Método HPTLC de fase reversa altamente sensível e ecologicamente sustentável para a determinação de hidroquinona em cremes clareadores comerciais

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Mohammed H. Alqarni 1, Prawez Alam 1, Faiyaz Shakeel 2, Ahmed I. Foudah 1 e Sultan Alshehri 2,*

Abstrato: Hidroquinona(HDQ) é um agente despigmentante natural, comumente usado em preparações para tonificação da pele. A segurança e esverdeamento dos métodos analíticos de quantificação de HDQ não foram considerados na literatura anterior. Portanto, um ensaio baseado em cromatografia em camada fina de fase reversa de alta performance (RP-HPTLC) altamente sensível e ecologicamente mais ecológico foi estabelecido para estimativa de HDQ em quatro diferentesbranqueamentocremes (CWC). A mistura binária etanol-água(60:40, v·v−1) foi utilizada como sistema de solvente verde. A estimativa do HDQ foi realizada em 291 nm. O presente ensaio baseado em RP-HPTLC foi linear na faixa de 20–2400 ng banda−1. O presente método analítico foi altamente sensível com base nos dados de detecção e quantificação. Os demais parâmetros de validação, como acurácia, precisão e robustez, também foram adequados para a determinação do HDQ. As quantidades máximas de HDQ foram obtidas em CWC A (1,23 por cento w·w−1) seguido por CWC C (0,81 por cento w·w−1), CWC D (0,43 por cento w·w−1) e CWC B (0,37 por cento w· w-1). A pontuação analítica GREEnness (AGREE) para o presente método analítico foi estimada em 0,91, indicando as excelentes características mais verdes do presente ensaio RP-HPTLC. Esses resultados sugerem que o presente método analítico é altamente sensível e ecologicamente sustentável para a quantificação de HDQ em suas formulações comerciais.

Palavras-chave:aceita;hidroquinona; RP-HPTLC ecologicamente sustentável; validação

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1. Introdução

Hidroquinona(HDQ) é um composto natural, presente em diversas formulações comerciais de tonificação da pele para o tratamento do melasma (doença causada pelo acúmulo excessivo de melanina na pele humana) [1,2]. É um potente agente despigmentante e é utilizado como alternativa à tirosinase [3]. É um dos agentes mais utilizados no tratamento da hiperpigmentação da pele humana [4,5]. A concentração efetiva de HDQ em formulações comerciais de tonificação da pele varia de 1,5 a 2,0 por cento w·w−1[6]. A alta concentração de HDQ (acima de 5 por cento w·w−1) causa irritação local e leucoderma na pele humana [5,6]. Devido aos seus efeitos colaterais controversos, muitos países baniram o HDQ comobranqueamentoagente em formulações tópicas [7]. No entanto, várias investigações clínicas sugeriram vários efeitos protetores daHDQno manejo de diferentes desordens hiperpigmentares da pele como melasma, sardas, lentigos, etc. [8,9]. Considerando os benefícios e os riscos do HDQ, é necessária sua análise quantitativa em diferentes formulações comerciais de tonificação da pele.

Diferentes ensaios farmacêuticos são utilizados para a quantificação de HDQ sozinho ou em combinação com outrosbranqueamentoagentes em cremes clareadores comercializados (CWCs). Uma variedade de ensaios baseados em espectrometria ultravioleta (UV) foi documentada para a análise quantitativa de HDQ em produtos clareadores comerciais (CWPs) e preparações farmacêuticas [10-13]. Uma ampla gama de ensaios baseados em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi documentada para a determinação de HDQ juntamente com seus éteres em uma variedade de CWCs e CWPs [14-23]. Vários métodos voltamétricos também foram estabelecidos para a determinação simultânea de HDQ e seus derivados éter em CWPs [24-29]. Alguns outros ensaios analíticos como eletroquímicos de injeção de fluxo [30], cromatografia eletrocinética micelar [31], eletrocromatografia capilar [32] e ensaios baseados em nanocompósitos [33] também foram estabelecidos para oHDQanálise junto com seus derivados de éter e outrosbranqueamentoagentes em CWPs. Alguns nanosensores baseados em eletroquímicos também foram relatados para análise de HDQ [34,35]. Um único método baseado em cromatografia em camada fina de alta performance de fase normal (HPTLC) também foi aplicado para a análise qualitativa e quantitativa de HDQ em CWCs por nosso grupo de pesquisa [1].

