Como Cistanche pode ajudar a saúde óssea?

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[Abstrato]Objetivo:Estudar a diferenciação direcional das células-tronco mesenquimais da medula óssea (MSCs) induzidas pela medicina tradicional chinesa tonificante dos rins e elaborar a teoria de "o rim governa o osso e a medula". Método: Líquido da Medicina Tradicional Chinesa

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Os ratos SD foram administrados por via intragástrica por 4 dias e então o sangue foi coletado da aorta abdominal para preparar o soro medicamentoso. As SCs M de 4ª geração foram inoculadas em duas placas de 6-poços em 5×106, cada um com 6 poços, divididos em grupos em branco,

grupo Morinda officinalis, grupo eucommia ulmoides, grupo psoraleno,cistachegrupo, grupo epimedium. Quando as células crescem para 80 por cento, cada grupo de medicina tradicional chinesa é adicionado com meio LD M EM de soro contendo droga, e o meio original do grupo em branco continua a ser cultivado; no 10º dia de indução, uma placa de 6-poço é retirada para coloração de ALP; o outro está 6-bem no 20º dia, manchado com vermelho de alizarina. Resultados: grupo Morinda officinalis, grupo Eucommia ulmoides,Cistanchegrupo Epimedium apresentou coloração ALP positiva no 10º dia, nódulos brancos de cálcio foram observados por volta do 14º dia e coloração com vermelho de alizarina foi positiva no 20º dia. Conclusão: "O rim

Guiada pela teoria do "osso e medula principal", a medicina chinesa tonificante dos rins pode induzirossocélulas-tronco mesenquimais da medula para se diferenciarem em osteoblastos.

Palavras-chave: células-tronco mesenquimais da medula óssea; osteoblastos; diferenciação direcionada

A medicina tradicional chinesa acredita que os rins dominam oossos, armazenam essência e produzem medula. Ambos os estudos clínicos e experimentais confirmaram o significado clínico dessa teoria, mas nenhuma pesquisa foi conduzida sobre a indução da diferenciação de células-tronco mesenquimais da medula óssea (MSCs). As M SCs são um tipo de células-tronco adultas pluripotentes, que existem principalmente na medula óssea, mas também nos tecidos extraósseos de origem mesenquimal durante o período embrionário, como fibroblastos da pele, células-tronco adiposas, células satélites do músculo esquelético e células endoteliais vasculares . Medula óssea M SCs (BM SCs) são componentes do estroma da medula óssea. Depois de isolados e cultivados in vitro, sob certas condições de indução, eles têm a capacidade de se diferenciar em osteoblastos, condrócitos, células nervosas, adipócitos, cardiomiócitos, etc. de várias maneiras. As principais fontes de células-semente na engenharia de tecido ósseo são os osteoblastos e as BMSCs. Embora os osteoblastos tenham boa atividade osteogênica, eles são de fonte limitada, difíceis de isolar e obter em grandes quantidades, e têm potencial insuficiente para expansão em larga escala in vitro, que são difíceis de atender às necessidades de aplicações clínicas na engenharia de tecidos ósseos; BM SCs não só têm bom potencial de diferenciação osteoblástica e alto potencial de diferenciação. Atividade osteogênica, forte potencial de proliferação e fonte conveniente podem satisfazer a engenharia de tecidos autólogos.

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1 Material e métodos

1.1 Materiais

1.1.1 Animais experimentais

Doze ratos SPF SD, pesando 120 g ~ 150 g, não se limitam a machos e fêmeas, fornecidos pelo Centro Experimental da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Guangzhou.

1.1.2 Reagentes e equipamentos Meio Haiclone L-DM EM, Haiclone South American Fetal Bovine Serum (FBS), Morinda officinalis, Psoraleno, Eucommia, Cistanche, Epimedium em pó medicinal chinês, DM SO (sigma), vermelho de alizarina (Guangzhou Weijia), coloração de fosfatase alcalina (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.), 0,25 por cento de pancreatina (empresa GI BCO). 0filtro de seringa de 0,22μm (MI LL Ipo re), frasco de cultura de 75cm2, 96-placa de poço, 6-placa de poço (corning). Evaporador rotativo, leitor de microplacas (Thermo), centrífuga refrigerada (sigma 3K 15), incubadora de CO2 (empresa SH ELDO NA).

