente no córtex renal, medula e pelve. A expressão de DEFA5 não variou significativamente por região renal (p= 0.45).

Expressão de DEFA5 e expressão de peptídeo HD5 aumentam com pielonefrite

Análise quantitativa de PCR em tempo real realizada emtecidos renais coma pielonefrite demonstrou um aumento significativo na expressão de DEFA5 em comparação com tecidos renais não infectados. Com pielonefrite (n= 6), a expressão média de DEFA5 aumentou para 7.82961.052 transcritos por 10 ng de RNA (p= 0,019) (Figura 2A).

Para avaliar ainda mais esse aumento na expressão com pielonefrite, realizamos análise de immunoblot no mesmorimtecido usado para análise de PCR em tempo real para avaliar aumentos simultâneos na produção de peptídeo HD5 (Figura 2B, painel do meio). A análise imunoblot, usando anti-soros HD5 policlonais, demonstrou uma produção de peptídeo HD5 significativamente maior em tecidos renais com pielonefrite (n {{5} }) em comparação com não infectadosrimtecidos(n=6). Não infectadorimtecidos expressaram 300625 ng HD5/grama de peso de tecido úmido enquantorimtecido com pielonefrite expressou 600621 ng HD5/grama de peso de tecido úmido (p,0,0001). Os blots foram testados novamente com GAPDH para servir como controle de carregamento (Figura 2B, painel do meio) e uma coloração de prata também foi realizada para confirmar o carregamento de proteína igual (Figura 2B, painel superior).

O peptídeo HD5 é produzido em todo o rim e trato urinário humano

A imunocoloração foi realizada para localizar a produção de HD5 no trato urinário. A imunohistoquímica (IHC) mostrou que a imunorreatividade HD5 estava presente em todo o urotélio do ureter e bexiga de todos os espécimes investigados (n=4, Figura 3). A IHC também mostrou que HD5 foi produzido nos túbulos do córtex renal e medula de todos espécimes (n= 6, Figura 4). A imunofluorescência (IF) demonstrou que a expressão de HD5 foi maior no néfron distal e nos túbulos coletores (Figura 5). O interstício e glomérulos não apresentaram imunorreatividade HD5. A imunocoloração mostrada nas Figuras 3, 4 e 5 foi realizada usando um anticorpo monoclonal de camundongo anti-HD5 (8C8) que reconhece o propeptídeo HD5 (Abcam, Cambridge, MA). Os resultados foram semelhantes ao usar o anticorpo policlonal anti-HD5 de coelho que reconhece o propeptídeo HD5 e o peptídeo maduro (dados não mostrados) – sugerindo que o HD5 é armazenado como um propeptídeo.

Com pielonefrite, a imunocoloração HD5 aumentou acentuadamente. A imunorreatividade HD5 aumentou em todo o néfron proximal, o néfron distal e os túbulos coletores (Figura 4 e Figura 5). Como em espécimes não infectados, os glomérulos e o interstício não apresentaram expressão de HD5 com infecção. Os controles negativos não mostraram imunorreatividade HD5.

A urina humana infectada contém concentrações mensuráveis ​​de peptídeo HD5

A análise de imunotransferência, usando anti-soro policlonal de coelho que detecta o precursor proHD5 e formas processadas posteriormente, identificou níveis mensuráveis ​​de HD5 em 13 das 15 amostras de urina testadas infectadas com E.coli uropatogênica (Figura 6A e B). Quando presentes, os níveis de HD5, normalizados para creatinina urinária, variaram de 299,8–669,7630 ng HD5/mg Cr urinário (110,67 ng/mL–276,67 ng/mL), o que corresponde a 11,10–27,67 nmol/L. Em amostras de urina não infectadas (n=15), HD5 estava no limite de detecção de (,50 ng) ou abaixo dele. Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) nas mesmas amostras de urina, usando o anticorpo monoclonal de camundongo (8C8) que detecta apenas o precursor proHD5, detectou níveis mensuráveis ​​de proHD5 em 13 das 15 amostras infectadas testadas. As concentrações urinárias de proHD5 variaram de 122,78–490,060,03 ng HD5/mg de Cr na urina (30,02 ng/mL–200,5 ng/mL) quando presente (Figura 7).

