Síntese verde e caracterização de nanopartículas de ferro sintetizadas a partir do extrato aquoso da folha de Vitex Leucoxylon e suas aplicações biomédicas

Abstrato:O método de extração a frio foi utilizado para obter o extrato aquoso deVitex leucoxylonsai na proporção de 1:10. Nanopartículas de ferro (FeNPs) foram sintetizadas usando extrato aquoso de folhas deV. leucoxyloncomo agente redutor. A abordagem fitoterápica foi usada para fazer FeNPs misturando 1 mL de extrato vegetal com 1 mM de sulfato férrico. Microscopia eletrônica de varredura (SEM), espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis) e espectroscopia de raios-X de energia dispersiva foram usados ​​para examinar as FeNPs sintetizadas. A reação redutora foi evidenciada por uma mudança na cor da solução, e a formação de cor preta confirma que FeNPs foram formados. O maior pico de absorção (max) foi encontrado em 395 nm na análise espectral UV-Vis. O espectro FTIR deV. leucoxylono extrato aquoso das folhas apresentou deslocamentos em alguns picos, ou seja, 923,96 cm−1 e 1709,89 cm−1, com grupos funcionais ácidos carboxílicos, aldeídos insaturados e cetonas, que estavam ausentes no espectro FTIR de FeNPs e são responsáveis ​​pela formação de FeNPs. FeNPs com diâmetros entre 45 e 100 nm foram observados em imagens SEM. A criação de FeNPs foi confirmada pelo EDX, que mostra um forte sinal na região do ferro metálico em 6–8 Kev. XRD revelou uma natureza cristalina e um diâmetro médio de 136,43 nm.Antioxidante,anti-inflamatório, citotóxica ecicatrização de feridastestes in vitro relataram atividade significativa das FeNPs. Os achados cumulativos do presente estudo indicam que a síntese verde de FeNPsaumenta sua atividade biológicae pode servir comoum possível agente de cicatrização de feridas dérmicaseagente citotóxico contra o câncer. Estudos futuros são necessários para a identificação dos mecanismos envolvidos na síntese de FeNPs porV. leucoxylone suas aplicações biomédicas.

Palavras-chave:Vitex leucoxilon; nanopartículas de ferro; SEM; cicatrização de feridas; citotóxico

CISTANCHE BENEFÍCIOS PARAANTIOXIDANTE,ANTI-INFLAMATÓRIO, CITOTÓXICO ECICATRIZAÇÃO DE FERIDAS

1. Introdução

A aplicação da nanotecnologia em ciência e tecnologia para fabricar novos materiais em nanoescala é um campo em rápido crescimento [1]. A nanotecnologia lida com a fabricação de materiais em nível atômico para obter propriedades distintas, que podem ser manipuladas para aplicações preferidas. Este campo está crescendo rapidamente com suas aplicações em ciência e tecnologia para fabricar novos materiais em nível de nanoescala [2]. Vários setores industriais adotaram a nanotecnologia nos últimos anos devido às suas aplicações nos campos de sistemas de armazenamento eletrônico [3], biotecnologia [4], separação magnética e pré-concentração de analitos alvo, entrega de drogas direcionadas [5] e veículos para genes e drogas parto [3,5,6]. Consequentemente, essas partículas têm o potencial de causar um impacto substancial na sociedade como resultado da ampla gama de aplicações para as quais podem ser usadas. As nanopartículas (NPs) são massas de partículas com tamanho inferior a cem nanômetros e são consideradas massas estruturais essenciais no campo da nanotecnologia. A maior atividade dos NPs é tanto sua característica definidora quanto a qualidade pela qual eles são mais notáveis ​​[7]. NPs orgânicos e inorgânicos são as duas classificações primárias que podem ser aplicadas às nanopartículas. As nanopartículas inorgânicas podem incluir NPs magnéticos, NPs de metais nobres (como ouro e prata) e NPs semicondutores (como dióxido de titânio e óxido de zinco). As nanopartículas orgânicas podem incluir NPs de carbono. As nanopartículas inorgânicas estão atraindo grande atenção porque oferecem propriedades materiais superiores, além de versatilidade funcional. Eles têm sido investigados como possíveis ferramentas para imagens médicas, bem como para o tratamento de doenças devido às características de tamanho que possuem [8]. As diversas propriedades químicas, físicas e biológicas das NPs são fortemente influenciadas por uma variedade de parâmetros, incluindo o tamanho e a morfologia das nanopartículas, bem como o revestimento da superfície, que normalmente são determinados durante a síntese das nanopartículas. A perda da atividade biológica pretendida é causada por uma diminuição na estabilidade coloidal. pH, força iônica e uma série de proteínas que interagem com AgNPs em circunstâncias relevantes têm impacto na estabilidade coloidal. Como resultado, a seleção adequada da técnica de síntese é crítica para obter as características de partículas desejadas para aplicações específicas [9].

