Como o extrato de água de Cistanche promove o peristaltismo intestinal e melhora a constipação?

Shuai Yan,1,2 Yin-zi Yue,1 Xiao-peng Wang,1 Hong-li Dong,1 Shu-guang Zhen,1 Ben-sheng Wu,1 e Hai-hua Qian3

A medicina tradicional chinesa foi relatada como tendo bons efeitos no tratamento da constipação funcional. Este trabalho tentou provar os efeitos dos extratos aquosos de HerbaCistanche(AEHC) no tratamento com STC e determinar os possíveis mecanismos por um modelo de constipação por trânsito lento (STC) induzida por loperamida. A HPLC foi realizada para identificação e confirmação dos componentes bioativos no AEHC. Verificou-se que o AEHC atenuou as respostas do STC com base no aumento da quantidade fecal, teor de umidade e taxa de trânsito intestinal, bem como nos níveis séricos de GAS, MTL, SS e CGRP. Os níveis de proteína e mRNA do c-kit, marcação de células intersticiais de Cajal (ICC), também aumentaram. Enquanto isso, apenas o nível de proteína de SCF, um ligante de ckit, aumentou. A análise de nossos dados sugeriu que o AEHC poderia obviamente melhorar a função do ICC por meio de uma via de sinalização envolvendo PI3K, SCF e c-kit e aumentar os índices de motilidade colônica, como GAS, MTL, SS e CGRP. É interessante notar que o AEHC parece ser eficaz na constipação, portanto, mais experimentos são necessários para esclarecer os mecanismos exatos envolvidos.

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acteosídeo em cistanche têm bons efeitos sobre antioxidante

1. Introdução

A constipação é uma doença gastrointestinal funcional comum e um problema de saúde pública, caracterizada por defecação continuamente difícil, infrequente ou incompleta. A prevalência de constipação varia de 0,7 por cento a 81 por cento em todo o mundo, especialmente em idosos [2, 3]. A constipação por trânsito lento (STC) é uma queixa gastrointestinal comum entre 13 a 37 por cento dos pacientes com constipação crônica resistente ao tratamento [4, 5]. Dados epidemiológicos indicam uma maior incidência de STC entre mulheres jovens do que homens [6]. O STC causa constipação intratável, apresentando pouca resposta ao tratamento conservador e tendência a distúrbios neurodegenerativos. Não tão simples quanto uma doença funcional, requer tratamento invasivo e agressivo [7].

Várias drogas químicas atuais, como laxantes osmóticos ou secretores e agentes de volume, são universalmente usadas para

tratar a constipação [8], embora suas aplicações sejam limitadas devido aos altos gastos e efeitos colaterais abdominais, como dor, cólicas e inchaço [9]. Atualmente, a regulação do trato gastrointestinal é o foco principal das terapias de constipação. A cisaprida foi inicialmente gerada como agente de promoção para o tratamento de doenças gástricas, mas posteriormente foi retirada devido ao risco de arritmias cardíacas [10].

Tegaserode é um antagonista seletivo do receptor de 5-hidroxitriptamina que pode estimular o peristaltismo e a secreção intestinal [11, 12]. A prucaloprida é um novo derivado dihidro benzofurano carboxamida e agonista do receptor 5-HT com alta seletividade e especificidade, que pode aumentar a motilidade gástrica, do intestino delgado e do cólon e funciona mais rapidamente na dinâmica [13-15]. Como um derivado da prostaglandina E1, a lubiprostona pode ativar seletivamente o canal CIC para promover a secreção gastrointestinal e aumentar os efeitos da transmissão intestinal [16].

A motilidade na constipação é um problema generalizado, mas sua etiologia ainda não é clara. No entanto, evidências convincentes demonstraram a contribuição das células intersticiais de Cajal (ICC) na patogênese da constipação [17]. O ICC é encontrado entre as terminações nervosas e as células musculares lisas no trato gastrointestinal. O ICC é geralmente reconhecido como células marca-passo para a atividade gastrointestinal e como mediadores de transmissão neuromuscular [18]. Estudos indicaram que a densidade de CIC no cólon de pacientes com constipação por trânsito lento é notavelmente menor em comparação com pacientes normais [19]. Assim, um número decrescente de ICC pode levar a uma falta de atividade de ondas lentas, afetando assim a resposta contrátil e induzindo atraso no trânsito em pacientes com constipação de trânsito lento. Para este ponto, a melhoria do ICC usando produtos farmacêuticos pode ser crucial para curar a constipação por trânsito lento.