1.2 Método

1.2.1 Preparação de soro contendo medicina tradicional chinesa

Tomar 150 g de pó medicinal chinês bruto, adicionar 10 vezes a quantidade de etanol a 70%, aquecer ao refluxo duas vezes, 1 h de cada vez, filtrar, combinar o filtrado, concentrar o filtrado sob pressão reduzida para 300 ml, esfriar à temperatura ambiente e armazenar na geladeira a 4 graus para uso posterior. Diluir o líquido da medicina tradicional chinesa para 0,3 g de droga bruta/ml e gavagem, 1 ml de cada vez, duas vezes ao dia, após administração contínua por 4 dias, o sangue é coletado da aorta abdominal, após precipitação durante a noite, centrifugado a 2500r por 20 min , colete o sobrenadante e esterilize com agulha através do filtro e armazene a -20 grau .

1.2.2 Separação e cultura de MSCs

Após a anestesia dos ratos SD através da cavidade abdominal, o fêmur e a tíbia de ambos os membros inferiores foram retirados sob condições assépticas, e os tecidos moles foram limpos, as extremidades ósseas foram aparadas com pinças, a cavidade medular foi exposta e os 10 seringa de ml foi usada para sugar L-DM EM contendo 10 por cento de soro fetal bovino. Lave a cavidade medular com o meio repetidamente até que o osso fique branco e a transmitância da luz aumente. Colete o fluido de lavagem da cavidade medular em um frasco de cultura de 75 cm2 e coloque-o em uma incubadora de CO 2 a 37 graus, 5 por cento. Troque o fluido a cada 2 a 3 dias.

1.2.3 Passagem de MSCs

Quando as células estão 90 por cento cheias do fundo da garrafa, elas são digeridas com 0,25 por cento de tripsina, então pipetadas em uma suspensão de células e passadas na proporção de 1:3.

1.2.4 MSCs induzem diferenciação

Quando as células P4 estão 90 por cento crescidas, elas são digeridas com 0,25 por cento de tripsina para preparar uma suspensão de células. As células são semeadas em 2 6-placas de poços com uma densidade celular de 5×106 por poço, com 6 poços por placa. Dividido em grupo branco, grupo Morinda officinalis, grupo Psoraleno, grupo Eucommia ulmoides, grupo Cistanche cistanche, grupo epimedium. Quando as células estavam 80% cheias do fundo do frasco, o meio foi trocado. O meio original do grupo em branco continuou a ser cultivado e o grupo de medicina chinesa foi adicionado com 10 por cento de meio L-DM EM contendo soro contendo medicina chinesa.

1.2.5 Coloração com Fosfatase Alcalina

No 10º dia da cultura de indução, uma placa de 6-poço foi retirada e corada de acordo com o método do kit de coloração de fosfatase alcalina. Observe os resultados ao microscópio.

1.2.6 Coloração com Vermelho de Alizarina

No 20 dia da cultura de indução, retire uma 6-placa de poço, aspire a solução de indução de osteoblastos, lave 3 vezes com P BS, fixe com álcool 95% por 10 min, adicione 0,1% Alizarina Red-Tr is-HCl (pH 8,3), banho-maria a 37 graus por 30 min, observar os resultados ao microscópio.

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2 Resultados

2.1 Observação da morfologia celular

MSCs são células semelhantes a fibroblastos, que formam um fusiforme após a fixação à parede (ver Figura 1). Após a adição da solução de indução, as células do grupo branco não mudaram significativamente; a partir do 3º dia, as células do grupo Morinda officinalis, grupo Eucommia ulmoides, grupo Cistanche deserticola e grupo Epimedium apresentaram crescimento agregado de células e volume celular ligeiramente aumentado (ver Figura 2), 14 dias depois, foi observada a formação de nódulos óbvios sob o microscópio traseiro (veja a Figura 3). Não houve alteração óbvia nas células do grupo psoraleno.

2.2 Coloração com fosfatase alcalina

No 10º dia, o grupo Morinda officinalis, grupo Eucommia ulmoides, grupo Cistanche cistanche e grupo Epimedium foram corados com fosfatase alcalina. Verificou-se que a área de agregação celular ficou roxa e preta (ver Figura 4), e a dispersão celular ficou azul (ver Figura 5). ). O grupo psoraleno e o grupo branco foram negativos.

2.3 Coloração com vermelho de alizarina

No 21º dia, o grupo Morinda officinalis, grupo Eucommia ulmoides, grupo Cistanche, grupo Epimedium Alizarin Red coraram a matéria granular branca no fundo da placa 6-e vermelho escuro após a coloração. Grupo Jitian, grupo psoraleno, grupo eucommia, grupo cistanche, grupo epimedium. Ao microscópio, há partículas vermelhas na área de agregação celular, que são nódulos de cálcio (Figura 6). O grupo psoraleno e o grupo branco foram negativos.