Discussão

Neste estudo, fornecemos a caracterização inicial de HD5 norim, ureter e bexiga. O HD5 demonstrou ser um AMP importante que previne a infecção invasiva no intestino e é regulado positivamente no trato genital durante a infecção[11,18,19,20,21]. Os AMPs derivados do epitélio, como HD5, demonstraram ser importantes na manutenção da esterilidade no trato urinário [8,22,23,24]. Deficiências nestas defesas mucosas inatas podem resultar em infecção aguda e/ou crônica [25,26].

Nossos resultados quantitativos de PCR em tempo real demonstram que o DEFA5 é constitutivamente expresso no ser humanorins, ureteres e bexiga. A expressão de DEFA5 aumenta do trato urinário superior para o trato urinário inferior – acompanhando o fluxo do jato urinário e a proximidade crescente do ponto de invasão da microbiota. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a quantificar a expressão de DEFA5 no rim e bexiga humanos. Recentemente, Townes et al demonstraram que o ureter distal normal pode expressar DEFA5 [14]. Nossos resultados também sugerem que DEFA5 é constitutivamente expresso pelo ureter distal. Embora a expressão de DEFA5 no trato urinário seja quase 100- vezes menor do que a encontrada em tecidos gastrointestinais, a expressão uroepitelial basal de DEFA5 é comparável à expressão de amplificadores de vias urinárias descritos anteriormente, como catelicidina, hBD-1, hBD -2 e ribonuclease 7[6,8,22,24,27].

Em contraste com o trato gastrointestinal maduro, onde DEFA5 é expresso em altos níveis em ambos os estados de saúde e infecção/inflamação, nossos dados quantitativos de PCR em tempo real demonstram que a expressão de DEFA5 norimé significativamente aumentada com infecção [27,28,29]. Este padrão de expressão induzível é análogo à expressão de DEFA5 no trato reprodutivo feminino, onde a expressão de DEFA5 aumenta com salpingite [30]. No trato urinário, Townes et al mostraram uma tendência de maior expressão ureteral de DEFA5 em pacientes com ITUs submetidos à derivação urinária por conduto ileal [14]

Nossa análise de immunoblot complementa os dados de PCR em tempo real, demonstrando que a produção de peptídeos HD5 aumenta com a pielonefrite. Este padrão induzível de produção de HD5 é semelhante ao observado em alguns membros da família beta-defensina. hBD2 mostra um padrão induzível de produção com infecção do trato urinário e/ou pielonefrite crônica [8,31,32]. A produção do peptídeo HD5 mostrou aumentar no trato genital feminino superior e na uretra masculina com inflamação [11,30].

Usando imunocoloração, demonstramos que HD5 é produzido uniformemente em todo o urotélio do ureter e da bexiga. Como a grande maioria das ITUs resulta da flora fecal que sobe para a bexiga, esses resultados sugerem que a expressão de HD5 está presente em locais onde a exposição microbiana ocorre com mais frequência [33]. Portanto, o HD5 está idealmente posicionado para prevenir uma infecção microbiana ascendente. Norim, HD5 é produzido principalmente no néfron distal e túbulo coletor. Esses achados sugerem que o HD5 é produzido em locais onde será posicionado para ter atividade antimicrobiana ideal. Estudos anteriores mostraram que as propriedades antimicrobianas das defensinas são dependentes da concentração de sal – com concentrações mais altas de sal diminuindo a atividade antimicrobiana [23,34,35]. Especulamos que as baixas concentrações de sal do néfron distal e túbulos coletores fornecem um ambiente favorável para a atividade antimicrobiana HD5.

As análises de imunoblot e ELISA também demonstram que HD5 é secretado na urina em níveis baixos. Dado o tamanho (8,1 kDa e 3,7 kDa) e a carga positiva de proHD5 e HD5 totalmente processado, é possível que algum peptídeo HD5 urinário seja originado, pelo menos em parte, do filtrado do plasma. No entanto, há pouca evidência sugerindo que HD5 persiste no plasma [27]. Além disso, para aparecer na urina, o HD5 precisaria escapar dos mecanismos eficientes de absorção de peptídeos no túbulo proximal [6,36]. Por fim, as amostras de urina utilizadas foram centrifugadas antes da realização dos ensaios, removendo as fontes celulares de HD5.