Após uma análise exaustiva dos ensaios relatados sobre a análise do HDQ, observou-se que a segurança e a sustentabilidade ecológica dos métodos farmacêuticos na literatura não foram avaliadas ou consideradas para avaliação. Além disso, os ensaios baseados em HPTLC de fase reversa verde/ecologicamente sustentável (RP-HPTLC) ainda não foram utilizados para a estimativa deHDQem seus CWCs. Ensaios ecologicamente sustentáveis/verdes baseados em HPTLC oferecem muitas vantagens, como simplicidade, economia, baixo custo de operação, curto tempo de análise, análise paralela de várias amostras, clareza de detecção e redução na toxicidade ambiental sobre HPLC e outros métodos analíticos [36-39]. Assim, um método RP-HPTLC para a determinação de HDQ foi selecionado para este estudo. Diferentes abordagens são utilizadas para a avaliação do perfil de verde dos ensaios farmacêuticos [38–43]. No entanto, apenas a abordagem métrica analítica GREEnness (AGREE) aplica todos os 12 princípios da química analítica verde (GAC) para a avaliação do greenness [42].

A abordagem métrica AGREE foi aplicada para a avaliação do verde do método presentRP-HPTLC [42]. Portanto, o presente trabalho foi realizado para desenvolver um método RP-HPTLC altamente sensível e verde/ecologicamente sustentável para a estimativa deHDQem quatro CWCs diferentes. O perfil de verde do presente método RP-HPTLC foi obtido por AGREE: The Analytical Greenness Calculator. O presente ensaio analítico para análise de HDQ foi validado de acordo com as diretrizes do Conselho Internacional para Harmonização (ICH) Q2 (R1) [44].

2. Materiais e métodos

2.1. Materiais

O padrão de referência de HDQ (pureza: 99 por cento) foi adquirido da Fluka Chemica (Darmstadt, Alemanha). Metanol de grau HPLC (MeOH) e etanol (EtOH) foram adquiridos da Alfa Aesar (Tewksbury, MA, EUA). Água grau HPLC (H2O) foi coletada de um sistema purificador de água Milli-Q (E-Merck, Darmstadt, Alemanha). Outros solventes e reagentes utilizados eram de grau analítico. Quatro CWCs diferentes de HDQ foram obtidos do mercado farmacêutico em Al-Kharj, Arábia Saudita, no mês de junho de 2021. Os CWCs deHDQfoi armazenado em local fresco e escuro a 22 ◦C antes do início dos experimentos. Os CWCs foram armazenados por cerca de um mês antes do início dos experimentos.

2.2. Cromatografia

A quantificação densitometria por RP-HPTLC do HDQ em seu padrão de referência e quatro CWCs diferentes foi realizada utilizando um instrumento HPTLC (CAMAG, Muttenz, Suíça). A análise quantitativa de HDQ foi realizada em placas de vidro de 10 x 20 cm2 pré-revestidas com placas RP de sílica gel 60 F254S (E-Merck, Darmstadt, Alemanha). As amostras nas placas de TLC foram manchadas como as bandas de 6 mm utilizando um aplicador de amostrador automático 4 (ATS4) (CAMAG, Genebra, Suíça). O aplicador de amostra foi equipado com uma seringa de microlitro CAMAG (Hamilton, Bonaduz, Suíça). A taxa de aplicação para a análise quantitativa deHDQfoi mantida constante em 150 nL s−1. As placas foram reveladas em uma câmara de revelação automática 2 (CAMAG, Muttenz, Suíça) a 80 mm de distância. O sistema de solvente verde para análise de HDQ foi EtOHH2O (60:40, v·v−1). A câmara de revelação foi previamente saturada com os vapores da fase móvel por 30 min a 22 ◦C. O HDQ foi detectado em 291 nm. As dimensões da fenda foram de 4 × 0,45 mm2 e a taxa de varredura foi de 20 mm s−1. Cada experiemento foi realizado em triplicidade. O software utilizado para o processamento dos dados foi o WinCATs (v. 1.4.3.6336,CAMAG, Muttenz, Suíça).

