Como prevenir e reduzir a formação de pedra nos rins?

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Parte Ⅰ Ⅱ:Eversão de fosfatidilserina regulada por fosfolipídio scramblase ativado pela sinalização TGF‑1/Smad no estágio inicial da formação de cálculos renais

Xiu Guo Gan1 · Hai Tao Xu1 · Zhi Hao Wang

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Introdução

A urolitíase é uma das doenças mais comuns que afetam os seres humanos e está associada a múltiplas complicações urológicas [1]. Oxalato de cálcio (CaOx) supostamente lesa células tubulares renais cultivadas, após o que a fosfatidilserina (PS) da membrana celular se inverte da camada interna para a camada externa in vitro para desempenhar papéis importantes napedra no rimformação [2]. Achados semelhantes foram relatados por vários estudos [3-6] conduzidos em nível celular. No entanto, o mecanismo subjacente à externalização de PS nas células do túbulo renal causado por danos mediados por CaOx permanece obscuro. Estudos anteriores mostraram que uma alta concentração de oxalato de cálcio leva à superprodução de espécies reativas de oxigênio (ROS) [7], que posteriormente contribui para a externalização de PS nas células do túbulo renal para resultar na nucleação e crescimento de cristais de CaOx [8]. ROS e peroxidação lipídica ativam fortemente a fosfolipídio scramblase (PLSCR) [9], enquanto a exposição a ROS scavengers, como glutationa, coenzima Q10 ou idebenona (um homólogo sintético da coenzima Q10), reduz a ativação de PLSCR na doença renal policística [10] . O PLSCR, que está ancorado à membrana celular [11], funciona como uma das três enzimas de inversão de fosfolipídios capazes de catalisar o rápido movimento bidirecional de PS em ambos os lados da membrana ao longo de um gradiente de concentração [12]. Sob condições fisiológicas, a membrana celular está em estado assimétrico e o PLSCR não tem efeito sobre a membrana [13]. No entanto, após a lesão das células eucarióticas, o PLSCR é ativado e move o PS da camada interna para a externa[14,15]. Além disso, a superexpressão de células K1 de ovário de hamster chinês PLSCRin estimula a externalização de PS, aumentando o movimento de PS para a superfície celular durante a apoptose [16]. Portanto, hipotetizamos que o PLSCR também está envolvido na externalização de PS na membrana celular do túbulo renal via ativação de ROS.

Um potencial mecanismo molecular de produção de ROS induzida por oxalato ocorre através da indução da sinalização TGF- 1/Smad, que pode desempenhar um papel na produção de ROS [17,18]. De fato, a sinalização TGF- 1/Smad supostamente está envolvida em uma miríade de doenças renais, como glomerulonefrite, fibrose intersticial renal e nefrolitíase[19]. Além disso, as células mononucleares tratadas com TGF- 1 exibem PSexternalização na membrana celular, causando a inversão de PS da camada interna para a externa [20]. No entanto, até onde sabemos, a relação entre a sinalização TGF- 1/Smad e a Pseversão nas membranas das células dos túbulos renais permanece desconhecida. Nós hipotetizamos que o TGF- 1 participa da eversão do PS nas membranas das células dos túbulos renais, ativando o PLSCR no estágio inicial do ratopedra no rimformação mediada por ROS.

Portanto, investigamos se a sinalização TGF- 1/Smad estimula a externalização de PS através da ativação de ROS e se o TGF ativa PLSCR na membrana celular do túbulo renal durante o estágio inicial depedra no rimdesenvolvimento in vitro e in vivo, estabelecendo assim uma base teórica para a etiologia dapedra no rimformação.

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Materiais e métodos

Modelo de rato de formação de cálculos renais CaOx em estágio inicial

Sessenta ratos Wistar machos limpos de 3-meses de idade pesando 200±20 g foram fornecidos pelo Experimental Animal Center da Harbin Medical University e alojados em temperatura ambiente (22 graus ±2 graus) e 50-70 por cento de umidade. Após 3 dias de reprodução adaptativa, eles foram divididos aleatoriamente em três grupos (20 ratos/grupo) - controle,pedra no rim, epedra no rimmais SB431542 (um TGF- 1/inibidor da via de sinalização Smad).

