Glicosídeos de Cistanche Melhoram a Aprendizagem e a Memória no Modelo Rato de Demência Vascular

para mais informações:ali.ma@wecistanche.com

J. CHEN1,2, S.-N. ZHOU1, Y.-M. ZHANG2, Y.-L. FENG2, S. WANG2

1Departamento de Neurologia, Hospital Qilu da Universidade de Shandong, Jinan, China. & Brain Science Research Institute, Shandong University, Shandong, PR China

2Departamento de Neurologia, Hospital Popular da Região Autônoma da Mongólia Interior, PR China

Jin Chen e Yan-Mei Zhang contribuíram igualmente para este estudo

Abstrato.- OBJETIVO:Glicosídeos de Cistanche(GC) são extraídos de Xin JiangCistanche, que é amplamente utilizado como uma erva chinesa. Este estudo tem como objetivo avaliar os efeitos do GC na demência vascular (DV).

MATERIAIS E MÉTODOS: O modelo de VD foi estabelecido pela ligadura da artéria carótida comum bilateral em ratos Wistar adultos, que receberam administração ip diária de soro fisiológico, GC (10 mg/kg peso corporal/d, ip) ou oxiracetam (450 mg/kg de peso corporal/d, ip) por 14 dias. O teste Morris Water Maze avaliou o desempenho cognitivo dos ratos. O hipocampo foi dissecado e submetido à análise proteômica e imuno-histoquímica. RESULTADOS: O grupo GC apresentou latência de escape significativamente menor do que o grupo VD aos quatro e cinco dias após a cirurgia. Eles não mostraram diferença significativa quando comparados com o grupo sham-operado e o grupo controle com oxiracetam. No hipocampo, as 21 manchas protéicas do grupo GC apresentaram níveis de expressão diferentes em relação ao grupo VD. Isso incluiu as quatro proteínas que mostraram uma diferença significativa: três proteínas upregulated proteína 1 semelhante à tioredoxina, proteína quinase quinase 1 ativada por mitógeno de dupla especificidade e proteína 2 relacionada à dihidropiridinase (CRMP-2) e uma proteína glutationa sintetase regulada negativamente. A análise imuno-histoquímica mostrou que o nível de proteína P-tau foi significativamente maior no grupo modelo VD do que no grupo sham-operado (p < 0,05).="" após="" o="" tratamento="" com="" gc,="" o="" nível="" de="" proteína="" p-tau="" em="" ratos="" modelo="" vd="" apresentou="" uma="" diminuição="" significativa="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" vd="" tratado="" com="" solução="" salina="" (p="">< 0,05).="" conclusões:="" o="" gc="" desempenha="" um="" papel="" crítico="" na="" proteção="" dos="" neurônios="" hipocampais="" no="" vd,="" diminuindo="" a="" fosforilação="" da="" p-tau="" e="" aumentando="" o="" nível="" de="" expressão="" de="" crmp-2.="" a="" manipulação="" farmacoecológica="" do="" gc="" oferece="" uma="" nova="" oportunidade="" para="" o="" tratamento="" da="">

Palavras-chave:

Demência vascular, Glicosídeos de cistanche, Proteômica, P-tau, Proteína relacionada à dihidropirimidinase 2.

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Introdução

A demência vascular (DV) é a segunda principal demência senil e é causada principalmente por doença cerebrovascular isquêmica. A DV leva a comprometimento cognitivo heterogêneo, sendo necessários novos medicamentos terapêuticos eficazes que tratem ou previnam a progressão da DV1. No entanto, ainda não existe uma erva chinesa eficaz para melhorar o comprometimento cognitivo induzido por isquemia cerebral.