Vários medicamentos fitoterápicos e a fórmula tradicional chinesa Mula recentemente chamaram a atenção como novas terapêuticas para o tratamento da constipação crônica como resultado da produção de fezes melhorada [20, 21]. ErvaCistancheé um fitoterápico tradicional usado no tratamento de doença renal crônica, infertilidade feminina, menorragia profusa e impotência [22, 23]. ErvaCistancheprevine a apoptose do neurônio cerebral expressando fatores relacionados à apoptose e fatores neurotróficos em células MES23.5 [24]. Herba Cistanche também demonstrou potencial farmacêutico no tratamento da Síndrome de Deficiência de Yang-Qi do Rim-Yang. Um estudo recente demonstrou que HerbaCistancheaumenta a respiração mitocondrial e o status antioxidante da glutationa em cardiomiócitos H9c2 [25].

A MTC acredita que a constipação tem uma estreita relação com os rins. Abrindo-se na genitália externa e no ânus, o rim controla a micção e a defecação. O transporte dos resíduos depende da promoção do qi do rim e da nutrição do yin do rim. Se o yang do rim for deficiente ou o fogo da porta da vida se extinguir, a congestão fria do intestino grosso resultará na estagnação dos resíduos. A constipação também é causada pelo movimento intestinal seco, uma vez que a deficiência da essência do rim não gera fluido suficiente [26].

ErvaCistancheé uma erva unificadora comum, que é doce e salgada no sabor e quente na natureza. Atribuível aos meridianos do intestino grosso e do rim, pode tonificar o yang do rim e umedecer o intestino para aliviar a constipação. Esta única erva e suas preparações farmacêuticas chinesas têm sido amplamente utilizadas para tratar a constipação com notável eficácia [27].

Na China, os efeitos da HerbaCistancheraízes na constipação foram registradas [28, 29] e referidas na Matéria Médica Chinesa de Shen Nong como os "caules secos e suculentos daCistancheespécies" [30]; no entanto, a comprovação científica sobre o efeito de HerbaCistancheraízes na constipação não existia até agora, a dose clinicamente eficaz é de 20 g por dia na Farmacopeia Chinesa, e o efeito clínico não aumenta ainda mais com a dosagem.

Desde HerbaCistancheé tão escassa [31], a padronização de sua dosagem clínica para o tratamento do CTS por estudo experimental não só previne a falha do tratamento devido à dosagem inadequada, mas também mantém os pacientes longe de perdas econômicas e até mesmo desventuras de medicação por uso excessivo. Esperamos

os resultados podem estabelecer uma base científica para novos medicamentos para a constipação. Portanto, é importante investigar a solução aquosa de Herbade Cistanchefunção da promoção intestinal e sua ação na CIC no presente estudo.

2. Materiais e métodos

2.1. Preparação de Extrato Aquoso de Herba Cistanche.

Todas as ervasCistancheforam adquiridos de Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co., Ltd. (Nanjing, China), que foram colhidos, coletados e processados ​​seguindo práticas etnobotânicas padrão das plantações na área de Sinkiang, na China. A identidade da planta foi verificada morfologicamente pelo professor Tu Lin Lu da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing, Nanjing, China. Um espécime de comprovante (NUCMCHS-2015628) foi depositado na Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing, Nanjing, China.

Fatias de ervasCistanche, pesando 500 g, foram pulverizados em liquidificador elétrico e extraídos em 5000 ml de água destilada, após o que o extrato aquoso foi purificado a 100 C por 2 h usando um equipamento de extração circulante

poro da membrana (Millipore, Billerica, MA, EUA), e o resíduo obtido dos extratos foi dissolvido em 4000 ml de água. Após a extração por refluxo, os extratos foram coletados e evaporados para obter o produto final da amostra. Os extratos aquosos foram concentrados em pellets secos (1 g/ml) usando um

para uso posterior. Amostras sólidas foram reconstituídas em água destilada para dar as doses necessárias de 10, 20 e 40 mg/kg de peso corporal para o experimento.

2.2. Animais.

O protocolo experimental usado neste estudo foi revisado e aprovado com base em procedimentos éticos e cuidados científicos pelo Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine-Institutional Animal Care and Use Committee, Suzhou, China (SHTCM-IACUC; número de aprovação: PNU{{2} }). Todos os ratos machos (estirpe Sprague Dawley) com ag foram adquiridos do Shanghai Laboratory Animal Research Center de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health. Os animais tiveram livre acesso a uma dieta padrão (AIN-93 M) e água da torneira ad libitum e foram alojados individualmente em aço inoxidável com umidade relativa percentual e expostos a 12 h de luz natural e 12 h de escuro diariamente.