Pedra no rima formação é iniciada como uma alteração patológica precoce após a lesão das células tubulares renais [21,22]. Para estudar este processo de lesão, um modelo de rato de estágio inicialpedra no rimformação foi estabelecida, pois uma abordagem padronizada ainda não foi relatada. Para observar as alterações precoces após a lesão das células tubulares renais, aplicamos o método relatado por Liet al. [23]. Resumidamente, os ratos do grupo controle receberam 2 mL de água destilada diariamente via gavagem oral, enquanto os ratos do grupopedra no rimgrupo receberam 2 mL de solução de etileno glicol a 1 por cento e solução de NHCl a 1 por cento diariamente por gavagem oral. Os ratos nopedra no rimplus SB431542 foram injetados intraperitonealmente com co-solvente SB431542 (5 mg/kg, S1067; Selleckchem, Xangai, China) a cada 7 dias [24]. Comida e água foram fornecidas ad libitum. No dia 14, os ratos foram eutanasiados por overdose de anestésico (pentobarbital sódico, 200 mg/kg, via injeção intraperitoneal) e seus rins foram excisados. Os rins esquerdos foram preservados imediatamente em nitrogênio líquido para posterior detecção de proteínas. Os rins direitos foram fixados, desidratados e incluídos em parafina. Todos os estudos em animais foram conduzidos de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Uso de Experimentação Animal do First Affiliated Hospital of Harbin Medical University (número de aprovação: 2020005, Harbin, China).

Formação de cristais no tecido renal

As amostras de tecido foram coradas usando o método Pizzolato [23] e os cristais de CaOx foram observados sob um microscópio óptico de luz polarizada (Sinico Optical Instrument Co., Shenzhen, China). As regiões positivas para Pizzolato foram medidas e expressas como idades permill da área total do tecido de seções transversais usando ImageJ 1,49v (National Institutes of Health, EUA).

Detecção de PS na membrana celular tubular renal in vivo por citometria de fluxo

A exposição de PS de células epiteliais renais foi avaliada usando um ensaio de coloração de Anexina V marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC), conforme descrito anteriormente [2]. As células foram observadas (em cada grupo) sob um microscópio confocal a laser (Olympus, Tóquio, Japão). A quantidade de exteriorização de PS foi determinada como a percentagem de células positivas para Anexina V. A fluorescência da anexina V das amostras foi medida usando um citômetro de fluxo (excitação de 488 nm/emissão de 530 nm; Beckman Coulter, Brea, CA, EUA).

Medição dos níveis de TGF- 1 e Smad7 na membrana da célula tubular renal por Western blotting

Após a recuperação das amostras de tecido congelado, a proteína foi extraída usando o kit de extração de proteína de membrana natural ProteoExtract(M-PEK) (MERCK Co., Kenilworth, NJ, EUA), e a concentração de proteína foi determinada usando um ensaio de proteína Bio-Rad kit (Hercules, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Subsequentemente, 40ug de proteína foram carregados em um gel de SDS-poliacrilamida a 8% (gel de empilhamento 100 V, gel de resolução 200 V) por 1 h a uma corrente constante de eletrodo de 300 mA. As proteínas no gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Kexing Co., Pequim, China), bloqueadas por 1 hora a 37 graus em 5 por cento de leite em pó desnatado e incubadas durante a noite a 4 graus C com TGF 1 anti-rato de ovelha ( ab208466; Abcam, Cambridge, Reino Unido) e Smad7 (66.478; Proteintech, Wuhan, China) anticorpos [25]. Anticorpo secundário de coelho anti-ovelha marcado com peroxidase de rábano foi adicionado (1:400; Nakasugi Jinqiao Co., Pequim, China) e incubado a 37 graus por 1 h. O sinal foi detectado usando o reagente de quimioluminescência aprimorado (Abcam). As bandas positivas foram analisadas usando o software de análise de densidade óptica em gel Gel-Pro 4.0 e a densidade óptica cumulativa (valor IOD) foi medida, com o valor R representando o teor relativo de proteína da seguinte forma: R=valor IOD de referência de PLSCR(alvo)/valor IOD de referência de GAPDH (proteína de referência).

Cultura celular e interferência de RNA

Uma linhagem de células epiteliais renais (células MDCK, CCL34, passagens 53-90; ATCC, Manassas, VA, EUA) foi cultivada em meio Eagle modificado por Dulbecco suplementado com antibióticos (10{{1{{14} }}} U/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina; Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e 10 por cento de soro fetal bovino (Life Technologies Co.) a 37 graus em uma atmosfera de 5 por cento de CO e subcultivada com 0,25 por cento tripsina e ácido etilenodiaminotetracético 1 mM (Life Technologies Co., CA, EUA). As células foram tratadas com CaOx (0,5 mM; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, EUA) por 2 h e com 0,5 mM de CaOx e 100 ug/mL de anticorpo anti-TGF- 1 neutralizante （R&D Systems, Minneapolis , MN, EUA) por 2 h. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