Nas concentrações detectadas, é improvável que o HD5 urinário seja diretamente antimicrobiano contra microrganismos uropatogênicos, pois o HD5 totalmente processado tem uma concentração inibitória mínima (CIM) entre 6-10 mg/mL contra bactérias uropatogênicas gram-negativas comuns [15]. No entanto, é provável que as concentrações da superfície da mucosa sejam maiores. Além disso, a análise de immunoblot demonstra que as concentrações de HD5 são significativamente maiores norim. Esses resultados sugerem que o HD5 está envolvido na defesa da mucosa do trato urinário. Um padrão análogo é visto com hBD1, onde as concentrações urinárias de hBD1 são insuficientes para exibir atividade antimicrobiana, mas concentrações mais altas de peptídeos são detectadas perto dos túbulos renais [6,31].

Porque IHC demonstra que proHD5 é uma forma importante de HD5 norime como tanto o maduro quanto o proHD5 são detectados na urina, especulamos que o HD5 é primariamente secretado por uma molécula precursora e então sofre processamento proteolítico para gerar formas maduras – semelhantes aos tratos gastrointestinal e geniturinário [11,30,37]. No intestino delgado, as células de Paneth produzem tripsina, que cliva o propeptídeo HD5 para que o peptídeo totalmente processado seja a forma predominante no lúmen intestinal [37]. Na uretra masculina, as principais enzimas de processamento e ativação para HD5 são proteases de neutrófilos contribuídas por neutrófilos recrutados para o local da infecção [11]. As contribuições do tripsinogênio epitelial, tripsina urinária e/ou proteases de neutrófilos no processamento de HD5 no trato urinário durante a infecção ainda precisam ser determinadas. Além disso, os efeitos das mudanças no ambiente urinário na função HD5 (alterações na osmolaridade, pH e concentrações catiônicas) também precisam ser determinados.

Em conclusão, este é o primeiro estudo a identificar e quantificar a expressão e produção de HD5 no trato urinário. Nossos resultados sugerem que HD5 é um AMP derivado do epitélio que pode desempenhar um papel importante na imunidade inata do uroepitélio humano impedindo a translocação de patógenos invasores para a circulação. A elucidação dos fatores que regulam a produção de HD5 pode fornecer novos insights sobre a patogênese das ITUs em pacientes com risco de ITUs e pacientes com infecções crônicas.

Métodos

Aprovação do estudo

O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes participantes deste estudo. Para indivíduos com menos de 18 anos de idade, foi obtido o consentimento por escrito dos pais/responsáveis. O Conselho de Revisão Institucional do NationwideChildren's Hospital (NCH) aprovou este estudo juntamente com o processo de consentimento e documentos (IRB07-00383).

Tecido Humano e Amostras de Urina

O tecido ureteral distal e vesical não infectado (n= 4) foi obtido de crianças submetidas a reimplante ureteral por outros motivos que não infecção recorrente. Não infectadorimamostras (n=6) foram obtidas de pacientes submetidos a nefrectomia por tumores renais. As amostras de tecido estavam livres de sinais macroscópicos de doença ou inflamação.Rimtecido de pacientes com pielonefrite crônica foi fornecido pela Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Dois patologistas independentes confirmaram o diagnóstico histopatológico de pielonefrite. As amostras de tecido foram congeladas ou preservadas como seções embebidas em parafina e fixadas em formalina neutra. Seções de tecido renal não infectado foram dissecadas em córtex, medula ou pelve renal antes do armazenamento (n=4).

Amostras de urina não infectadas e infectadas foram obtidas de crianças que se apresentaram no pronto-socorro do NCH ou no ambulatório de nefrologia. O diagnóstico de ITU foi feito por uma cultura de urina positiva de acordo com as diretrizes da Academia Americana de Pediatria [39]. Todas as amostras de urina infectadas tinham 0,106 UFC/mL de E.coli. Os valores de pH urinário variaram de 5,5 a 8,5 (média urinária de 6,9). A composição iônica urinária não foi medida. As amostras de urina foram centrifugadas para remover o sedimento de urina e foi adicionado um coquetel de inibidores de protease (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA).