2.3 Desenho Experimental.

A loperamida foi usada para induzir constipação em ratos de acordo com estudos anteriores [32, 33]. Um total de 60 ratos foram divididos aleatoriamente em 5 grupos (por grupo): A: grupo normal (NG), B: grupo modelo (grupo tratado com Lop mais veículo), C: grupo de ratos constipados tratados com baixo extrato aquoso de Herba Cistanche (grupo tratado com Lop mais LAEHC), D: um grupo de ratos constipados tratados com extrato aquoso médio de Herba Cistanche (grupo tratado Lop mais MAEHC) e E: um grupo de ratos constipados tratados com extrato aquoso alto de Herba Cistanche (grupo tratado com Lop mais HAEHC). O grupo A foi tratado com soro fisiológico (10 ml/kg); O grupo B foi tratado com loperamida

(4 mg/kg); O grupo C foi tratado com loperamida (4 mg/kg) e extrato aquoso baixo de Herba Cistanche (1 g/kg); O Grupo D foi tratado com loperamida (4 mg/kg) e extrato aquoso médio de Herba Cistanche (2 g/kg), e o Grupo E foi tratado com loperamida (4 mg/kg) e extrato aquoso alto de Herba Cistanche (4 g/kg). kg). Todos os ratos do grupo normal foram injetados com 0,9 por cento de cloreto de sódio, enquanto os outros foram injetados com loperamida em 0,9 por cento de cloreto de sódio duas vezes ao dia por 3 dias consecutivos para induzir constipação. O extrato aquoso de Herba Cistanche foi suspenso em água e administrado oralmente uma vez ao dia do dia 4 ao dia 18 no Grupo C, Grupo D e Grupo E, enquanto os Grupos A e B receberam um volume consistente de água por gavagem.

2.4. Condição Cromatográfica.

O perfil de HPLC foi realizado no Sistema de Cromatografia Líquida Shimadzu (Tóquio, Japão), consistindo de uma bomba LC-20AT e um

foram monitorados a 330 nm a 30 C. A fase móvel isocrática consistia em metanol 0,1 por cento de ácido fórmico (80: 20, v/v) e funcionou a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min . A separação cromatográfica foi

tamanho de partícula 5 m, Pequim Dikma Science and Technology Co., Ltd., Pequim, China).

2.5. Análise de exercício, ingestão de alimentos, ingestão de água, corpo

Goma arável (uma suspensão aquosa de 20 por cento de carvão e 10 por cento de goma arável) foi administrada oralmente em um volume de 25 ml/kg de cada animal. Após 30 min, os animais foram sacrificados humanamente por deslocamento cervical e dissecados. O intestino delgado do piloro ao ceco foi percorrido e a distância percorrida pela farinha de carvão e o comprimento total do intestino delgado foram medidos. Para um rato individual, a porcentagem de trânsito intestinal foi calculada como a porcentagem da distância percorrida pela farinha de carvão em relação ao comprimento total do intestino delgado. A seguinte equação calcula a taxa de trânsito intestinal ( por cento ): distância percorrida pelo carvão/distância do piloro ao ceco 100 por cento .

2.6. Amostra de Sangue e Coleta de Tecidos. Ao final do período experimental, os ratos foram submetidos a jejum de 12 horas, mas tiveram livre acesso à água. Todos os ratos foram então anestesiados 30 minutos depois por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg) e colocados em uma mesa com temperatura regulada. Amostras de sangue foram coletadas e centrifugadas a 3500 rpm por 15 minutos para obtenção do soro. O cólon foi seccionado imediatamente e lavado com solução salina normal a 4°C e então dividido em dois pedaços. Um fragmento foi fixado em formol a 10 por cento e processado em parafina dividida para posterior análise imuno-histoquímica (IHC), enquanto o outro foi Peso e Cabelo. Alterações no exercício, ingestão de alimentos, água

armazenados a 80 C até serem ensaiados. consumo, peso corporal e cabelo foram observados e registrados diariamente durante todo o período experimental. Observamos "alterações no exercício" seguindo os passos específicos: a caixa de confecção própria (60 cm de altura, 50 cm de comprimento e 80 cm de largura com parede periférica escura) é utilizada para teste de campo aberto; o fundo branco foi dividido em losangos (12 cm) pela linha preta em uma sala escura e silenciosa; uma lâmpada de 100 W pendurada 1 m acima do centro da caixa; os ratos foram colocados no centro da caixa no 4º, 6º, 12º e 18º dias de modelagem. O número de quadrados pelos quais os ratos passaram em 5 minutos foi usado como a pontuação do movimento horizontal e o tempo ereto dos ratos em 5 minutos foi usado como a pontuação do movimento vertical. As pontuações horizontais e de movimento mais as pontuações de movimento vertical indicam a quantidade de exercício dos ratos. Cada rato foi medido uma vez [34, 35].