Glicosídeos de cistanche (GC) tem sido amplamente utilizado como uma erva com efeitos neuroprotetores. O Extrato de Herba Cistanches aumenta aaprendizado e memóriade camundongos, promovendo diferenciação de células neuronais, crescimento de neuritos e formação de sinapses2. Os glicosídeos de cistanche podem prevenir a apoptose em neurônios granulares cerebelares e exercer um efeito anti-apoptose inibindo a ativação de caspase-3 e caspase-83. O echinacoside, um dos principais componentes ativos do Herba Cistanches, é suficiente para proteger as células neuronais da lesão por rotenona, ativando a sinalização Trk4. No entanto, os mecanismos pelos quais o GC melhora o comprometimento cognitivo na DV ainda são amplamente desconhecidos.

A proteína Tau é uma proteína associada a microtúbulos neuronais que estabiliza os microtúbulos neuronais. A fosforilação da proteína tau (P-tau) afeta sua capacidade de interagir com os microtúbulos e afeta a transmissão sináptica. O acúmulo de emaranhados neurofibrilares (NFTs) consiste na proteína P-tau e é uma das principais características da doença de Alzheimer (DA)5. Sabe-se que a DV e a DA são as duas doenças demenciais mais comuns. Eles compartilham uma correlação comum com fatores de risco vascular, como hipertensão, diabetes mellitus e hipercolesterolemia. Portanto, a P-tau também pode estar implicada na DV.

Avaliamos os efeitos dos GCs emfunção de memória de aprendizagemem um modelo de rato de VD e realizada proteômica e análise imuno-histoquímica no hipocampo de ratos VD para fornecer informações sobre os efeitos neuroprotetores do GC. Nossos resultados mostraram que GCmelhor aprendizado e memóriaem ratos VD, e alterou os níveis de proteínas como P-tau em ratos VD.

Materiais e métodos

Animais

Ratos Wistar machos de seis meses de idade (peso 230- 270 g) foram fornecidos pelo centro experimental de animais da província de Hubei, China. Todos os procedimentos experimentais em animais foram conduzidos de acordo com as Diretrizes de Cuidados com Animais e Regulamentos Éticos Locais do Hospital Wuhan No. 1, China. O número de aprovação ética é 00014834. Os animais foram alojados separadamente em grupos de 4 por gaiola a 25 graus com um ciclo de 12-hora de luz/12-hora de escuridão e acesso livre a comida e água. Os animais (n=45) foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos: grupo modelo (n=12), grupo simulado (n=11), grupo tratado com GC (n{{14} }) e grupo controle tratado com oxiracetam (n=10).

Ligadura bilateral da artéria carótida comum (2-VO)

Sob anestesia profunda com 10% de hidrato de cloral (reagente Tianjin Damao Chemical Reagent Factory, Tianjin, China) (350 mg/kg de peso corporal,

ip), as artérias carótidas comuns (CCA) bilaterais foram cuidadosamente separadas dos tecidos circundantes e, em seguida, firmemente ligadas com a sutura. A pele foi posteriormente reconstruída e os ratos foram mantidos em temperatura ambiente e devolvidos à gaiola até a reanimação. Ratos de controle sham-operados foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico sem ligação CCA. Ratos VD foram tratados com GC (10 mg/kg de peso corporal/d, ip) ou oxiracetam (450 mg/kg de peso corporal/d, ip) imediatamente após a cirurgia por 14 dias sucessivos. O grupo modelo foi injetado com o mesmo volume de solução salina normal.

Teste do labirinto aquático de Morris

O teste MWM foi realizado de acordo com um método previamente descrito7. A área de teste consistiu em uma piscina circular cheia de água (25 ± 1 grau), opaca com leite para que os ratos não pudessem ver a plataforma submersa 1 cm abaixo da superfície da água. A piscina foi dividida em quatro quadrantes (chamadas zonas I, II, III e IV) e uma plataforma foi submersa na zona II. Pistas visuais foram colocadas na parede da sala de testes. Os animais foram colocados na água em um dos quatro pontos do quadrante inicial, que foi variado aleatoriamente ao longo das tentativas. Os ratos receberam 2 min para encontrar a plataforma e sentar-se sobre ela por 15 s. Os ratos que não conseguiram encontrar o local dentro de um determinado tempo foram gentilmente guiados até a plataforma e permaneceram nela por 15 s. Um sistema de rastreamento automático foi usado para registrar o percurso de natação, latência, distância de natação e tempo em cada zona. Todos os ratos foram sacrificados duas semanas após o teste de MWM para análise subsequente.