2.3. Curva de calibração HDQ e preparação de amostras de controle de qualidade

A quantidade especificada de HDQ (10 mg) foi dispensada em 100 mL de sistemas solventes verdes EtOH-H2O(60:40, v·v−1) para obter a solução estoque com a concentração de 100 µg mL−1. Os diferentes volumes de soluções estoque foram diluídos ainda mais usando sistemas EtOH-H2O (60:40, v·v−1) para atingir concentrações de HDQ na faixa de 20-2400 ng banda−1. As soluções obtidas deHDQcontendo diferentes concentrações foram colocados em placas de HPTLC. A área do pico HPTLC para HDQ foi obtida para cada solução HDQ utilizando o presente ensaio farmacêutico. A curva de calibração de HDQ foi gerada plotando as concentrações de HDQ contra sua área de HPTLC. Além disso, três amostras diferentes de controle de qualidade (QC), como QC baixo (LQC; 20 ng band−1), QC médio (MQC;600 ng band−1) e QC alto (HQC; 2400 ng band−1) , foram obtidos separadamente para determinar diferentes parâmetros de validação para o presente ensaio farmacêutico.

2.4. Processamento de Amostra para Determinação de HDQ em CWCs

O HDQ foi extraído de quatro CWCs diferentes adotando-se o procedimento relatado na literatura [1]. As quantidades pesadas com precisão (5.0 g) de quatro CWCs diferentes, incluindo A, B, C e D, foram transferidas para o funil de separação separadamente. Cada CWC foi agitado no funil de separação com MeOH (3 × 70 mL) por um período de 30 min a 22 ◦C. Os extratos de MeOH de cada CWC foram combinados e evaporados separadamente até a secura sob pressão reduzida usando um evaporador rotativo a vácuo. Os resíduos obtidos foram reconstituídos com 10 mL de MeOH e armazenados em geladeira até posterior avaliação. As amostras obtidas foram submetidas à análise de HDQ utilizando o presente método analítico a 291 nm.

2.5. Parâmetros de validação

O presente ensaio RP-HPTLC para análise HDQ foi validado para diferentes parâmetros de validação seguindo as diretrizes ICH-Q2 (R1) [44]. oHDQa linearidade foi avaliada plotando as concentrações de HDQ contra sua área de pico medida. A linearidade do HDQ foi avaliada em 11 amostras de QC diferentes de 20, 40, 60, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 1200 e 2400 ng banda-1 para o presente ensaio farmacêutico. Os parâmetros de eficiência do sistema para o presente método analítico foram avaliados em termos do fator de retardo (Rf), fator de assimetria (As) e o número de pratos teóricos por metro (N m−1). O Rf, As e N m−1 foram obtidos no MCQ (600 ng banda−1), conforme relatado anteriormente na literatura [45].

A precisão para o presente método RP-HPTLC foi determinada como a porcentagem de recuperação. A porcentagem de recuperação foi obtida em LQC (20 ng band−1), MQC (600 ng band−1) e HQC (2400 ng band−1) para o presente método analítico.

A precisão do presente método analítico foi avaliada como precisão intra/interdia. A precisão intradia foi determinada pela análise de HDQ em LQC, MQC e HQC no mesmo dia para o presente ensaio analítico. A precisão interdia foi determinada pela análise do HDQ em LQC, MQC e HQC em três dias diferentes para o presente ensaio analítico [44]. Cada precisão foi medida seis vezes (n=6).