Atualmente, existe uma grande variedade de NPs que podem ser sintetizadas usando uma variedade de processos físicos, químicos, biológicos e híbridos. De acordo com as descobertas de um grande número de pesquisas, os processos físicos e químicos para a produção de nanopartículas incluem o uso de solventes orgânicos, compostos perigosos, quantidades significativas de energia e agentes estabilizantes que não são biodegradáveis ​​[10]. Portanto, no campo da nanotecnologia verde, a síntese de NPs usando materiais naturalmente disponíveis, como extratos de plantas, vários microorganismos, seus metabólitos e algumas substâncias húmicas naturais [11,12] como agentes redutores e de capeamento está se tornando cada vez mais popular. Métodos de síntese amigáveis ​​ao meio ambiente têm sido usados ​​para produzir uma grande variedade de nanopartículas metálicas, incluindo prata, ouro, ferro, cobre e zinco. O desenvolvimento de métodos fáceis e ambientalmente aceitáveis ​​para a síntese de NPs é um dos principais focos da nanotecnologia. Biomateriais como microrganismos e extratos de plantas podem ser utilizados no processo de preparação de uma grande variedade de NPs [13,14]. No entanto, como alguns organismos são patógenos, é perigoso manipulá-los. Para prosperar, os microrganismos precisam ser mantidos em cultura e submetidos a condições cuidadosamente controladas, incluindo temperatura, pH e outros parâmetros. Por eliminar o trabalhoso processo de manutenção da cultura microbiana, a síntese de NPs usando partes de plantas pode às vezes ser mais vantajosa do que outros processos biológicos [15]. Como resultado, tem atraído muita atenção devido às suas características inerentes, que incluem a utilização de recursos naturais, rapidez, ecologia e benignidade. Essas características atraentes são absolutamente necessárias para uso em aplicações médicas. As nanopartículas produzidas pela síntese verde têm tamanho bem definido e controlado, são livres de poluentes e o método é simples de escalar. Estes são alguns dos benefícios adicionais da síntese verde [16]. A atividade biológica das nanopartículas sintetizadas é amplamente determinada e ajustada pelos materiais verdes utilizados para a estabilidade e redução de íons metálicos. Uma das propriedades ideais das NPs deve ser a capacidade excepcional de discriminar alvos potenciais (patógenos) e células de mamíferos (hospedeiras) [17].

Por conta disso, o extrato aquoso das folhas de V. leucoxylon foi investigado quanto ao seu potencial para facilitar a formação de nanopartículas de ferro (FeNPs) na atual pesquisa. O ferro é um dos elementos que podem ser encontrados em maior abundância na Terra. Recentemente, passou a ser reconhecida como uma nova classe de NPs importantes devido ao fato de possuir uma variedade de propriedades únicas, incluindo alta coercitividade e superparamagnetismo. Cataly sis, dispositivos eletrônicos, armazenamento de informações, sensores, tecnologia de entrega de drogas, biomedicina, dispositivos de gravação magnética e limpeza ambiental são apenas algumas das muitas aplicações intrigantes que fizeram uso de FeNPs [18]. Além disso, de acordo com vários estudos, as FeNPs podem ser criadas a partir de vários extratos de plantas. Esses extratos vegetais incluem folha de Eucalyptus globulus [19], folha de romã [20] e cinza de casca de banana [21]. A planta V. leucoxylon, que foi utilizada no presente estudo, é um membro da família Verbenaceae. Também é conhecida como a árvore casta de cinco folhas (Kannada: Sengeni, Holenekki, Hollalakki) e pode ser encontrada na região ao longo das margens dos rios em florestas perenes e semi-perenes e florestas decíduas úmidas ao longo dos riachos. Pode atingir uma altura de até 20 m e é classificada como uma árvore caducifólia modesta a grande. Ao longo das florestas dos Gates Ocidentais da Índia, pode ser encontrado em grande número. Foi relatado que a infusão de extrato de folhas de V. leucoxylon possui uma ampla variedade de atividades farmacológicas, como atividades anti-inflamatórias, antioxidantes, antipsicóticas, antidepressivas, antiparkinsonianas e anti-hiperlipidêmicas [22]. Os produtos naturais têm, ao longo da história e particularmente na medicina popular, sido utilizados para o tratamento de uma ampla variedade de doenças e enfermidades. Esta prática remonta aos tempos antigos. Os métodos de química de produtos naturais que existem há muito tempo tornaram possível encontrar uma enorme variedade de metabólitos secundários bioativos provenientes de fontes terrestres e marinhas. Um número significativo dessas substâncias de ocorrência natural está sendo considerado para uso como potenciais produtos farmacêuticos [23].