Extração de Proteínas

Sob anestesia profunda com hidrato de cloral a 10%, todos os ratos submetidos ao teste MWM foram decapitados. Os tecidos do hipocampo foram rapidamente colhidos em gelo e imediatamente congelados em nitrogênio líquido. Todos os tecidos foram homogeneizados sob nitrogênio líquido usando um almofariz e pilão e coletados em tampão de lise (7 M de uréia, 2 M de tiouréia, 2 por cento de CHAPS, 20 mM de Tris). As partículas insolúveis foram removidas por centrifugação a 12,000 rpm por 20 min a 4 graus. Os ácidos nucleicos contaminados nas amostras foram rompidos por oscilação sônica ininterrupta por 5 min. Os sobrenadantes foram recolhidos após centrifugação nas mesmas condições descritas acima. A concentração de proteína nos sobrenadantes foi medida pelo ensaio de Bradford e os sobrenadantes foram armazenados a 80 graus.

Eletroforese em gel bidimensional

As alíquotas de proteína (120 µg) foram ajustadas com um tampão de reidratação (7 M de ureia, 2 M de tiouréia, 4 por cento de CHAPS, 1 por cento em peso/vol DTT, 0,5 por cento de tampão IPG e um traço de azul de bromofenol) em um volume de 350 µL. A focagem isoelétrica (IEF) foi realizada em tiras IPG (pH 4-7, tamanho 22 cm) a 300 V por 12 min, 700 V por 18 min, 1500 V por 1,5 h, 9900 V por 3 h, 9990 V por 6,5 h, e depois 600 V por 20 h em um sistema Ettan IPGphor II (GE ETTAN IPGPHOR3). Após o programa IEF, as tiras foram equilibradas em um tampão de equilíbrio IPG I (6 M de ureia, 2 por cento de SDS, 30 por cento de glicerol, 0,375 M de Tris, pH 8,8, 20 mg/ml de DTT e um traço de azul de bromofenol) e em seguida, alquilado (25 mg/ml de iodoacetamida em vez de DTT em um tampão de equilíbrio) por 15 min. 2-DE foi realizado em géis de poliacrilamida SDS 12,5 por cento (24 cm x 19,5 cm x 1,0 mm) com cola de vedação de agarose a 0,5 por cento, usando o sistema de eletroforese Ettan DALT Six (GE ETTAN DALTsix, PA, EUA). A eletroforese foi realizada a 2 W por 45 min, seguida de separação a 17 W por quatro h até o azul de bromofenol quase atingir o fundo dos géis. As manchas de proteína foram visualizadas através de coloração com prata (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory) em géis analíticos. 2-Arruela DE formada em triplicata e a partir de três extrações de proteínas independentes para cada grupo.

Eletroforese em Gel Preparativo

Amostras de proteína (600 µg) de quatro grupos de ratos foram submetidas a 2-DE seguindo o método descrito acima. As manchas de proteína foram visualizadas através de coloração com azul brilhante Coomassie (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory) em géis preparativos.

Aquisição e análise de imagens

As imagens do gel foram capturadas em um sistema {{0}}DE Image Scanning (UMAX Powerlook1100, VT, EUA) e analisadas pelo software Image Master 2D Platinum 5.0 (GE, PA, EUA). As manchas de proteína foram detectadas automaticamente e depois editadas manualmente para remover estrias, manchas e artefatos.