A robustez foi avaliada introduzindo algumas pequenas mudanças nos sistemas de solventes verdes para o presente método RP-HPTLC. Para avaliação de robustez, o sistema solvente original EtOH H2O (60:40, v·v−1) foi alterado para EtOH-H2O (62:38, v·v−1) e EtOHH2O (58:42, v·v−1 ) sistemas solventes, e a resposta específica de HPTLC e os valores de Rf foram registrados e interpretados [44].

A sensibilidade para o presente método analítico foi avaliada como limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) usando um método de desvio padrão. O LOD e LOQ do HDQ para o presente método analítico foram calculados, conforme relatado na literatura [44,45].

A pureza/especificidade do pico foi avaliada comparando os valores de Rf e os espectros de UV de HDQ em CWCs A, B, C e D com os de HDQ padrão para o presente ensaio farmacêutico.

2.6. Análise Quantitativa de HDQ em CWCs

As amostras obtidas de CWC A, B, C e D foram colocadas em placas de HPTLC e suas respostas de TLC foram anotadas. A área de pico paraHDQem CWCs foi registrado. Os conteúdos de HDQ em CWCs foram calculados utilizando a curva de calibração de HDQ para o presente método analítico.

2.7. Avaliação de verde

As características de verde para o presente método analítico foram obtidas utilizando a abordagem métrica AGREE [42]. As pontuações AGREE (0.0–1.0) do presente método analítico foram registradas utilizando o AGREE: The Analytical Greenness Calculator (versão0.5, Gdansk University of Technology, Gdansk, Polônia, 2020).

3 Resultados e discussão

3.1. Desenvolvimento de Método

Com base em métodos analíticos da literatura, verificou-se que falta o método RP-HPTLC ecologicamente sustentável capaz/verde para a análise de HDQ em cosméticos comerciais. Método RP-HPTLC para análise HDQ em CWCs.

Para a análise RP-HPTLC de HDQ, diferentes proporções de EtOH e H2O, incluindo EtOH-H2O (50:50, v·v−1), EtOH-H2O (60:40, v·v−1), EtOH-H2O (70:30, v·v−1), EtOH H2O (80:20, v·v−1) e EtOH-H2O (90:10, v·v−1), foram avaliados como as combinações de solvente verde para o desenvolvimento de uma banda confiável para análise HDQ. As misturas de solventes foram desenvolvidas sob condições de saturação da câmara. A partir dos dados registrados, notou-se que EtOH-H2O (50:50, v·v−1), EtOH-H2O (70:30, v·v−1), EtOH-H2O (80:20, v·v− 1), e EtOH-H2O (90:10, v·v−1) misturas de solventes verdes ofereceram um cromatograma pobre deHDQcom um valor As inaceitável (As {{0}}.29). No entanto, a combinação de solvente verde EtOH-H2O (60:40, v·v−1) mostrou oferecer um cromatograma bem resolvido de HDQ atRf=0,83 ± 0,02 com um valor de As aceitável (As {{ 12}}.03) (Figura 1). Portanto, o EtOH H2O (60:40, v·v−1) foi otimizado como as misturas de solventes verdes para análise de HDQ nos CWCs. As bandas espectrais de UV para o presente método RP-HPTLC foram registradas densitometricamente, e a resposta máxima de HPTLC foi encontrada em 291 nm para o método presente RP-HPTLC. Portanto, toda a análise do HDQ foi realizada em 291 nm.

3.2. Parâmetros de validação

O presente ensaio farmacêutico para quantificação de HDQ foi validado para faixa de linearidade, parâmetros de eficiência do sistema, exatidão, precisão, robustez, sensibilidade e pureza/especificidade de pico seguindo as recomendações do ICH [44]. Os resultados para a análise de regressão de mínimos quadrados da curva de calibração do HDQ para o presente método RP-HPTLC são apresentados na Tabela 1. OHDQcurva de calibração foi linear na faixa de 20–2400 ng banda com um coeficiente de determinação de 0,9997 para o presente método analítico. esses dados sugeriram uma boa linearidade entre a concentração de HDQ e sua resposta.