Há um grande número de substâncias químicas e nutrientes naturais que ainda não foram descobertos e que são úteis para a humanidade. Como consequência disso, há uma demanda imediata por pesquisa e desenvolvimento de opções terapêuticas inovadoras que possam ser utilizadas com sucesso em intervenções terapêuticas, criando uma quantidade mínima de efeitos adversos.

O processo de síntese verde atualmente sugerido para FeNPs é distinto e econômico. No estudo atual, foi feita uma tentativa de criar nanopartículas à temperatura ambiente sem o uso de quaisquer produtos químicos ou técnicas físicas. A planta Vitex leucoxylon foi escolhida em um esforço para sintetizar nanopartículas de ferro, e modelos in vitro sistemáticos abrangentes foram realizados para avaliar a potência das nanopartículas de ferro. Apenas um número limitado de estudos de pesquisa sobre o conceito de nanopartículas e suas aplicações biomédicas foi publicado nesta planta. Como consequência, decidimos que seria benéfico realizar esta pesquisa com os seguintes objetivos em mente: triagem de fitoquímicos e medição do número de metabólitos secundários em V. leucoxylon; síntese verde e caracterização de FeNPs de V. leucoxylon; estudo comparativo dos efeitos antioxidantes e antiinflamatórios de V. leucoxylon e suas FeNPs in vitro; atividade citotóxica in vitro do extrato aquoso das folhas de V. leucoxylon e suas FeNPs contra câncer de pele, pulmão e boca; atividade cicatrizante in vitro do extrato aquoso das folhas de V. leucoxylon e suas FeNPs sintéticas por ensaio de raspagem.

2. Materiais e métodos

2.1. Coleta de material vegetal

No mês de março de 2022, folhas frescas de V. leucoxylon foram colhidas na área da floresta Anshi dos Gates Ocidentais no distrito de Uttar Kannada, no estado de Karnataka, na Índia. As folhas foram identificadas e autenticadas pelo Dr. Kotresha K., Taxonomista, Departamento de Botânica, Karnataka Science College, Dharwad; Karnataka, referindo-se ao espécime depositado no Departamento de Botânica, Karnataka Science College, Dharwad, Karnataka. Depois de coletadas, as folhas frescas da planta foram lavadas em água corrente, secas ao sol e, em seguida, moídas em pó grosso usando um moedor mecânico. O pó foi mantido em recipientes lacrados à temperatura ambiente para posterior utilização no processo de extração com solvente bruto.

2.2. Preparação de Extrato Vegetal

Usando um dispositivo Soxhlet, 25 g de folhas em pó foram extraídas por 48 h com 250 mL de água destilada. O extrato aquoso foi concentrado em rotoevaporador, sendo então seco em dessecador antes de ser mantido em frasco fechado a 4 ◦C até o uso. Para a síntese de FeNPs, o extrato aquoso foi utilizado como agente redutor e estabilizador.

2.3. Solventes e Reagentes

Todos os produtos químicos e solventes empregados eram de qualidade analítica e foram adquiridos da Hi-media (Hubli, Índia).

2.4. Análise Fitoquímica

Seguindo o procedimento descrito por Deepti et al. (2012), o extrato bruto aquoso da folha de V. leucoxylon foi testado qualitativamente quanto à presença de vários constituintes fitoquímicos, como flavonoides, alcalóides, fenóis, glicosídeos, esteróis, ligninas, saponinas, antraquinonas, taninos e açúcares redutores [24].