Espectrometria de Massa de Ionização de Tempo de Voo de Dessorção a Laser Assistida por Matriz (MALDI-TOF-MS)

Para impressão digital de massa de peptídeo e análise subsequente, os géis foram fatiados e os pontos corados com Coomassie foram descorados e lavados com 100 mM de bicarbonato de amônio e acetonitrila, reduzidos com DTT a 60 graus por 40 min e depois alquilados por IAA por 30 minutos no escuro. O gel foi incluído em 50 µL de solução de tripsina modificada a 12 ng/µl em bicarbonato de amônio 50 mM (pH 8,6) a 37 graus durante a noite. Os peptídeos foram extraídos do plugue de gel com 1% de ácido fórmico/2% de acetonitrila e concentrados usando C-18 Zip-Tips. Digests foram localizadas (quatro réplicas) em um alvo MALDI usando a-ciano 4-ácido hidroxicinâmico (2 mg/ml em 50 por cento de acetonitrila, 0,1 por cento de TFA contendo dez mM de fosfato de amônio) como matriz. Os espectros foram adquiridos em um espectrômetro de massa 4700 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems, NY, EUA), e analisados ​​pelo software GPS Explorer TM (Applied Biosystems).

Imuno-histoquímica

As seções coronais do hipocampo foram fixadas em paraformaldeído a 4% antes de serem incluídas em parafina e depois cortadas em seções de 4-µm de espessura. Seções do hipocampo coronal finalizadas foram processadas para extinguir a atividade da peroxidase endógena usando 3% de H2O2 em solução salina tamponada com fosfato. As imunorreações inespecíficas foram bloqueadas à temperatura ambiente por 15 min. As seções foram então incubadas com anticorpo P-tau e anticorpo secundário à temperatura ambiente por 30 min e foram visualizadas após a reação de tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (Dako, Tóquio, Japão). As imagens foram capturadas usando um microscópio de luz (Olympus, Tóquio, Japão) e processadas usando o software Photoshop (versão 7.0, Adobe, San Jose, CA, EUA).

Análise estatística

Os dados quantitativos foram expressos como média ± DP. A análise de variância de duas vias (ANOVA) foi realizada usando o software de análise SPSS 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). p < 0,05="" foi="" considerado="">

Resultados

GC Promove Aprendizagem e Memória em Ratos VD

Para avaliar os efeitos do GC na função cognitiva do modelo de rato VD, realizamos o teste MWM. No teste MWM, o grupo GC apresentou latência de escape significativamente menor do que o grupo VD aos 4 e 5 dias após a cirurgia, mas não apresentou diferença significativa em relação ao grupo sham-operado e ao grupo controle com oxiracetam (Tabela I). Esses dados sugerem que o GC promove aprendizado e memória em ratos com DV. GC Altera Perfis Proteômicos do Hipocampo de Ratos VD.

Pela análise proteômica do hipocampo de ratos, descobrimos que 21 pontos de proteína no grupo GC apresentaram níveis de expressão diferentes em comparação com o grupo VD. Entre eles, quatro proteínas mostraram uma diferença significativa no hipocampo dos ratos GC (Tabela II): incluindo três proteínas upregulated proteína 1 (TXNL 1), proteína quinase 1 ativada por mitógeno de dupla especificidade (MAPKK 1) e proteína 2 relacionada com dihidropirimidinase (DPYSL2); e uma proteína glutationa sintetase (GCL) regulada negativamente. Os perfis típicos de eletroforese em gel bidimensional (2-DE) de DPYSL2 foram mostrados na Figura 1.