Os parâmetros de eficiência do sistema do presente método farmacêutico foram estudados no MQC (600 ng band−1), e os resultados estão incluídos na Tabela 2. Os valores de Rf, As e N m−1 para o presente método analítico foi previsto como 0,83 ± 0,02, 1,03 ± 0,03 e 4987 ± 2,87, respectivamente. Esses resultados indicaram que o presente método analítico era confiável para análise de HDQ nos CWCs.

Os resultados da análise de precisão para o presente método analítico estão listados na Tabela 3. A porcentagem de recuperação de HDQ para o presente método RP-HPTLC foi determinada como 101,80 por cento, 98,16 por cento e 99,38 por cento em LQC, MQC e HQC, respectivamente . Os altos valores de recuperações percentuais indicaram a precisão do presente método RP-HPTLC para análise de HDQ nos CWCs.

A precisão foi determinada como o percentual do coeficiente de variação (% CV), e os resultados são mostrados na Tabela 4. Os percentuais CVs de HDQ para o presente método analítico foram previstos como 0,91, 0. 59 e 0,26 por cento em LQC, MQC e HQC, respectivamente, para a precisão intradiária. Os CVs percentuais de HDQ para o presente método RP-HPTLC foram previstos como 0,98,{{10}},69 e 0,32 por cento em LQC, MQC e HQC, respectivamente, para o precisão interdia. Os baixos valores de porcentagem de CV indicaram a precisão do presente método RP-HPTLC para análise de HDQ em CWCs.

Os resultados da análise de robustez para o presente método analítico são mostrados na Tabela 5. Os CVs percentuais para a análise de robustez foram previstos como 0,59–0,66 por cento para o presente método analítico. Os valores de Rf do HDQ foram encontrados na faixa 0.82–0.84 para o método analítico presente. As mudanças estreitas nos valores de Rf de HDQ e menores percentuais de CVs mostraram a robustez do presente método analítico para quantificação de HDQ em CWCs.

A sensibilidade para o presente método analítico foi registrada como "LOD e LOQ", e seus valores físicos são apresentados na Tabela 1. O "LOD e LOQ" para o presente método analítico foram previstos como 6,91 ± 0,23 e 2 0,73 ± 0,68 ng banda−1, respectivamente, paraHDQquantificação. Esses valores físicos de "LOD e LOQ" para o presente método analítico indicaram a sensibilidade para análise de HDQ em CWCs.

A pureza/especificidade de pico para o presente método analítico foi avaliada comparando os espectros de UV sobrepostos de HDQ em quatro CWCs diferentes com os de HDQ padrão. Os espectros UV sobrepostos de HDQ e HDQ padrão em quatro CWCs diferentes são mostrados na Figura 2. A resposta cromatográfica mais alta para HDQ em HDQ padrão e CWCs estudados foi observada em 291 nm para o presente método analítico. Os espectros de UV idênticos, valores de Rf e comprimento de onda de HDQ em HDQ e CWCs padrão indicaram a pureza/especificidade de pico para o presente método analítico.