Isolamento de ácido ribonucleico e transcrição reversa

O RNA total foi isolado de tecido congelado usando o Sistema de Isolamento de RNA PromegaTotal (Promega, Madison, WI, EUA). Para síntese de DNA, 4–8 mg de RNA total foram transcritos reversamente com transcriptase reversa Superscript III usando um oligo-(dT)12–18primer de acordo com o protocolo do fornecedor (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).

Clonagem de plasmídeos específicos de genes para curvas padrão

O cDNA que codifica DEFA5 e GAPDH foi clonado em um vetor de plasmídeo 4-Topo (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os plasmídeos foram sequenciados para confirmar que a

construções foram obtidas. Diluições seriadas de plasmídeos específicos de genes foram quantificadas (por absorbância espectrofotométrica a 260 e eletroforese em gel de agarose corada com brometo de etídio) e usadas em PCR em tempo real para gerar curvas padrão para cada reação.

PCR quantitativo em tempo real

A PCR quantitativa em tempo real foi realizada usando cDNA de fita simples de humanosrim, ureter e tecido da bexiga com pares de primers de oligonucleotídeos específicos usando o sistema de PCR em tempo real 7500 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). Os primers de extensão da junção de exon de PCR foram projetados e as sequências foram confirmadas usando DNAstarH Laser Gene SeqBuilder (DEFA5 forward primer : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 e iniciador reverso DEFA5 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).

Resumidamente, o cDNA correspondente a 10 ng de RNA serviu como modelo em uma reação de 25 ml contendo 2,0 mM de cada primer e 16 Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green mix. As condições de PCR foram: desnaturação inicial a 95uC por 10 minutos, seguido de 40 ciclos com cada ciclo consistindo de desnaturação a 94uC por 30 segundos, anelamento a 64uC por 30 segundos e extensão a 72uC por 30 segundos. A emissão de fluorescência ciclo a ciclo foi monitorada a 530 nm e analisada usando 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems). Padrões de plasmídeos específicos de genes foram incluídos em cada conjunto de reações. Como controle positivo, o RNA do íleo terminal foi incluído em cada conjunto de reações e os resultados foram comparados com os padrões publicados anteriormente [27].

Para confirmar a amplificação por PCR do produto pretendido, uma amostra representativa foi analisada por eletroforese em gel de agarose a 1,5%. Os produtos foram visualizados por coloração com brometo de etídio e comparados com padrões de tamanho de DNA para confirmar o tamanho do produto antecipado (não mostrado). Além disso, uma curva de perfil de temperatura de fusão de cada reação de PCR foi determinada ao final de cada reação.

Anticorpos HD5

O propeptídeo HD5 (AA20-94) e as formas parcialmente processadas (AA36-94 e 56-94) foram identificados usando um anticorpo anti-HD5 monoclonal de camundongo (8C8) comercialmente disponível (Abcam). O propeptídeo HD5 e o peptídeo maduro (AA{10}}) foram identificados usando anti-soro policlonal de coelho descrito anteriormente [13,40].

Immunoblot

Seções do mesmorimas amostras usadas para análise quantitativa de PCR em tempo real (3-6 mg de peso úmido) foram pulverizadas usando um almofariz e pilão em nitrogênio líquido e dissolvidas em tampão RIPA com inibidores de protease. As proteínas urinárias foram extraídas de amostras de urina usando o Micro Kit ProteospinTM Urine Protein Concentration (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Canadá). As concentrações de proteína no rim e na urina foram quantificadas usando um ensaio de Bradford modificado e confirmadas usando uma leitura de anOD280 nm. Concentrações iguais de tecido renal ou proteína urinária foram carregadas em géis de gradiente de dodecil sulfato de sódio a 18 por cento e submetidas a eletroforese. Para garantir a carga de proteína igual, uma coloração de prata foi realizada.

Após a separação eletroforética, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Após a fixação com 00,05 por cento de glutaraldeído em TBS, as membranas foram bloqueadas em 5 por cento de leite desnatado por 30 a 60 minutos e incubadas em uma diluição de 1:1,000 de anti-soro policlonal HD5 de coelho durante a noite . Após a lavagem, o anticorpo secundário, IgG anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano de coelho diluído 1:10,000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), foi aplicado por 1 hora em temperatura ambiente. Immunoblots derimos tecidos foram também sondados com anticorpo anti-GAPDH (Sigma Aldrich) durante duas horas à temperatura ambiente e depois incubados com o anticorpo secundário descrito acima. As proteínas foram visualizadas usando um sistema de detecção ECL e filme de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante (BioExpress, Kaysville, UT, EUA).

O HD5 foi quantificado comparando as intensidades de banda resultantes com uma diluição em série da proteína proHD5 padrão recombinante (Peptides International, Louisville, KY, EUA).RimAs concentrações de HD5 foram padronizadas para o peso do tecido úmido. As concentrações urinárias de HD 5 foram divididas pela creatinina urinária para estabelecer proporções padronizadas de HD 5-para creatinina (mg/mg) para levar em conta a diluição da urina. As concentrações de creatinina na urina foram determinadas usando o ensaio de microplaca de creatinina da Oxford Biomedical Research (Rochester Hills, Michigan, EUA).

Imuno-histoquímica

Após a desparafinização, reidratação e recuperação do antígeno, foi realizado um bloqueio de biotina e um bloqueio de proteína livre de soro (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, EUA). As lâminas foram incubadas durante a noite a 4uC com anticorpo monoclonal de camundongo HD5(8C8) (1:2{{10}}0; Abcam) ou anti-soro policlonal de coelho (1:500) seguido por anticorpo biotinilado anti-polivalente adulterado Estreptavidina/HRP (ScyTek Laboratories). Os cortes foram desenvolvidos usando 0,1 por cento de tetracloreto de diaminobenzidina com 0,02 por cento de peróxido de hidrogênio e contrastado com hematoxilina. As seções de controle negativo foram incubadas com soro não imune no lugar do anticorpo HD5.

Imunofluorescência

A imunofluorescência duplamente marcada foi realizada para ajudar a localizar a expressão de HD5 norim. O ducto coletor foi duplamente marcado para células principais com anticorpo policlonal de cabra anti-aquaporina-2 humana (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) [41]. A alça de Henle foi duplamente marcada com anticorpo policlonal anti-uromodulina humana de camundongo (Sigma-Aldrich) e o túbulo proximal foi duplamente marcado com aquaporina policlonal antihumana de cabra -1 (Santa Cruz) [41,42]. Anti-cabra policlonal de burro rodamina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EUA), anti-cabra rodamina (JacksonImmunoResearch Laboratories) e anti-coelho policlonal de burro FITC (Santa Cruz) serviram como anticorpos secundários.

Todas as seções foram preparadas conforme descrito acima. Eles foram incubados com uma mistura de anti-soros de camundongo contra HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulina (1:500), AQP-1 (1:400) em ambiente temperatura por 90 minutos. O anticorpo secundário foi aplicado por 90 minutos em temperatura ambiente e as seções foram montadas utilizando meios de montagem com DAPI. Soro não imune foi usado como controle negativo. As lâminas foram examinadas com microscópio Leica DM4000B e fotografadas digitalmente com câmera/software Spot RT (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, EUA).

ELISA

Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) anticorpo monoclonal de camundongo por 2 horas em temperatura ambiente, estreptavidina-peroxidase de rábano (Biolegend, San Diego CA, EUA) foi adicionado por 30 minutos. Após incubação com solução de substrato TMB por 15 minutos (Kem-En-Tec Diagnostics), a reação foi terminada com solução STOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) e lida em um comprimento de onda de 450 nm. As concentrações de HD5 do ensaio ELISA foram divididas pela creatinina urinária para estabelecer proporções padronizadas de HD5-para creatinina (mg/mg) para levar em conta a diluição da urina conforme descrito acima.

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