Para determinar o papel da eversão de PS de PLSCRin, células epiteliais tubulares renais foram transfectadas com siRNA de PLSCR [26]. O siRNA foi projetado e sintetizado pelo Anhui General Biological System (Anhui, China; consulte a Tabela 1).LipofectamineTM 2000(Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Xangai, China) foi usado para transfecção de acordo com as instruções do fabricante . Após 24 h de transfecção, as células foram digeridas com tripsina, centrifugadas a 1000×g por 5min, lavadas duas vezes com PBS e centrifugadas novamente. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi suspenso em PBS para formar uma suspensão de célula única de densidade 1 × 10 graus células/mL. A taxa positiva de expressão de FAM(carboxifluoresceína) foi de 93 por cento ± 5 por cento, conforme determinado por citometria de fluxo. Para avaliar ainda mais a relação entre TGF 1 e PLSCR, as células foram tratadas com 0,5 mM de CaOx ou 10 ng/mL de TGF- 1 por 2 horas e subsequentemente transfectadas com PLSCR siRNA.

Medição do nível de PLSCR nas membranas das células tubulares renais por Western blotting

A proteína foi extraída usando um kit de extração de proteína de membrana natural ProteoExtract (Chemical Book Co., Pequim, China), e a concentração de proteína foi determinada usando um kit de ensaio de proteína Bio-Rad (Noble-Ryder Co., Pequim, China). Subsequentemente, 40 ug de proteína foram carregados em um gel de SDS-poliacrilamida a 8 por cento (gel de empilhamento 100 V, gel de resolução 200 V) por 1 h a uma corrente constante de 300 mA. As proteínas no gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Kexing Co., Shenzhen, China) e bloqueadas com 5% de leite desnatado por 1 h a 37°C e incubadas durante a noite a 4° com anticorpo monoclonal PLSCR anti-rato de ovelha (1:200, PAB781HuO1; Abcam, Guangzhou, China). Adicionou-se então anticorpo secundário anti-ovelha de coelho marcado com peroxidase de rábano (1:400) e a mistura foi incubada a 37 graus C durante 1 h. Após a lavagem da membrana, o sinal foi detectado com um reagente de quimioluminescência aprimorado (Abcam, Guang-zhou, China). As bandas positivas foram analisadas usando o software de análise de densidade óptica Gel-Pro 4.0gel e o valor de IOD foi medido, com o valor R representando o teor relativo de proteína conforme descrito acima.

Tabela 1 sequências de siRNA para PLSCR

Medição da distribuição de fosfatidilserina na membrana

A quantidade de eversão de PS da membrana celular foi determinada usando o método de extinção de fluorescência descrito por Kim et al.[27] e nossa equipe de pesquisa [2], com nitrobenzeno-2-oxa-1,3-diazol(NBD, Shanghai, China) como sonda de fluorescência. Após marcação do PS na camada externa da membrana celular com NBD, as células foram cultivadas em PBS contendo diisopropilfluorofosfato 5 mM. Depois disso, PBS contendo oxalato de cálcio (1.0 mM) foi adicionado e as células foram incubadas a 37 graus. Uma quantidade igual de suspensão de células foi descarregada a cada 10 minutos e a intensidade de fluorescência foi registrada usando um espectrofluorômetro de RF{10}} (Shimadzu, Kyoto, Japão). As configurações do espectrofluorômetro foram as seguintes: largura da fenda de 10 nm para um comprimento de onda de emissão de 530 nm; e largura de fenda de 5 nm para um comprimento de onda de excitação de 470 nm. Em seguida, o valor médio de fluorescência (FT) foi registrado ao longo dos 50s. A intensidade de fluorescência reduzida média (FD) também foi registrada após o uso de uma solução de ditionito para extinguir a fluorescência de NBD da camada externa da célula. Depois disso, 1 por cento (p/v)Triton X-100 foi adicionado para permeabilizar a membrana celular. A fluorescência NBD da camada interna da membrana celular foi então extinta e a intensidade de fluorescência (FO) foi registrada. A porcentagem de NBD-PS nos lóbulos internos foi calculada posteriormente usando a seguinte equação: porcentagem-idade de NBD-PS internalizado=100×[(FD-FO)/(FT-FO)].

A porcentagem de externalização do PS foi determinada de acordo com o princípio utilizado para a medida da internalização do NBD-PS. A porcentagem de NBD-PS nos lóbulos externos também foi calculada usando a seguinte equação: porcentagem de NBD-PS nos lóbulos externos=100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

Análise estatística

As variáveis ​​contínuas são expressas como média±desvio padrão. Foi utilizado um teste não paramétrico de soma de postos pareado, teste t e teste qui-quadrado. Todas as análises foram realizadas com o software SPSS 19.0(SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA). Resultados com P<0.05 were="" considered="" statistically="">