2.5. Síntese de Nanopartículas de Ferro

Primeiro, 1 mL de extrato aquoso de folha de V. leucoxylon foi adicionado a 10 mL de solução aquosa de FeSO4 0,05 mM e a mistura foi agitada. À temperatura ambiente e em ambiente escuro, foi realizado todo o processo de mistura de reação. A reação de oxidação/redução era claramente visível depois que a mistura de reação incolor foi incubada e reagiu pelo tempo necessário [25]. A fim de remover quaisquer vestígios de extrato aquoso das FeNPs recém-sintetizadas, que foram deixadas para secar em pó após centrifugação a 10,000 rpm por dez 10 min durante o período de reação desejado, a mistura aquosa contendo FeNPs foi centrifugada uma segunda vez e redispersos em água bidestilada e secos [26].

2.6. Caracterização de FeNPs

Vários métodos, como espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis), espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier (FTIR), microscopia eletrônica de varredura e espectroscopia de raios X por energia dispersiva, difração de raios X (XRD), analisador de tamanho de partícula e zeta potencial, foram utilizadas para caracterizar as FeNPs.

2.6.1. Análise Baseada em Espectroscopia UV-Visível

Primeiro, alíquota de 1 mL de solução coloidal de FeNPs em cubetas de quartzo foi avaliada usando espectroscopia UV-visível (U-3310, Hitachi, Tóquio, Japão), usando água destilada como referência e 0,05 mM FeSO4 como um branco, para validar a redução dos íons férricos na solução coloidal [27].

2.6.2. Análise baseada em FTIR

Os grupos funcionais (grupos) que estavam ligados na superfície do ferro e estavam envolvidos na síntese de FeNPs foram identificados usando espectroscopia FTIR (S700, Nicolet, MA, EUA), [28]. Após 72 h de incubação, os FeNPs foram isolados por centrifugação repetida (3-4 vezes) das misturas de reação a 10,000 rpm por 15 min. O sobrenadante foi substituído por água deionizada e o pellet foi armazenado como pó. Depois de secas, as FeNPs foram submetidas à análise de FTIR pelo processo de peletização com brometo de potássio na proporção de 1:100.

2.6.3. Análise baseada em microscopia eletrônica de varredura

Microscopia eletrônica de varredura (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, EUA) foi usada para examinar as nanopartículas e estabelecer sua forma de superfície. Os substratos foram preparados em um substrato limpo de Si de 5 mm x 5 mm, clivado de um wafer de 100 mm de diâmetro. O substrato foi deixado reagir por 2 h a 6 h e a amostra foi preparada por centrifugação de uma solução coloidal a 10,000 rpm por 5 min. O pellet foi seco após várias centrifugações, sendo novamente disperso em água deionizada e o procedimento repetido. Por fim, obteve-se o pellet seco, que foi posteriormente submetido à caracterização estrutural por análise SEM de acordo com o procedimento descrito pelo Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia, NIST-2007 [29].

2.6.4. Raio X Dispersivo de Energia

Após a secagem em uma grade de cobre revestida com carbono, as FeNPs reduzidas foram analisadas usando EDX (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, EUA), o que também permitiu a determinação da composição elementar.

2.6.5. Potencial Zeta

Observações de NPs O potencial zeta é uma ferramenta útil para obter informações adicionais sobre a estabilidade dos NPs coloidais. A amplitude do potencial zeta fornece uma pista sobre a possível estabilidade do colóide. Segundo Melendrez et al. (2010), as partículas são consideradas estáveis ​​se seus valores de potencial zeta forem mais positivos do que mais de 30 mV ou mais negativos do que 30 mV [30]. Este fato deve ser levado em consideração. O medidor zeta a laser foi utilizado para adquirir leituras dos potenciais zeta de superfície (Malvern zeta seizer 2000, Malvern, Reino Unido). As amostras líquidas das nanopartículas, totalizando 5 mililitros, foram diluídas com 50 mililitros de água bidestilada, e 2 mm por metro quadrado de cloreto de sódio foi usado como solução eletrolítica de suspensão. Em seguida, o pH foi modificado até atingir o nível desejado. As amostras foram agitadas por um total de 30 min. Após agitar o recipiente, anotou-se o pH em equilíbrio e determinou-se o potencial zeta das partículas metálicas. Para determinar o potencial de superfície das FeNPs, foi utilizado o potencial zeta. Em cada caso, o valor declarado foi a média dos resultados de três medições individuais. Quando os valores do potencial zeta variaram de mais de 30 mV a menos de 30 mV, os critérios para a estabilidade das NPs foram determinados [31].