2.7. Medição de parâmetros fecais.

No último dia da administração oral, pellets de fezes frescas de cada rato SD foram coletados em tubos de fundo redondo com tampa por 6 h, e os pesos totais de cada grupo foram registrados. Para determinar o teor de umidade fecal, utilizou-se uma balança elétrica para secar os pellets de fezes até atingir peso constante e mediu-se o peso seco. O teor de umidade

2.8. Avaliação de GAS, MTL, SS e CGRP.

As concentrações de gastrina (GAS), motilina (MTL), somatostatina (SS) e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) no soro foram estimadas por ELISA usando kits comercialmente disponíveis.

2.9. Análise Histológica.

Cólons transversais coletados de ratos SD foram fixados com formalina a 10 por cento por 12 h, incorporados

m fatias de espessura que foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E, Sigma-Aldrich, MO, EUA). As características morfológicas desses cortes foram observadas sob microscopia de luz, após o que o comprimento das vilosidades, a espessura da cripta e a espessura do músculo foram medidos usando o Leica Application Suite (Leica Microsystems, Suíça).

2.10. Análise imunohistoquímica.

Seguimos os métodos de Zhu et al. (2016) [36]; seções de 5 m não coradas foram

corado com anti-c-kit de coelho (1: 100) a 4 C durante a noite. O anticorpo secundário e o método do complexo avidina-biotina-peroxidase foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. Um controle negativo para imunoglobulina foi usado para eliminar a ligação não específica. Níveis de expressão do c-kit

2.11. Análise da Taxa de Trânsito Intestinal.

A razão de trânsito intestinal foi conduzida de acordo com protocolos previamente relatados [36]; brevemente, após 14 dias de tratamento, todos os ratos SD foram submetidos a 12 h de jejum, mas tiveram livre acesso à água.

Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real. Os níveis de expressão gênica de mRNAs de c-kit, SCF e PI3K no cólon foram determinados usando um kit de extração de RNA total (TIANGEN Biotech,

Pequim, China) de acordo com os protocolos do fabricante. Real-time PCR foi realizado com ABI StepOnePlus Real-Time PCR System (ABI). SYBR Green I Real-Time PCR Master Mix (QPK201, Toyobo, Japão) foi usado para detectar produtos de PCR. As reações foram realizadas em corridas em triplicado. Subsequentemente, tecido fresco de cólon de rato pesando 0,5 g foi homólogo

l) foi extraído de acordo com as instruções do fabricante usando o reagente TRIzol (Invitrogen, EUA). Um kit de transcrição reversa-PCR (Takara Biotechnology Co., Inc.) foi usado para sintetizar a primeira fita de cDNA de acordo com o protocolo do fabricante. Todos os parâmetros alvo são mostrados na Tabela 1. O protocolo de ciclagem foi sob as seguintes condições: 95 C por 5 min (desnaturação do DNA), seguido por 40 ciclos de 95 C por 15 s, 60 C por 20 s e 72 C por 40 s. Uma análise da curva de fusão foi realizada no final dos ciclos de amplificação.

2.12. Análise de Western Blot.

Os teores de proteína de c-kit e SCF em homogeneizados de amostras de cólon foram avaliados por Western blot. Em resumo, as proteínas totais dos homogenatos foram determinadas usando um ensaio de ácido bicinconínico (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA). O gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) foi usado para separar as proteínas no sistema de eletroforese BioRad (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA). As proteínas foram então transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Após 2 h de tratamento com tampão de bloqueio em TBS contendo 5% de leite desnatado à temperatura ambiente, as membranas de PVDF foram incubadas durante a noite com anti-c-kit diluído 1:1000 (Santa Cruz, CA, EUA), anti-c-kit diluído 1:500 SCF (Sigma, MO,

Os EUA) e 1: 8.000 anticorpos anti-actina diluídos (Kangchen, Xangai, China), respectivamente. A ligação do anticorpo primário foi detectada usando o anticorpo secundário conjugado com HRP correspondente (Beyotime, Jiangsu, China). Um kit de quimioluminescência aprimorado (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, EUA) e o Odyssey Infrared Imaging System (Gene Company Ltd., Hong Kong) foram usados ​​para detecção de quimioluminescência. A prolactina de limpeza foi usada como controle de carga. A quantidade de expressão da proteína é apresentada em relação aos níveis de actina.