Resultados

A sinalização TGF- 1/Smad estimula a externalização de PS in vivo

Formação de cristais em tecido renal de modelo de rato

Para estabelecer um modelo de rato de estágio inicialpedra no rimformação, etilenoglicol e cloreto de amônio foram administrados ao estômago de ratos por 2 semanas e, em seguida, cada seção de rim foi examinada com um microscópio digital. Nas amostras do grupo controle, estruturas tubulares renais normais foram observadas sem formação de cristais no dia 14 (Fig.1A). Quando o tecido renal dopedra no rimgrupo foi observado por microscopia, os túbulos renais apareceram dilatados com microcristais visíveis; acúmulo ocasional de cristais de CaOx foi observado em alguns túbulos renais, indicando o sucesso do estabelecimento de um modelo de rato de estágio inicialpedra no rimformação e a geração de lesão celular do túbulo renal.

Presença de PS na membrana da célula tubular renal

Anexina V-FITC, uma molécula fluorescente que se liga a PS na superfície celular, é amplamente utilizada para detectar a redistribuição de PS. Em nosso estudo, as células MDCK no controle normal,pedra no rim, epedra no rimplus grupos SB431542 foram observados sob um microscópio confocal a laser (Fig.1B). A taxa de eversão PS aumentou nopedra no rimgrupo comparado com o grupo controle (P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">pedra no rimplus SB431542 apresentaram um nível basal de externalização de PS mais baixo do que os do gruporimpedragrupo (P<0.05, fig.="" 1c,="">

Medição dos níveis de TGF- 1 e Smad7

O nível de TGF- 1 nopedra no rimgrupo foi quantificado por western blotting. Um Western blot típico é mostrado na Fig.2A juntamente com a análise densitométrica do nível de TGF- 1. Os valores foram normalizados aos do controle e expressos como a razão de TGF- 1 para tubulina. A adição de etilenoglicol e NH Cl aumentou significativamente o nível de TGF- 1 e diminuiu o nível de Smad7 em comparação com os das células de controle (Fig.2A); no entanto, o tratamento com SB431542 mais etilenoglicol e NH Called diminuiu significativamente o nível de TGF- 1 e aumentou o nível de Smad7 em comparação com aqueles em células tratadas com etilenoglicol e NH, Cl.

TGF ativa a atividade de PLSCR na membrana da célula do túbulo renal in vitro

PLSCR

O nível de PLSCR foi avaliado por Western blotting. As células foram tratadas com CaOx por 2 h. O nível de PLSCR foi insignificante nas células de controle, mas aumentou significativamente no grupo CaOx (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

Movimento interno NBD-PS prejudicado

Determinamos os movimentos para dentro e para fora do PS na membrana da célula epitelial tubular renal para avaliar a atividade do PLSCR. Para avaliar se PLSCR influencia o movimento de PS do folheto externo para o folheto interno da membrana plasmática, integramos PS marcado fluorescentemente (NBD-PS) no folheto externo da membrana plasmática e monitoramos sua internalização (Fig.3). A quantidade de NBD-PS internalizada pelas células MDCK nos grupos controle e CaOx foi de aproximadamente 46,2 por cento e 17,8 por cento, respectivamente. Assim, a taxa de internalização de PS nas células do grupo CaOx foi significativamente menor do que nas células do grupo controle (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

Fig. 1 A formação de cristais e a externalização de PS foram observadas nos grupos controle, cálculo renal e cálculo renal mais SB431542.

(A) Formação de cristais no tecido renal no dia 14; seta indica estruturas microcristalinas. (B) As células MDCK foram observadas por microscopia confocal a laser.

(C) Gráficos de citometria de fluxo da taxa de eversão. (D) Taxa de eversão ( por cento ). Triângulo indica P<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">pedra no rimgrupo

Movimento para fora NBD-PS aprimorado

Para determinar se o transporte de PS para fora é afetado pelo oxalato, as células MDCK foram marcadas intracelularmente com NBD-PS, e a extensão de seu movimento para o folheto exemplos-mic foi determinada. O meio de incubação continha albumina de soro bovino (1 por cento p/v), que extraiu rapidamente NBD-PS expresso na superfície. Aproximadamente 34,5 por cento do NBD-PS migrou para o folheto externo nas células de controle, enquanto a taxa de transferência de PS para fora nas células do grupo CaOx aumentou para 75,3 por cento em comparação com o total de NBD-PS marcado internamente, que foi significativamente maior do que que nas células do grupo controle (P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

Fig.2 Expressão de TGF- 1/Smad nos grupos controle, cálculo renal e cálculo renal mais SB431542 e expressão de PLSCR na membrana celular do túbulo renal.

(A)TGF- 1/expressão Smad. (B) Níveis relativos de fosfolipídios scramblase (PLSCR) e blot representativo com expressão normalizada para GAPDH.P<>

Triângulo indica P<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

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