3 Discussão

3.1 Preparação de soro contendo medicina tradicional chinesa

A composição da medicina tradicional chinesa é complexa e é difícil estudar cada componente. A farmacologia do soro pode, até certo ponto, superar a interferência de fatores incertos, como as propriedades físicas e químicas das preparações da medicina tradicional chinesa nos resultados experimentais, e está relativamente próxima da verdadeira biotransformação da droga no corpo.

O processo real. Ou seja, tem duas grandes vantagens: ①Reflete o efeito de transformação bioquímica do composto no corpo;

②Superar a interferência direta das propriedades físicas e químicas da própria droga no experimento [1].

Tanto a preparação de soro quanto os animais derivados de M SC são ratos SD, e animais homólogos são usados ​​para preparar soro, o que pode reduzir a resposta imune causada por diferenças de espécies e melhorar a confiabilidade dos resultados experimentais [2], levando em consideração o metabolismo animal . Diferente, tome peso, método de conversão de área de superfície corporal para administrar. Algumas pessoas pensam que existem muitas enzimas, anticorpos, complemento, citocinas e outras substâncias biologicamente ativas, que podem ter um impacto direto nas células, vírus, patógenos e tecidos e órgãos usados ​​para experimentos in vitro, que podem interferir na os resultados dos experimentos e afetam a avaliação objetiva da eficácia do medicamento. Interferência farmacológica após inativação do soro [3]. No entanto, os componentes da medicina tradicional chinesa são complexos e os efeitos farmacológicos no corpo são complicados. O soro não inativado pode refletir melhor os efeitos da droga no organismo, e nenhum efeito citotóxico foi observado durante o experimento.

3.2 O efeito indutor da medicina chinesa tonificante dos rins na diferenciação direcionada de MSCs

Medula óssea M SCs (BM SCs) são componentes do estroma da medula óssea. Depois de isolados e cultivados in vitro, sob certas condições de indução, eles têm a capacidade de se diferenciar em osteoblastos, condrócitos, neurócitos, adipócitos, cardiomiócitos, etc. de várias maneiras. Estudos experimentais mostraram que tanto a medicina tradicional chinesa unitária [4] quanto a medicina chinesa composta de tonificação renal [5] têm o efeito de induzir as MSCs a se diferenciarem em osteoblastos. No experimento, os cinco soros medicinais chineses preparados a partir das cinco drogas que têm os efeitos de "tonificar o rim e fortalecer os ossos e músculos", com exceção do psoraleno, podem induzir a diferenciação de M SCs em osteoblastos, mas o mecanismo específico permanece para ser mais estudado.

3.3 O significado clínico do soro tonificante da medicina tradicional chinesa para induzir as MSCs a se diferenciarem em osteoblastos.

A engenharia de tecidos ósseos tem amplas perspectivas para aplicações clínicas e se tornou um hotspot de pesquisa em ortopedia moderna. BM SCs, como as sementes mais ideais para a engenharia de tecido ósseo atualmente, podem eliminar a influência desses fatores interferentes nos resultados experimentais e ajudar a reduzir o conteúdo não celular do soro. A tarefa central da pesquisa sobre seu efeito é como fazê-lo nas condições mais simples possíveis. Diferenciam-se diretamente em osteoblastos e, em seguida, transformam-se em células ósseas maduras. Atualmente, os indutores comumente usados ​​para a diferenciação de M SCs em osteoblastos são a dexametasona, composta por vitamina C e -glicerofosfato de sódio. Clinicamente, a dexametasona tem efeitos colaterais como infecção, osteonecrose e osteoporose, e tem um efeito inibitório significativo na proliferação celular in vitro [6, 7], o que limitará o uso de MSCs como indutor in vivo após o transplante. A medicina chinesa tonificante dos rins tem o efeito de induzir as MSCs a se diferenciarem em osteoblastos. Na aplicação clínica a longo prazo, os efeitos tóxicos e colaterais da medicina chinesa tonificante dos rins não foram observados. Portanto, seu uso como indutor in vivo tem ampla perspectiva de aplicação clínica.

Em suma, a maioria das pesquisas atuais sobre M SCs como células-semente para engenharia de tecido ósseo ainda está em fase experimental. Como obter SCs M suficientes em um curto espaço de tempo e induzi-los a se diferenciar em osteoblastos por métodos simples é atualmente estudado. Foco. Embora os medicamentos tradicionais chineses com os efeitos de revigorar os rins e fortalecer os ossos e músculos possam induzir as MSCs a se diferenciarem em osteoblastos, ele tem um futuro brilhante como indutor de diferenciação de MSCs para o tratamento de união tardia, pseudoartrose e osteoporose de fraturas . O mecanismo de ação ainda precisa ser mais estudado.

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