2.6.6. Analisador de tamanho de partícula

Para determinar o tamanho da partícula da amostra, o teste de PSA foi realizado sobre ela após ter sido liofilizada e depois dispersada usando um ultrasonicador (SZ-100, Horiba, Kyoto, Japão).

2.6.7. Análise de Difração de Raios-X (XRD)

As nanopartículas de ferro sintetizadas a partir do extrato aquoso das folhas de V. leucoxylon foram submetidas à análise XRD (Smart Lab SE, Rigaku, Tóquio, Japão) para determinar a natureza, bem como o tamanho médio das nanopartículas.

2.7. Determinação da atividade antioxidante usando métodos in vitro

2.7.1. Ensaio de poder antioxidante de redução de íons férricos (FRAP)

De acordo com Oyaizu (1986), com uma pequena modificação, o poder redutor dos íons férricos foi avaliado [32]. Por 30 min a 50 ◦C, 2,5 mL de tampão fosfato 20 mM e 2,5 mL de ferricianeto de potássio a 1 por cento foram adicionados a 2,5 mL de extrato de folha de V. leucoxylon e seus FeNPs sintetizados misturados com A combinação. Após o período de incubação, a mistura foi suplementada com 2,5 mL de ácido tricloroacético a 10 por cento p/v e 0,5 mL de cloreto férrico a 0,1 por cento p/p antes de ser incubada por mais 10 minutos. Finalmente, um espectrofotômetro UV-V foi usado para detectar a absorbância em 700 nm. Como padrão, foi utilizado o ácido ascórbico. Cada amostra foi testada três vezes.

2.7.2. Ensaio de eliminação de peróxido de hidrogênio

Com base na capacidade do extrato aquoso das folhas de V. leucoxylon e suas FeNPs sintéticas de sequestrar o peróxido de hidrogênio, a atividade antioxidante desses compostos foi avaliada. Primeiro, {{0}},6 mL de tampão fosfato (pH—7,4) contendo 4 mM H2O2 foi adicionado a 0,5 mL de ácido ascórbico padrão em uma concentração conhecida, bem como tubos contendo extratos de plantas em várias concentrações variando de 100 µL a 500 µL (pH—7,4). Usando um tampão de fosfato e solução em branco sem peróxido de hidrogênio, avaliamos a absorbância da solução a 230 nm após 10 min. O tampão fosfato foi usado para criar o controle em vez da amostra ou padrão [33]. Cada amostra foi testada três vezes. A abordagem da fórmula foi usada para calcular a porcentagem de inibição.

2.7.3. Eliminação de radicais livres de DPPH

Ensaio O extrato de folha de V. leucoxylon e FeNPs sintetizados foram testados quanto à sua capacidade de eliminar radicais livres usando o radical DPPH como reagente [34]. As amostras foram combinadas com solução de radical DPPH (60 M) em etanol (100 µL) em diferentes concentrações (p/v). Um espectrofotômetro UV-Vis foi usado para medir a absorbância da mistura em 517 nm após 30 min de incubação no escuro à temperatura ambiente. O ácido ascórbico foi empregado como padrão para o experimento. A seguinte equação foi usada para determinar a atividade de eliminação de DPPH de cada amostra:

onde Ac representa a absorbância da reação controle, que é realizada misturando 100 L de etanol com 100 L da solução de DPPH, e At representa a absorbância da amostra teste. Os experimentos foram realizados em trigêmeos. O valor IC50 foi calculado para cada amostra. Um nível mais alto de atividade de radical livre foi indicado pela mistura de reação com uma absorção mais baixa.

2.7.4. Ensaio de Fosfomolibdênio (PM)

A atividade antioxidante total foi determinada usando Prieto et al., 1999, técnica padrão. Cada tubo de ensaio contendo 3 mL de água destilada e 1 mL de solução reagente de molibdato recebeu um extrato aquoso das folhas de V. leucoxylon e suas FeNPs em concentrações variadas, variando de 100 µL a 500 µL. Esses tubos foram incubados por 90 min a 95 ◦C. A absorbância da mistura de reação foi medida a 695 nm depois que esses tubos foram ajustados à temperatura ambiente por 20 a 30 minutos após a incubação. O padrão de referência foi o ácido ascórbico [35].

