Extrato de Herba Cistanche melhora o status de glutationa mitocondrial e a respiração em corações de ratos, com possível indução de proteínas desacopladoras

Introdução

A reperfusão de um miocárdio previamente isquêmico causa uma série de alterações mitocondriais, incluindo aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), Ca2+sobrecarga e declínio na produção de trifosfato de adenosina (ATP), os quais podem levar à necrose e / ou morte celular mediada por apoptose (Redegeld et al., 1992; Lemasters et al., 1998). Como as mitocôndrias desempenham um papel crucial na determinaçãoAo determinar o destino dos cardiomiócitos após um desafio de isquemia/reperfusão (I/R), a proteção contra lesão de I/R miocárdica deve, portanto, ser direcionada para a preservação da integridade estrutural e funcional mitocondrial. A manutenção do metabolismo energético mitocondrial após o desafio de I/R é particularmente importante porque a função contrátil do coração é quase inteiramente dependente do ATP gerado pelas mitocôndrias. Os cardiomiócitos que estão vivos, mas não se contraem, são de muito pouca utilidade.

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA AUMENTAR A IMUNIDADE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, toda a planta seca deCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae), é uma planta parasita que cresce principalmente nas áreas desérticas do norte e nordeste da China. Herba Cistanche, classificada como uma erva "revigorante do Yang" na medicina chinesa, é prescrita para deficiência renal, esterilidade feminina e constipação decorrente de secura intestinal em pacientes senis (Chen, 1998). Estudos anteriores em nosso laboratório mostraram que um metanolextrato de Herba Cistancheaumenta a capacidade de geração de ATP miocárdica (Leung & Ko, 2008) e protege contra lesão de I/R miocárdica em ratos (Leung, 2006). Enquanto a estimulação da capacidade de geração de ATP foi acompanhada pelo aumento no transporte de elétrons mitocondriais (Leung & Ko, 2008), a cardioproteção contra lesão I/R proporcionada pelo tratamento com Herba Cistanche foi associada a uma diminuição na depleção de ATP miocárdica (Leung, 2006). No presente estudo, para definir o papel das mitocôndrias na ação cardioprotetora do Herba Cistanche, investigamos o efeito do tratamento com Herba Cistanche no status de glutationa mitocondrial, conteúdo de Ca 2+, potencial de membrana e taxa de respiração, em corações de ratos .

Materiais e métodos

Material fitoterápico

Herba Cistanche foi comprada de um revendedor de ervas local (com sede em Hong Kong) (Lee Hoong Kee). A erva foi autenticada pelo fornecedor e um exemplar de voucher (HKUST00301) foi depositado no Departamento de Bioquímica da Universidade de Ciência e Tecnologia de Hong Kong (HKUST). A extração de metanol da erva foi conduzida, com base em estudos anteriores indicando que tal extrato melhorou a geração de ATP mitocondrial e protegeu contra lesões de I/R em corações de ratos (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Resumidamente, Herba Cistanche (400 g) foi cortada em pequenos pedaços e extraída por aquecimento sob refluxo em 300mL de metanol a 60 graus por 2h, conforme descrito anteriormente (Leung & Ko, 2008). O procedimento foi repetido duas vezes. O extrato reunido foi seco evaporando o solvente sob pressão reduzida; o rendimento foi de 42% (m/m) em relação à quantidade de erva bruta. O extrato foi armazenado a 4 graus até o uso. Embora as ervas chinesas sejam tradicionalmente extraídas com água para consumo oral, o metanol foi utilizado em nosso estudo anterior por conveniência no processamento e armazenamento de amostras (Yim & Ko, 2002), e descobrimos que a extração do metanol é satisfatória em todos os aspectos.

Cuidados com animais e tratamento medicamentoso

Ratos Sprague-Dawley fêmeas adultas (8 a 10 semanas de idade; 200 a 230 g) foram alojados em uma sala com umidade controlada, com ciclo escuro / claro de 12 horas, a aproximadamente 22 graus, e receberam comida e água ad libitum. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em grupos diferentes, com cinco animais em cada grupo. Os ratos receberamExtrato de Erva Cistancheintragastricamente ({{0}},2 g/mL em água) a 0,5g/kg ou 1,0 g/kg por 3 dias consecutivos. Os animais de controlo (não tratados) receberam apenas água. Vinte e quatro horas após a última dosagem, foi obtido tecido ventricular cardíaco de animais anestesiados para análise bioquímica. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Prática de Pesquisa, HKUST.

Preparação de frações mitocondriais

Tecidos ventriculares cardíacos picados (~{{0}}.6g) foram homogeneizados em um excesso de 10- vezes (p/v) de tampão de sacarose gelado [sacarose 0,32M, ácido etilenodiaminotetracético 1mM (EDTA), Tris/HCl 50 mM; pH 7,4] usando um homogeneizador de vidro Teflon, a 4000 rpm, com 25–30 golpes. Pelotas mitocondriais foram preparadas a partir de homogenatos de tecido por centrifugação a 800xg a 4 graus por 30 min, e a pureza foi determinada pela medição das atividades específicas relativas de succinato desidrogenase e lactato desidrogenase no sobrenadante e pellet, respectivamente, como descrito anteriormente (Evans, 1992). Pelotas mitocondriais foram suspensas em 1mL de tampão de homogeneização.

Medição dos níveis de glutationa reduzida mitocondrial e de glutationa oxidada

Os níveis de glutationa reduzida mitocondrial (GSH) foram determinados enzimaticamente usando 5,59-ditiobis(2- ácido nitrobenzóico) (DTNB) e glutationa redutase (GR), em um protocolo modificado de Griffith (198{{17} }). Uma alíquota (210 µL) da fração mitocondrial foi misturada com 90 µL de 10% (v/v) 5-ácido sulfossalicílico (SSA) e o a mistura foi centrifugada a 600xg por 10 min. Para medir os níveis de glutationa oxidada (GSSG), quantidades de 100 µL de sobrenadantes de SSA foram misturadas com 10 µL de 20% (p/v) 2-vinilpiridina e 10 µL de trietanolamina 60% (v/v) em tubos de microcentrífuga. Cada tubo foi deixado em repouso à temperatura ambiente por pelo menos 1 hora. Uma mistura de reação contendo DTNB 0,63 mM e NADPH 0,053 mM (fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina reduzido) em tampão fosfato (0,1 M, com Na2EDTA 5 mM; pH 7,5) foi pré-incubada a 30 graus por 2 min. Uma alíquota (30 µL) de um sobrenadante de amostra de SSA (glutationa total) ou de uma amostra de GSSG foi adicionada a um poço de uma placa de microtitulação de 96-poços e 180 µL de mistura de reação pré-aquecida, contendo 0,525U/ mL GR, foi adicionado em seguida. As alterações de absorvância a 412 nm foram monitorizadas espectrofotometricamente durante 5 min. As concentrações de GSH e GSSG foram estimadas a partir de curvas de calibração usando GSH e GSSG [dissolvido em 3% (p/v) SSA] como padrões e expressas como nmol/mg de proteína. Os níveis de GSH foram estimados subtraindo-se duas vezes a quantidade de GSSG da quantidade total de GSH.

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA MELHORAR A FUNÇÃO SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Medição do conteúdo mitocondrial de Ca2+

O conteúdo mitocondrial de Ca{{0}} foi medido usando uma sonda de fluorescência sensível a Ca2+-, Fluo-5N AM éster (Molecular Probes, Eugene, OR) empregando o Victor2 Multi-Label Counter (Modelo 1420; PerkinElmer, Turku, Finlândia), conforme descrito em Menze et al. (2005). As constantes de dissociação de Ca 2+ (valores de Kd) foram determinadas usando um kit de calibração de Ca 2+ válido na faixa de concentração de 1 a 1000 µM; os valores estimados de Kd foram de 90 a 100 µM, com alta confiabilidade, de acordo com dados do fabricante do kit. Uma alíquota (25 µL) da fração mitocondrial (0,5 mg de proteína/mL de concentração final) foi misturada com 25 µL de tampão de incubação {KCl 100 mM e MOPS 30 mM [3- ácido (N-morfolino) propanossulfônico]; pH7,2} em uma placa de microtitulação preta com 96-poços. A mistura foi incubada a 25 graus durante 15 min; 25 µL de digitonina (50 µg/mL) e 25 µL de éster Fluo-5N AM (1 µM em 0,005% (p/v) Pluronic F-127) foram então adicionados. Ao facilitar a permeação da membrana, a digitonina mediou a entrada mitocondrial do corante fluorescente. Descobrimos que os níveis de Fluo-5N em preparações mitocondriais de coração de rato aumentaram 20- vezes na presença de digitonina. As misturas de reação foram incubadas a 25 graus por 30 minutos e as leituras de fluorescência foram medidas em um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 532 nm. O conteúdo mitocondrial de Ca2+ foi estimado usando uma curva de calibração e expresso como µmol/mg de proteína.

Medição do potencial de membrana mitocondrial

O potencial de membrana (ΔΨm) foi avaliado por método modificado daquele de Bonavita et al. (2003), usando um corante fluorescente, a sonda catiônica lipofílica 5.596,69- tetracloro-1,193,39-iodeto de tetraetilbenzimidazolilcarbocianina, comumente denominado JC-1. Alíquotas (50 µL) de frações mitocondriais (ajustadas para 1mg de proteína/mL) foram incubadas a 37 graus com 50 µL de solução de substrato (contendo piruvato 6mM e malato 6mM), 25 µL de solução pré-tratada de difosfato de adenosina (ADP) (30mM), e 25 µL de 3 µM JC-1, no escuro. Os valores de ΔΨm foram obtidos medindo a fluorescência em 535nm (FL1) versus 580nm (FL2), utilizando o contador Victor2 MultiLabel. JC-1 forma agregados nas mitocôndrias, resultando em altos valores de fluorescência de FL2 e indicando potencial mitocondrial normal. A perda de ΔΨm leva a uma redução na fluorescência de FL2 (JC-1 agregados em menor extensão) e um aumento concomitante na fluorescência de FL1 (a partir de monômeros JC-1). Os dados foram expressos como proporções de valores de fluorescência FL1/FL2. Cianeto de carbonila m-clorofenilhidrazona (CCCP), um agente colapsante de ΔΨm, foi usado para validar o ensaio.

Medição da respiração mitocondrial

A taxa de respiração mitocondrial foi medida a 37 graus usando um instrumento Hansatech Oxygraph-Plus equipado com um eletrodo de oxigênio tipo Clark (Sarasota, FL, EUA). Frações mitocondriais (0,6mg de proteína/mL) foram suspensas em tampão respiratório contendo KCl 125mM, MOPS 20mM, Tris 10mM, ácido etilenoglicol tetraacético (EGTA) 0,5mM e KH2PO4 2mM; pH 7,2. Após incubação a 37 graus por 2 minutos, cada amostra recebeu 50 µL de solução de substrato (piruvato 5mM e malato 5mM). As taxas de respiração foram medidas na presença (Estado 3) de 1 mM de ADP e após a fosforilação de todo o ADP em ATP (Estado 4). A proporção das taxas de respiração do Estado 3: Estado 4 é o índice de controle respiratório, que indica a rigidez do acoplamento entre a respiração e a fosforilação (Javadov et al., 2005; Kuwabara et al., 1997). Antes da adição da solução de substrato, a taxa respiratória do Estado 1 foi medida até o início da respiração do Estado 2, e a taxa respiratória do Estado 2 foi estimada antes da adição de ADP.

Análise estatística

Os dados foram analisados ​​por análise de variância unidirecional (ANOVA) para comparações de múltiplos grupos. Os valores de diferença menos significativa (LSD) foram usados ​​para identificar diferenças significativas entre os dois grupos quando os valores de p foram < 0,05.

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA MELHORAR A FUNÇÃO SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Resultados

Como mostrado nas Figuras 1 e 2, o tratamento com metanolextrato de Herba Cistanche({{0}},5 ou 1,0g/kg/dia×3) melhorou significativamente o status de glutationa mitocondrial em corações de ratos, como evidenciado por aumentos dependentes da dose nos níveis de GSH (11–30%) e diminuições em Níveis de GSSG (31%).

O tratamento com Herba Cistanche diminuiu de forma dose-dependente os níveis mitocondriais de Ca2+ em corações de ratos em comparação com controles; a supressão foi de 41% na dose de 1,0 g/kg (Figura 3).

O tratamento com Herba Cistanche aumentou o ΔΨm mitocondrial, como evidenciado por uma diminuição (14–16%) na relação FL1/FL2. CCCP (100 µM) causou colapso de ΔΨm, conforme indicado por um aumento na relação FL1/FL2 (Figura 4).

Tratamento Herba Cistancherespiração mitocondrial melhorada, como evidenciado por uma taxa significativamente maior de respiração no Estado 3 (84%) em animais de teste em comparação com controles (Tabela 1). Os níveis respiratórios do Estado 2 e do Estado 4 aumentaram em 47 e 80%, respectivamente, mas a estimulação da respiração do Estado 4 foi completamente suprimida por guanosina-5'-difosfato 1mM, um inibidor da proteína desacopladora 2/3. O tratamento com Herba Cistanche não afetou o índice de controle respiratório, estimado pela razão entre as taxas respiratórias do Estado 3/Estado 4.

Discussão

As mitocôndrias isoladas de corações de ratos tratados com Herba Cistanche mostraram aumento do status de glutationa, conforme indicado pelo aumento dos níveis de GSH e diminuição dos níveis de GSSG. A manutenção do status redox da glutationa mitocondrial é crítica para a cardioproteção contra lesões de I/R (Chiu & Ko, 2003). O conteúdo citosólico de Ca2+ aumenta durante a isquemia miocárdica, por meio da captação pelo uniportador de Ca2+ da membrana interna (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990), levando ao Ca mitocondrial{{6} } acumulação. Nossos resultados indicam que o tratamento com extrato de Herba Cistanche melhorou o status redox da glutationa mitocondrial e diminuiu o nível de Ca 2+ mitocondrial, o que pode proporcionar proteção contra lesão de I/R miocárdica (Leung, 2006). A incapacidade do tratamento com Herba Cistanche, em uma dose mais elevada de 1,0 g/kg, de diminuir ainda mais os níveis de GSSG e Ca2+, pode estar relacionada à existência de um mecanismo regulatório autolimitado que afeta o potencial redox da glutationa e o status do cálcio nas mitocôndrias.

As mitocôndrias geram um gradiente eletroquímico de prótons através da membrana interna, por transporte de elétrons. Este gradiente é usado pela ATP sintase para fosforilar ADP em ATP. A diminuição do potencial da membrana mitocondrial, como na hipóxia/reoxigenação após lesão de cardiomiócitos cultivados (Chiu et al., 2008), resulta em uma redução na geração de ATP. O tratamento com Herba Cistanche, que pode aumentar o potencial da membrana mitocondrial miocárdica, possivelmente aumenta a geração de ATP, particularmente durante a reperfusão pós-isquêmica. Mais uma vez, a existência de um mecanismo regulador autolimitado pode explicar porque os efeitos do tratamento com Herba Cistanche no potencial da membrana mitocondrial não são dependentes da dose.

O tratamento com Herba Cistanche aumentou muito a taxa respiratória do Estado 3 nas mitocôndrias do coração de ratos, conforme avaliado pelo consumo de oxigênio. Este achado é consistente com os resultados obtidos a partir de medições in vitro e situ da capacidade de geração de ATP mitocondrial (Leung & Ko, 2008). Curiosamente, embora o tratamento com Herba Cistanche tenha reduzido o nível de estado estacionário de ATP miocárdico (dados não mostrados), o tratamento melhorou a geração de ATP mitocondrial. O envolvimento da respiração desacoplada pode explicar essas observações discrepantes. A fosforilação oxidativa desacoplada ocorre quando os prótons são movidos através da membrana interna mitocondrial de volta à matriz mitocondrial, dissipando assim o potencial de membrana formado pela cadeia de transporte de elétrons. Isso resulta em uma redução da força motriz de prótons que impulsiona a formação de ATP (Garvey, 2003). Como consequência, a concentração de Ca2+ e a produção de ERO nas mitocôndrias são dramaticamente atenuadas (Teshima et al., 2003). Esta sugestão é consistente com os resultados do presente estudo, que mostrou uma diminuição nos níveis mitocondriais de Ca2+ em corações tratados com Herba Cistanche. No que diz respeito à respiração desacoplada, a síntese de proteínas desacopladoras (UCPs) pode ser induzida pelo tratamento com Herba Cistanche. Sabe-se que as UCPs desacoplam a fosforilação oxidativa e a expressão de UCP1 em corações de camundongos transgênicos protegidos contra dano miocárdico induzido por I/R (Hoerter et al., 2004). O efeito de desacoplamento das UCPs foi inibido por difosfatos e trifosfatos de nucleotídeos de purina (como ADP, ATP, difosfato de guanosina (GDP) e GTP) (Echtay et al., 2002). No presente estudo, parâmetros mitocondriais como potencial de membrana e taxa respiratória foram medidos na presença de ADP (como substrato); o efeito de desacoplamento das UCPs foi, portanto, inibido. No entanto, quando a taxa de respiração mitocondrial do Estado 4 foi medida na ausência de ADP, esta taxa foi mais elevada nas mitocôndrias preparadas a partir de corações tratados com Herba Cistanche do que em corações de controlos não tratados. A taxa respiratória do Estado 4 reflete o consumo de oxigênio pelas mitocôndrias quando os prótons vazam de volta para a matriz mitocondrial por meio de um mecanismo que não envolve F1 F0 -ATPase (Garvey, 2003). O possível envolvimento das UCPs no aumento induzido por Herba Cistanche na respiração do Estado 4 é apoiado pela descoberta de que este aumento foi suprimido pelo PIB (Bento et al., 2007).

Em conclusão, o tratamento com Herba Cistanche pode melhorar o status de glutationa mitocondrial, diminuir o nível de Ca{0}} mitocondrial e aumentar o potencial da membrana mitocondrial e a taxa de respiração em corações de ratos. O aumento do status de glutationa mitocondrial e da capacidade funcional, e a suposta indução de UCPs, podem estar relacionados à cardioproteção proporcionada porTratamento Herba Cistancheapós lesão de I/R.

EXTRATO NATURAL DE CISTANCHE TUBULOSA PLANTA CISTANCHE PHGS75% ECH 30% ACT 12%