3.3. Análise de conteúdo HDQ em CWCs

A aplicabilidade do presente ensaio analítico foi verificada na estimativa quantitativa de HDQ em CWCs. O cromatograma deHDQde CWCs foi identificado comparando seu ponto de TLC em Rf {{0}}.83 ± 0.02 com aqueles de HDQ padrão para o presente método analítico. Os cromatogramas de HDQ em CWCs A e B para o presente ensaio analítico estão resumidos na Figura 3. Os cromatogramas HPTLC de HDQ em CWCs eram idênticos aos de HDQ puro. Alguns picos extras também apareceram nos cromatogramas dos CWCs, que podem estar associados a diferentes excipientes presentes nos CWCs. O método HPTLC ecologicamente sustentável foi seletivo para análise HDQ em Rf=0.83 sem interferência dos outros ingredientes dos CWCs. O valor Rf (0}.83) do HDQ em CWCs foi idêntico ao do HDQ padrão ({{20}}.83), indicando que não houve interação entre HDQ e Ingredientes CWC. Portanto, não houve influência dos ingredientes da formulação na qualidade do cromatograma HDQ, LOD e eficiência do presente método HPTLC de análise HDQ. A presença de picos extras nos cromatogramas de CWCs indicou que o presente método RP-HPTLC foi confiável para a estimativa de HDQ na presença de ingredientes de formulação. Os teores de HDQ de CWCs foram determinados a partir da curva de calibração de HDQ, e os resultados estão incluídos na Tabela 6. A Tabela 6 também resume a quantidade rotulada de HDQ e seus ingredientes de formulação. Os teores de HDQ foram mais altos em CWC A (1,23 por cento w·w−1) seguido por CWC C (0,81 por cento w·w−1), CWC D (0,43 por cento w·w −1) e CWC B (0,37 por cento w·w−1). O conteúdo registrado de HDQ foi muito menor do que a quantidade rotulada (2.00 por cento w·w−1) de HDQ em CWCs estudados. O conteúdo de HDQ em dois CWCs diferentes (A e B) foi registrado como 0,69 por cento w·w−1 e 0,34 por cento w·w−1, respectivamente, usando o método HPTLC de fase normal na literatura [1]. O conteúdo relatado de HDQ também foi muito menor do que a quantidade rotulada (2.00 por cento w·w−1) de HDQ na literatura [1]. Vários CWCs ou CWPs são comercializados sob a alegação de serem totalmente naturais. No entanto, é comum encontrar alguns produtos químicos sintéticos como adulterantes com os mesmos efeitos encontrados em tais CWCs ou CWPs como fraude. A quantidade de HDQ registrada neste trabalho e as registradas na literatura indicaram que os CWCs estudados possuem uma quantidade baixa de HDQ e não corresponderam às reivindicações do rótulo [1]. Assim, espera-se que os CWCs estudados contenham alguns produtos químicos sintéticos como adulterantes. Em geral, o presente ensaio analítico pode ser usado para análise de HDQ em preparações cosméticas e farmacêuticas.

3.4. Avaliação do verde

Diferentes métodos são utilizados para a avaliação do verde dos ensaios farmacêuticos [38-43]. No entanto, apenas a abordagem AGREE utiliza todos os 12 princípios do GAC para a avaliação do verde [42]. Portanto, o perfil de verdor do presente método analítico foi obtido usando a Calculadora AGREE. A pontuação AGREE prevista utilizando 12 princípios diferentes de GAC para o presente ensaio analítico é apresentada na Figura 4. A pontuação AGREE para diferentes princípios de GAC foi registrada da seguinte forma: Tratamento da amostra: 0.61Posicionamento do dispositivo analítico: 1.{{ 9}}Etapas para preparação da amostra: 1.00Grau de automação: 0.80Derivatização: 1.00Quantidade de desperdício: 1.{{17} }Rendimento da análise: 1.00Consumo de energia: 1.00Tratamento da amostra: 0,51Fonte do reagente: 1.00Toxicidade dos solventes: 1.00 Segurança do operador: 1.00

A pontuação AGREE geral para o presente método analítico foi registrada como 0.91, indicando o excelente método analítico verde paraHDQquantificação.

4. Conclusão

O método RP-HPTLC-densitometria foi desenvolvido para análise de HDQ em quatro diferentes CWCs de HDQ. O presente ensaio RP-HPTLC foi validado para diferentes parâmetros de validação. O presente método analítico foi altamente sensível, rápido e ecologicamente sustentável paraHDQanálise. A pontuação AGREE para o presente método analítico sugeriu um excelente ensaio analítico para quantificação de HDQ. O presente RO método P-HPTLC foi adequado para análise HDQ em quatro CWCs diferentes. Esses resultados indicaram que o presente ensaio analítico pode ser aplicado para análise de HDQ em diferentes preparações cosméticas e farmacêuticas.