2.13. Análise Estatística.

Os dados de medição foram relatados como o erro padrão médio da média (SEM) e analisados ​​pelo SPSS

16.0 software (SPSS, Chicago, IL, EUA). A análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida de testes de múltiplas faixas de Duncan foi usada para determinar diferenças significativas em todos os parâmetros. Os valores foram considerados estatisticamente significativos em

3. Resultados

3.1. Composição e Componentes Funcionais da Herba Cistanche.

Conforme mostrado na Figura 1, as raízes da Herba Cistanche contêm altas concentrações de vários componentes bioativos relacionados aos efeitos laxativos. As concentrações de equinacosídeos totais e verbacosídeos totais foram 0,64 mg/ge 0,16 mg/g, respectivamente. Dois picos indicando níveis elevados de echinacoside e verbascoside foram detectados no LP em um tempo de retenção apropriado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

3.2. Observação geral.

Os ratos SP não morreram ao longo do experimento, indicando melhor segurança e operacionalidade do modelo animal. Em comparação com o Grupo A, os ratos do grupo modelo apresentaram pelo macio, lassidão, fezes secas e

piorou com a extensão do tempo de modelagem.

3.3. Efeito do AEHC no número de fezes e teor de umidade em ratos com constipação induzida por loperamida.

Em comparação com as fezes normais, as fezes dos Grupos B, C, D e E eram secas, pequenas, duras e sem polimento antes do tratamento.

afinal, os ratos foram injetados com loperamida (tratados com medicamentos aliviaram os sintomas como corpo e 3(b)).

o peso não diferiu significativamente entre todos os grupos experimentais, embora o Grupo E tenha apresentado peso corporal ligeiramente inferior aos demais grupos (Figura 2(a)). Além disso, os ratos SD com constipação ingeriram significativamente menos alimentos do que o Grupo A ( ), enquanto as diferenças entre os Grupos B, C, D e E (Figura 2(b)) não foram significativas. O consumo de água também não se alterou entre o Grupo A e o Grupo B. Além disso, não foi detectado aumento significativo no consumo de água no

que o tratamento com o AEHC não induziu nenhuma alteração. Embora a taxa de trânsito intestinal nos Grupos C, D e também tenha sido significativamente maior, os Grupos C, D e E tiveram proporções significativamente menores do que o Grupo A.

3.4. Efeito do AEHC na taxa de trânsito intestinal em ratos com constipação induzida por loperamida.

Como visto na Figura 4, não foram detectadas diferenças no tempo de trânsito do intestino delgado da linha de base entre os cinco grupos. O Grupo B tem uma razão de propulsão de pó de carvão visivelmente mais baixa em comparação com o Grupo A (𝑃 < 0.01).="" embora="" a="" taxa="" de="" trânsito="" intestinal="" nos="" grupos="" c,="" d="" e="" e="" também="" tenha="" sido="" significativamente="" maior="" do="" que="" no="" grupo="" b="" (𝑃="">< 0,05),="" os="" grupos="" c,="" d="" e="" e="" tiveram="" proporções="" significativamente="" menores="" do="" que="" o="" grupo="">

3.5. A intervenção com AEHC melhora parcialmente a função do índice de motilidade colônica.

Os níveis séricos de GAS e MTL obtidos de ratos do Grupo B diminuíram significativamente em comparação com os do Grupo A (𝑃 < {{0}}.01,="" resp.).="" por="" outro="" lado,="" os="" grupos="" c,="" d="" e="" e="" (𝑃="">< 0.05,="" resp.)="" têm="" níveis="" efetivamente="" mais="" altos="" de="" gas="" e="" mtl="" da="" administração="" de="" extratos="" de="" herba="" cistanche="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" b="" .="" os="" valores="" de="" ss="" nos="" ratos="" do="" grupo="" b="" foram="" maiores="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" a="" (𝑃="">< 0,01);="" os="" grupos="" c,="" d="" e="" e="" têm="" níveis="" atenuados="" de="" ss="" (𝑃="">< 0,05)="" (figura="" 5).="" em="" comparação="" com="" ratos="" com="" constipação,="" os="" níveis="" de="" cgrp="" nos="" ratos="" normais="" do="" grupo="" a="" (𝑃="">< 0,01)="" e="" nos="" grupos="" c,="" d="" e="" e="" administrados="" com="" herba="" cistanche="" foram="" constantes="" (𝑃=""> 0,05).

3.6. Alteração Histológica do Cólon.

Para investigar se o tratamento com AEHC pode induzir alteração estrutural do tecido do cólon, o comprimento das vilosidades, a espessura da camada da cripta e a espessura do músculo foram medidos em cólons transversais de ratos nos cinco grupos após coloração com H&E. Ao comparar a patologia do cólon dos ratos em todos os grupos, a mucosa colônica era lisa e contém pequenas artérias e pequenas veias na submucosa e um grande número de células adiposas. Além disso, a camada muscular era composta por células musculares lisas e a subserosa era completa. O comprimento médio das vilosidades foi significativamente menor no Grupo B do que no Grupo A (𝑃 < {{0}}.01).="" no="" entanto,="" o="" comprimento="" médio="" das="" vilosidades="" no="" grupo="" c="" aumentou="" muito="" em="" mais="" de="" 30="" por="" cento="" quando="" comparado="" com="" o="" grupo="" b="" (figuras="" 6="" e="" 7)="" (𝑃="">< 0,05).="" enquanto="" isso,="" o="" comprimento="" médio="" das="" vilosidades="" aumenta="" muito="" nos="" grupos="" d="" e="" e="" quando="" comparado="" com="" o="" grupo="" b="" (figuras="" 6(a)="" e="" 6(b))="" (𝑃="">< 0,01).="" além="" disso,="" a="" alteração="" da="" espessura="" do="" músculo="" foi="" muito="" semelhante="" ao="" comprimento="" das="" vilosidades.="" no="" grupo="" b,="" a="" espessura="" do="">

foi dramaticamente mais fino quando comparado com o Grupo A. No entanto, os níveis de espessura muscular nos Grupos C, D e E aumentaram de 30 a 35 por cento em relação aos do Grupo B (Figuras 6 e 7). No geral, esses achados indicam que o AEHC pode aumentar o comprimento das vilosidades e a espessura do músculo no cólon de ratos constipados.

3.7. A administração do tratamento com AHEC aumentou a expressão proteica de c-Kit e SCF.

A imunorreatividade do mesmo foi detectada no cólon, pois as células em todos os grupos testaram positivo para c-kit. Conforme mostrado na Figura 8, o nível de expressão de c-kit no Grupo B foi menor do que no Grupo A (𝑃 < 0.05).="" o="" nível="" de="" expressão="" de="" c-kit="" no="" grupo="" c="" foi="" maior="" do="" que="" no="" grupo="" b="" (𝑃="">< 0.{{20}}5),="" enquanto="" mais="" c-kit="" estava="" presente="" nos="" grupos="" d="" e="" e="" do="" que="" no="" grupo="" b="" (𝑃="">< 0.05).="" após="" tratamento="" com="" diferentes="" concentrações="" de="" extrato="" aquoso="" de="" herba="" cistanche="" por="" 2="" semanas,="" os="" níveis="" de="" expressão="" proteica="" de="" c-kit="" e="" scf="" foram="" detectados="" por="" análise="" de="" western="" blot.="" a="" análise="" de="" western="" blot="" mostrou="" que="" os="" níveis="" de="" expressão="" de="" c-kit="" e="" scf="" foram="" notavelmente="" mais="" baixos="" após="" o="" tratamento="" com="" loperamida="" em="" cólons="" de="" ratos="" (figura="" 9).="" a="" figura="" 8(e)="" demonstra="" que="" a="" diminuição="" do="" c-kit="" em="" ratos="" com="" constipação="" aumentou="" significativamente="" em="" 31,2%="" após="" o="" tratamento="" dos="" ratos="" com="" 500="" 𝜇g/ml="" aehc="" (𝑃="">< 0,05).="" além="" disso,="" o="" tratamento="" com="" 100="" e="" 200="" g/ml="" de="" aehc="" elevou="" os="" níveis="" de="" expressão="" da="" proteína="" c-kit.="" a="" expressão="" da="" proteína="" scf="" aumentou="" significativamente="" em="" 20,1,="" 24,7="" e="" 8,4="" por="" cento="" no="" tratamento="" com="" 100,="" 200="" e="" 500="" 𝜇g/ml="" aehc,="" respectivamente="" (figura="" 9).="" 3.8.="" efeito="" de="" aehc="" na="" expressão="" de="" mrna="" de="" c-kit,="" scf="" e="" pi3k.="" para="" investigar="" se="" o="" tratamento="" com="" aehc="" pode="" afetar="" a="" regulação="" do="" mrna="" relacionado="" à="" contração="" muscular,="" foram="" observadas="" alterações="" nos="" níveis="" de="" expressão="" de="" c-kit,="" scf="" e="" pi3k="" em="" cólons="" de="" ratos="" constipados="" usando="" primers="" específicos.="" os="" resultados="" mostraram="" que="" os="" níveis="" de="" mrna="" de="" c-kit="" no="" grupo="" b="" foram="" significativamente="" menores="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" a="" (𝑃="">< 0,05),="" enquanto="" os="" níveis="" de="" mrna="" nos="" grupos="" c,="" d="" e="" e="" foram="" maiores="" do="" que="" no="" grupo="" b="" (𝑃="">< 0,05)="" (figura="" 10).="" também="" examinamos="" o="">

expressão de SCF, um ligante de kit. A expressão de mRNA de SCF em ratos do Grupo B foi significativamente menor do que no Grupo A, enquanto o tratamento com AEHC nos Grupos C, D e E aumentou a expressão de mRNA de SCF (Figura 10). Além disso, examinamos o efeito de AEHC na expressão do gene PI3K. No dia 14, o nível de expressão do gene PI3K foi significativamente maior nos Grupos C, D e E do que no Grupo B (𝑃 <>

4. Discussão

A constipação é um distúrbio altamente comum caracterizado por movimentos intestinais ruins. Isso diminui muito a qualidade de vida e traz enormes encargos econômicos tanto para os pacientes quanto para o seguro nacional de saúde [32]. Produtos naturais e alimentos medicinais agora atraem cada vez mais atenção devido ao seu potencial para se tornarem novos medicamentos usados ​​para o tratamento da constipação [37, 38]. Portanto, estudamos os efeitos terapêuticos do AEHC em ratos constipados induzidos por loperamida. Loperamida, atropina-difenoxilato e morfina são amplamente utilizados para induzir constipação em animais de laboratório. Entre as três drogas, a loperamida induz uma duração prolongada da evacuação das fezes e um atraso no trânsito luminal intestinal, uma vez que inibe a secreção de água e o movimento suave na parede intestinal [39]. A análise do peso corporal neste estudo não encontrou diferença dentro de cada grupo. Após o experimento, nenhuma diferença foi encontrada também. O grupo de baixa dosagem de AEHC ainda teve o menor peso corporal, mas o grupo modelo e o grupo normal testemunharam o maior peso corporal. A constipação é geralmente uma doença funcional. A constipação por trânsito lento induzida neste estudo não afetou a absorção de nutrientes dos ratos e seu peso corporal durante o experimento. Não existiam diferenças nas quantidades de fezes dos ratos e seu teor de umidade entre os grupos antes da modelagem; no entanto, ambos diminuíram notavelmente após a modelagem e o teor de umidade das fezes aumentou após o uso de AEHC em diferentes dosagens. Depois de estudar a taxa de propelente de pó de carbono do cólon.

de ratos, o grupo modelo viu uma diminuição óbvia da taxa, enquanto permaneceu normal nos grupos de baixa dosagem, média e alta dosagem de AEHC. Os resultados mostraram que a constipação crônica de trânsito induzida por loperamida tratada com diferentes dosagens de Herba Cistanche pode recuperar a função propulsora do cólon em diferentes graus. Hormônios gastrointestinais são substâncias bioativas de alto desempenho secretadas por células endócrinas da mucosa gastrointestinal e pâncreas, possuindo efeitos de excitação e inibição para regular a função motora gastrointestinal [40, 41], dos quais GAS, MTL e SS têm os principais efeitos. Os dois primeiros hormônios estimulam a secreção do suco digestivo, contraem a musculatura lisa gastrointestinal, promovem o movimento do conteúdo gastrointestinal e excitam a motilidade gastrintestinal. A SS, ao contrário, inibe a secreção de suco digestivo, a contração do músculo liso gastrointestinal e o esvaziamento gastrointestinal. Os níveis de GAS e MTL no tecido do cólon do grupo modelo foram os mais baixos, indicando que o método de modelagem certamente reduziu a concentração de GAS e MTL no tecido do cólon. Como os principais hormônios gastrointestinais da motilidade colônica, a concentração de GAS e MTL aumentou por diferentes dosagens de AEHC e, portanto, aumentou a motilidade colônica. Em contraste, o nível de SS no tecido do cólon do grupo modelo foi o mais alto, indicando que o método de modelagem pode promover a concentração de SS no tecido do cólon. O CGRP é um dos vasodilatadores mais poderosos e seu efeito de relaxamento é 10-vezes mais forte que o efeito de contração. Como um importante neurotransmissor ou neuromodulador que regula as funções digestivas, o CGRP pode inibir a maioria da motilidade gastrointestinal e a secreção de vários sucos digestivos [43]. A concentração de CGRP no grupo modelo foi maior que no Grupo A, indicando que o método de modelagem pode aumentar a concentração de CGRP no tecido do cólon, o que também pode ser um dos fatores para a redução do peristaltismo colônico que resultará em constipação. A concentração de CGRP no tecido do cólon dos grupos AEHC foi menor do que no grupo modelo, sugerindo que o AEHC teve um efeito inibitório relativamente fraco no movimento do cólon. c-Kit é uma proteína transmembranar. O fator de células-tronco (SCF) de seu ligante é produzido por células de neurônios e células musculares lisas. Promove o desenvolvimento e diferenciação do ICC e mantém sua função fisiológica normal. A rotulagem do c-Kit reflete indiretamente a quantidade e densidade de ICC [44, 45]. Além disso, a célula ICC desempenha um papel fundamental na regulação da motilidade gastrointestinal e atua como marca-passo do movimento gastrointestinal. Assim, alguns distúrbios da motilidade gastrintestinal podem encontrar um declínio na quantidade e função das células ICC. De acordo com estudos anteriores, as contagens de células no cólon de pacientes com prisão de ventre crônica foram reduzidas. Assim, o presente estudo observou as células colônicas de ratos por meio de expressão específica e técnicas imuno-histoquímicas. Comparado com o grupo normal, o número de células no grupo modelo diminuiu notavelmente, mas aumentou após o tratamento. O estudo mostrou que as células ICC e os fatores de células-tronco (SCF) estão intimamente relacionados à via de sinal c-kit/SCF. SCF é o ligante natural do c-kit expresso em vários tecidos do corpo, mas principalmente

produzido pelas células estromais na medula óssea. Cada monômero c-kit combina com um SCF através dos domínios extracelulares 1-3. Após a dimerização do SCF, a estrutura do monômero c-kit muda e produz homodimerização, que então resulta na autofosforilação do resíduo de aminoácidos na membrana celular e estimula várias segundas moléculas de sinal para regular as funções celulares do ICC. A segunda molécula sinalizadora é a fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), uma apolipoproteína que converte 4,5- difosfoinositídeo em 3,4,5-trifosfoinositídeo através da combinação com a tirosina 721 do c-kit. Pesquisas anteriores mostraram que os inibidores de PI3K Wortmannin e LY294002 deram origem ao desenvolvimento anormal de ICC bloqueando o sinal [46]. Nosso experimento descobriu que as expressões de proteína e mRNA c-kit e SCF no grupo modelo diminuíram no início, mas depois aumentaram nos grupos AEHC de diferentes dosagens, embora em níveis abaixo do normal. A expressão de mRNA de PI3K aumentou notavelmente. Portanto, o SCF/c-kit pode entrar em vigor por meio do PI3K. Os resultados mostraram que o AEHC pode regular a musculatura lisa do trato gastrointestinal aumentando a quantidade de células ICC. Baixa dosagem de AEHC não teve efeito significativo na constipação, enquanto sua dosagem média e alta dosagem encurtaram o tempo da primeira defecação dos ratos, aumentaram o teor de umidade das fezes, melhoraram a taxa de propelente do cólon, refinaram a quantidade das fezes, aumentaram o GAS , MTL e CCK, e fortaleceu a contratilidade colônica. A dosagem efetiva de AEHC é inicialmente de 20 g/d após a conversão, o que equivale à dosagem média e alta neste estudo.

5. Conclusões

O AEHC promove a motilidade intestinal melhorando a função do ICC e regulando os neurotransmissores neste estudo, que provou que o AEHC tem potencial para tratar e prevenir a constipação. Os extratos melhoraram a produção de ondas lentas do cólon e regularam o ritmo da atividade contrativa Quantidade de mRNA SCF Quantidade de mRNA PI3K Quantidade de mRNA c-Kit12 Medicina Complementar e Alternativa Baseada em Evidências do músculo liso, aumentando a quantidade de ICC através do PI3K/SCF/ via de sinal c-kit. No entanto, estudos experimentais mais detalhados podem melhorar a compreensão das outras vias moleculares do AEHC na cura do STC e ajudar a orientar estudos clínicos prospectivos avaliando seus efeitos e segurança.

Conflitos de interesse

Os autores declaram que não há conflitos de interesse.

Contribuições dos autores

Shuai Yan e Yin-Zi Yue contribuíram igualmente para este trabalho. Todos os autores aprovaram o artigo final.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por uma bolsa da National Natural Science Foundation of China (NSFC) e financiado pelo governo chinês (81573979). O estudo também foi apoiado pelo projeto de tecnologia da Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Jiangsu, China (nº YB2017061), o Programa de Desenvolvimento Científico e Tecnológico de Suzhou, China (nº SYSD2015172), o Projeto de Inovação Tecnológica Industrial de Suzhou, China ( nº SYSD2016136, nº SYS201775 e nº SYS201776), e o Projeto Universitário do Hospital de Medicina Tradicional Chinesa de Suzhou, China (YQN2015007). Os autores agradecem o apoio financeiro de um projeto financiado pela China Postdoctoral Science Foundation (2017M620220).

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