GC Modula o Nível de P-tau no Hipocampo de Ratos VD

Por análise imuno-histoquímica, descobrimos que o nível de proteína P-tau foi significativamente maior no grupo modelo VD do que no grupo sham-operado (p < 0.05).="" após="" o="" tratamento="" com="" gc,="" o="" nível="" de="" proteína="" p-tau="" em="" ratos="" modelo="" vd="" apresentou="" uma="" diminuição="" significativa="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" vd="" tratado="" com="" solução="" salina="" (p="">< 0,05),="" mas="" não="" apresentou="" diferença="" significativa="" em="" relação="" ao="" grupo="" controle="" de="" oxiracetam="" (figura="">

Discussão

A DV é decorrente do comprometimento da memória e do funcionamento cognitivo causado principalmente por doenças cerebrovasculares8,9,10,11. O modelo de oclusão de dois vasos (2VO) é simples e estável e reconhecido como o modelo padrão de isquemia cerebral. Neste estudo, utilizamos o modelo 2VO para estabelecer o modelo animal VD. Pelo teste MWM, descobrimos que o grupo VD apresentou diminuição da capacidade cognitiva em comparação com o grupo sham-operado, confirmando que estabelecemos o modelo VD com sucesso. Com base nesse modelo, descobrimos que o tratamento com GC melhorou a capacidade cognitiva espacial dos ratos VD de forma semelhante ao oxiracetam, um controle positivo. Esses dados indicam que o GC pode promover aprendizagem espacial e comprometimento da memória em DV.

Para investigar o mecanismo pelo qual o GC exerce efeitos neuroprotetores sobre a DV, empregamos uma abordagem proteômica para rastrear proteínas diferencialmente expressas no hipocampo de ratos com DV. Descobrimos que várias proteínas relacionadas ao metabolismo energético, dobramento de proteínas, via de sinalização e citoesqueleto apresentaram diferentes expressões no hipocampo dos ratos DV tratados com GC em comparação aos tratados com solução salina como controle.

Uma das proteínas diferencialmente expressas é a DPYSL2, também conhecida como proteína mediadora de resposta à colapsina-2 (CRMP-2), que é enriquecida na parte distal dos axônios em crescimento nos neurônios primários do hipocampo e é crucial para a diferenciação dos axônios e crescimento neuronal12,13. Além disso, CRMP-2 promove a montagem de microtúbulos e medeia a sinalização Ras para aumentar a formação de múltiplos axônios e a polaridade neuronal14,15. Neste estudo, o nível de expressão proteica de CRMP-2 foi aumentado em 2,28 vezes no grupo GC em comparação com o grupo VD, sugerindo um papel importante para CRMP-2 em potenciais mecanismos de reparo da formação de redes neurais e manutenção da polaridade neuronal na DV.

Além disso, no presente estudo encontramos maior P-tau no grupo modelo VD, mas menor expressão de P-tau após o tratamento com GC. A proteína Tau desempenha um papel fundamental na morfogênese dos neurônios. Em determinadas situações patológicas, a proteína P-tau pode gerar agregados aberrantes tóxicos aos neurônios, por afetar a função mitocondrial15. Estudos anteriores sugerem que o GC pode aumentar o metabolismo energético mitocondrial com função antioxidante16,17,18. Curiosamente, a fosforilação de CRMP-2 também foi caracterizada como constituinte de emaranhados neurofibrilares na DA.

Conclusões

CRMP2 é comumente fosforilado pela proteína quinase dependente de ciclina-5 (Cdk5) e glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) no cérebro de pacientes com DA, as mesmas quinases que fosforilam a proteína tau para gerar NFTs19,20. Mais estudos são necessários para examinar se o GC regula o nível de expressão de P-tau e CRMP2 em VD regulando a atividade de Cdk5 e GSK321,22,23. Em resumo, nossos dados sugerem que o GC desempenha um papel crítico para proteger os neurônios hipocampais da VD, diminuindo a fosforilação da P-tau e aumentando o nível de expressão de CRMP-2. A manipulação farmacológica do GC oferece uma nova oportunidade para o desenvolvimento de terapia contra a DV.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pela Special Foundation for Taishan Scholars e National Natural Science Fund (30960520).

Conflito de interesses

Os autores declaram que não há conflitos de interesse.

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