2.8. Avaliação da atividade anti-inflamatória in vitro

O efeito antiinflamatório do extrato aquoso das folhas de V. leucoxylon e suas FeNPs geradas foi avaliado usando o método de desnaturação de proteínas descrito por Elias et al., 1988, com pequenas modificações [36]. Como droga padrão, foi utilizado o diclofenaco sódico. Uma mistura de reação compreendendo 2 mL de concentração conhecida de FeNPs manufaturados (100 g/mL) com diclofenaco de sódio padrão (100 g/mL) e 2,8 mL de solução salina tamponada com fosfato (pH 6,4) foi misturada com 2 mL de ovo de galinha fresco albumina (1 mM) e incubados a 27 ± 1 ◦C por 15 min. A desnaturação foi induzida colocando a mistura de reação em banho-maria a 70 ◦C por 10 min. Após o resfriamento, a absorbância a 660 nm foi medida usando água bidestilada como branco. Cada teste foi realizado três vezes. A seguinte fórmula foi usada para calcular a porcentagem de inibição da desnaturação da proteína:

onde, Em=absorbância da amostra de teste; Absorvância Ac=do controle.

2.9. Determinação da atividade citotóxica e anticancerígena de nanopartículas de ferro usando o ensaio MTT

O efeito de V. leucoxylon e seus FeNPs sintetizados na viabilidade de células fibroblásticas não cancerígenas L292 e sua atividade anticancerígena em câncer de pele (A375), câncer de pulmão (A549) e câncer oral (KB-3-1) foi avaliado usando o ensaio MTT padrão, de acordo com Carmichael et al., (1987) [37]. Todas as linhas celulares foram obtidas do National Center for Cell Science (NCCS), Pune, Índia. Os valores de inibição percentual do crescimento celular (IC50) foram derivados usando curvas dose-resposta para cada linha celular, e a seguinte fórmula foi usada para calcular a inibição percentual do crescimento. A conversão de MTT em um produto formazano púrpura pela desidrogenase mitocondrial de células saudáveis ​​é a base deste experimento [38].

2.10. Estudo de cicatrização de feridas in vitro usando o teste de ensaio de arranhão

As capacidades de propagação e migração das células da linha celular L292 causadas por amostras com concentrações conhecidas de extrato vegetal e nanopartículas de ferro foram examinadas na presente investigação [39]. Placas de cultura de células animais com meio DMEM suplementado com 10 por cento de FBS e 2 por cento de antibiótico Pen-Strep (Darmstadt, Alemanha) foram usadas para iniciar o processo de cultura de células. Uma ponta de pipeta de plástico estéril foi usada para raspar o confluente de monocamada de células depois que elas cresceram para aproximadamente 50,000 células por mL. A solução de PBS foi usada para remover quaisquer detritos celulares indesejados. Como controle negativo, células não tratadas foram usadas, enquanto o ácido ascórbico padrão foi usado como controle positivo para amostras de polímero de concentração conhecida. Nas 24 horas seguintes, as células foram mantidas a 37 ◦C com 5% de CO2. Para o exame da migração celular relativa e fechamento da ferida, as camadas de células riscadas foram incubadas e fotografadas em intervalos variando de 0h a 6h a 12h e 24h. A calibração de medição do software MagVision (X64, 2016, Magnus, Nova Delhi, Índia) com resolução de 4 × foi usada para quantificar a distância do gap. Para determinar o fechamento da ferida e a taxa de migração, foi usada a fórmula mostrada abaixo:

com relação ao seguinte: A0h=área da ferida medida imediatamente após coçar; ATh=área da ferida medida após h horas; Rm=taxa de migração (µm/h); Wf=largura inicial da ferida (µm); e T=tempo de migração (hora).

2.11. Análise estatística

Os dados são apresentados como desvio padrão médio e erro padrão, e cada experimento foi realizado três vezes. O software SPSS versão 20 foi usado para realizar uma análise de variância (ANOVA) unidirecional nas diferenças nas pontuações médias existentes entre os grupos.

Peça mais:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: mais 86 15292862950

COMPRAR:

Disponível em: https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop