A glicose exerce um efeito anti-melanogênico por inativação indireta da tirosinase em melanócitos e um equivalente da pele humana
Mar 22, 2023
Abstrato:
Os açúcares são onipresentes nos organismos e são ingredientes cosméticos bem conhecidos para hidratar a pele com efeitos colaterais mínimos. A glicose, um açúcar simples usado como fonte de energia pelas células vivas, é frequentemente usada em produtos para a pele. Vários relatórios demonstraram que o açúcar e compostos relacionados ao açúcar têm efeitos anti-melanogênicos nos melanócitos. No entanto, o mecanismo molecular subjacente pelo qual a glicose inibe a síntese de melanina é desconhecido, embora a glicose seja usada como ingrediente clareador e hidratante em cosméticos. Aqui, descobrimos que a glicose reduziu significativamente o conteúdo de melanina das células B16 estimuladas pelo hormônio estimulante de melanócitos (MSH) e melanócitos humanos normais de pigmentação escura, sem sinais de citotoxicidade.
Além disso, o tratamento tópico de glicose demonstrou sua eficácia de clareamento por meio de fotografia, coloração de Fontana-Masson (F&M) e microscopia multifotônica em um modelo de pele humana 3D pigmentado, MelanoDerm. No entanto, a glicose não alterou a expressão gênica ou os níveis proteicos das principais proteínas melanogênicas nos melanócitos. Embora a glicose tenha diminuído fortemente a atividade da tirosinase intracelular nos melanócitos, ela não reduziu a atividade da tirosinase em cogumelos em um sistema experimental livre de células. No entanto, a glicose foi metabolizada em ácido lático, que pode suprimir poderosamente a atividade da tirosinase. Assim, concluímos que a glicose inibe indiretamente a atividade da tirosinase por meio da conversão em ácido lático, explicando seus efeitos antimelanogênicos nos melanócitos.
A tirosinase é uma enzima que pode decompor a tirosina em proteínas e convertê-la em produtos de oxidação de tirosina, como fenol de tirosina e outras substâncias. Esta enzima existe amplamente no corpo humano, especialmente no trato intestinal, onde está envolvida na digestão e absorção dos alimentos. Ao mesmo tempo, descobriu-se na pesquisa que o cistanche pode reduzir a atividade da tirosinase e, assim, clarear a pele.
Palavras-chave:
melanogênese; açúcar; glicose; tirosinase; equivalente à pele humana
1. Introdução
A melanogênese é o processo de produção de melanina e é essencial para a proteção da pele. A melanina absorve a luz ultravioleta (UV) e protege a pele dos efeitos nocivos da luz ultravioleta e dos radicais livres [1]. No entanto, como a produção excessiva de melanina causa hiperpigmentação, como sardas e lentigo, que podem ser considerados inestéticos, muitas pesquisas têm sido dedicadas a encontrar ingredientes despigmentantes eficazes para cosméticos ou medicamentos [2-4].
O açúcar é um umectante poderoso para a hidratação da pele e é usado como ingrediente cosmético para hidratar a pele com efeitos colaterais mínimos. Além disso, os açúcares e agentes relacionados ao açúcar afetam a melanogênese [5,6]. A glicosilação da tirosinase, enzima chave envolvida na síntese de melanina, pode ser alterada, inibindo sua atividade catalítica e acelerando sua degradação [7]. O papel dos açúcares na melanogênese foi destacado por estudos que investigam o efeito da glicosilação no fenótipo de pigmentação dos melanócitos e os papéis dos resíduos de açúcar na atividade catalítica da tirosinase [5-7]. Alguns estudos relataram que os derivados do açúcar podem inibir a maturação da tirosinase, afetando sua glicosilação. Por exemplo, N-acetilglicosamina (NAG), uma amino hexose produzida fisiologicamente pela adição de um grupo amino à glicose, interrompe a glicosilação da tirosinase, resultando em efeitos despigmentantes na pele de cobaias e na pele humana [8].
Além disso, estudos recentes mostraram que os compostos relacionados ao açúcar inibem a expressão ou ativação da tirosinase, bem como alteram sua glicosilação. Por exemplo, avaliamos a eficácia clareadora do ácido galacturônico (GA), um açúcar ácido que é uma forma oxidada da galactose e o principal componente da pectina. O ácido galacturônico exerce um efeito clareador através da regulação da atividade e expressão da tirosinase em células de melanoma murino B16 e um equivalente de pele humana [9]. Em outro relatório, um novo tipo de oligossacarídeo cíclico, conhecido como nitrosil nigerose cíclica (CNN), mostrou um efeito inibitório direto fraco, mas significativo, na atividade enzimática da tirosinase, sugerindo um possível mecanismo de hipopigmentação [10]. Semelhante à maturação da tirosinase por glicosilação adequada, a expressão ou atividade de CNN pode ser um alvo de agentes anti-melanogênicos [11]. No entanto, numerosos agentes anti-melanogênicos têm efeitos colaterais graves, como o vitiligo [12,13]. Há, portanto, grande interesse em compostos despigmentantes mais seguros.
Aqui, investigamos os efeitos anti-melanogênicos da glicose em células de melanoma murino B16 e melanócitos humanos normais. Além disso, examinamos a cor do tecido e o estado epidérmico usando a coloração da seção de tecido de um equivalente da pele humana. Com base em nossos achados, propomos que o efeito clareador da glicose é dependente da produção de ácido lático, resultando na inativação da tirosinase.
2. Resultados
2.1. Eficácia antimelanogênica da glicose em B16 e NHMs
Para investigar o efeito anti-melanogênico da glicose, usamos dois tipos de melanócitos, células de melanoma B16 (uma linhagem de células de melanoma murino) e melanócitos humanos normais (NHMs). Primeiro, determinamos se a glicose era tóxica para as células B16. A glicose não apresentou qualquer citotoxicidade em concentrações de até 100 mM em células B16, conforme mostrado na Figura 1A. Com base nos dados de citotoxicidade, as células B16 foram tratadas com várias concentrações de glicose por 72 h na presença do hormônio estimulante de melanócitos (MSH), um indutor da melanogênese. Conforme mostrado na Figura 1B, a glicose reduziu clara e significativamente o conteúdo de melanina intracelular de maneira dependente da dose. O ácido kójico (KA) foi usado como composto de referência para anti-melanogênese porque é frequentemente usado como ingrediente cosmético clareador da pele [1,3,4]. A cor dos lisados nas células tratadas com glicose era mais clara do que a cor das células de controle (Figura 1C).
Além disso, confirmamos que a quantidade de melanina secretada no meio de cultura diminuiu e a cor do meio aumentou (Figura 1D). Em seguida, investigamos o efeito anti-melanogênico da glicose em NHMs de pigmentação escura. A glicose em concentrações de até 100 mM não foi citotóxica por até quatro dias (Figura 1E). Quando o conteúdo de melanina foi determinado após tratamento com glicose de NHMs por 4 dias, descobrimos que o conteúdo de melanina diminuiu de maneira dose-dependente (Figura 1F). Tomados em conjunto, esses resultados indicam que a glicose suprime a síntese de melanina nos melanócitos.
2.2. Efeito de clareamento da glicose em um equivalente de pele humana 3D
Para definir melhor a capacidade anti-melanogênica da glicose, usamos um modelo de pele humana 3D pigmentado, MelanoDerm. Conforme descrito na seção Materiais e Métodos, a glicose foi aplicada topicamente ao MelanoDerm por 18 dias e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio CCK-8. Conforme mostrado na Figura 2A, nenhuma citotoxicidade tecidual foi observada após tratamento com glicose por 18 dias. As alterações de cor dos tecidos foram avaliadas por fotografia. Conforme mostrado na Figura 2B, o tecido tratado com glicose tinha uma cor mais clara do que o tecido tratado com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Além disso, a coloração de hematoxilina e eosina (H&E) revelou que a glicose não induziu o colapso do tecido, enquanto a coloração de fontana-masson (F&M) mostrou que a glicose diminuiu o número de melanócitos hiperpigmentados (como indicado pelas setas) na camada basal (Figura 2C). .
Para investigar melhor as alterações no conteúdo de melanina, comparamos os sinais de autofluorescência de melanina nas camadas de melanócitos de tecidos tratados com PBS e glicose usando microscopia de fluorescência de excitação de dois fótons (TPEF), conforme mostrado na Figura 2D. Uma análise dessas imagens mostrou que o volume de melanina diminuiu em aproximadamente 36% e a intensidade do sinal TPEF para melanina na área rica em melanócitos diminuiu em aproximadamente 38% em tecidos tratados com glicose em comparação com tecidos tratados com PBS.
Figura 2. Efeito da glicose no equivalente de pele humana, MelanoDerm. (A) Viabilidade de equivalentes de pele humana tratados com glicose. (B) Equivalentes de pele humana (MelanoDerm; n=3) foram tratados topicamente com glicose por 18 d e depois fotografados. O valor ∆L indica o grau de leveza em comparação com o tecido tratado com PBS. (C) Coloração H&E e F&M de seções de tecido. As lâminas foram fixadas em solução de formol e embebidas em parafina para coloração (barra de escala, 5{{10}} µm). As setas pretas indicam melanócitos pigmentados. (D) Imagens de melanina (200 × 200 × 60 µm3) de equivalentes de pele humana foram realizadas usando microscopia TPEF. Sinais pseudocoloridos (vermelho) indicam melanina (barra de escala, 50 µm). Os gráficos indicam a quantificação do volume de melanina e sinais TPEF. Os dados são expressos como a média ± DP de pelo menos três medições independentes (*p < 0,05, ***p < 0,001).
2.3. Efeito da Glicose na Expressão de Proteínas Melanogênicas em Melanócitos
Em seguida, para elucidar o mecanismo de despigmentação da glicose nos melanócitos, avaliamos seu efeito na expressão de enzimas melanogênicas como tirosinase e Tyrp-1 em células B16 e NHMs. As células B16 foram tratadas com glicose pelos tempos indicados na presença de -MSH. Em seguida, os níveis de proteína de tirosinase e Tyrp-1 foram determinados pelo ensaio de Western blot (Figura 3A). Os níveis de expressão de tirosinase e Tyrp-1 não foram diminuídos pela glicose em nenhum momento. Além disso, os níveis de transcrição de tirosinase não foram afetados pela glicose em células B16 estimuladas por -MSH (Figura 3B). Semelhante às células B16, os níveis de proteína de tirosinase, Tyrp-1 e MITF não foram inibidos pela glicose (Figura 3C) em células NHM tratadas com glicose, e os níveis de mRNA de tirosinase e Tyrp-1 também não foram diminuído, mas ligeiramente aumentado pela glicose (Figura 3D).
Figura 3. Efeito da glicose na expressão de proteínas melanogênicas em células B16 e NHMs. (A, B) Células B16 foram tratadas com -MSH pelo tempo indicado na presença ou ausência de 20 mM de glicose. Em seguida, foram realizados ensaios de Western blot (A) e qRT-PCR (B). (C) NHMs foram tratados com as concentrações indicadas de glicose por 48 h. Em seguida, foi realizado o ensaio de Western blot. (D) NHMs foram tratados com o tempo indicado na presença de 50 mM de glicose. Em seguida, foram realizados ensaios de qRT-PCR. Os dados são expressos como a média ± DP de pelo menos três medições independentes.
2.4. Efeito da glicose na atividade da tirosinase
Para melhor definir o mecanismo de ação da glicose, testamos se ela tinha um efeito inibitório na atividade da tirosinase do cogumelo. Conforme mostrado na Figura 4A, descobrimos que a glicose não teve efeito inibitório na atividade da tirosinase do cogumelo, indicando que a glicose não afeta diretamente a atividade da tirosinase. Em seguida, realizamos um ensaio de atividade de tirosinase intracelular total usando lisados de células tratadas com glicose de células B16 e NHMs. Curiosamente, a atividade da tirosinase intracelular foi inibida de maneira dependente da dose em células B16 tratadas com glicose na presença de -MSH (Figura 4B). Nos NHMs, a glicose também inibiu a atividade da tirosinase intracelular (Figura 4C). Esses dados suportam a possibilidade de que a glicose inative indiretamente a tirosinase nos melanócitos.
Figura 4. Efeito da glicose na atividade da tirosinase. (A) Efeito da glicose na atividade da tirosinase do cogumelo em um sistema livre de células. (B, C) Ensaio da atividade da tirosinase celular. (B) As células B16 foram tratadas com as concentrações indicadas de glicose por 24 h. Em seguida, foi realizado o ensaio de atividade da tirosinase celular, conforme descrito na seção de métodos. (C) NHMs foram tratados com glicose 50 mM pelo tempo indicado. Em seguida, foi realizado o ensaio de atividade da tirosinase celular, conforme descrito na seção de métodos. A atividade da tirosinase celular foi normalizada pelo teor de proteína total. Os dados são expressos como a média ± DP de pelo menos três medições independentes (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001).
2.5. Inativação da tirosinase pela produção de ácido lático em melanócitos tratados com glicose
A glicose é convertida no metabólito celular lactato, que é o ácido lático em solução e que tem sido relatado como eficaz no tratamento de lesões pigmentares [14,15]. Portanto, levantamos a hipótese de que a glicose é convertida em ácido lático nos melanócitos e que níveis aumentados de ácido lático inibem a melanogênese por meio da inativação da tirosinase. Para avaliar essa hipótese, primeiro avaliamos a produção de ácido lático em meios de melanócitos tratados com glicose. Como esperado, a glicose aumentou significativamente o teor de ácido láctico em meio de cultura de células B16 (Figura 5A). Além disso, como o ácido lático é conhecido por inibir diretamente a atividade da tirosinase [15], avaliamos se o ácido lático suprimia a atividade da tirosinase de cogumelos. Conforme mostrado na Figura 5B, o ácido lático inibiu drasticamente a atividade da tirosinase de cogumelo, ao contrário da glicose. Esses resultados sugerem que a conversão de glicose em ácido lático tem um efeito antimelanogênico via inativação da tirosinase pelo ácido lático.
Figura 5. Produção de lactato pela glicose e efeito do ácido lático na atividade da tirosinase. (A) Produção de lactato em células B16 tratadas com glicose. (A) As células B16 foram tratadas com as concentrações indicadas de glicose por 3 d. Em seguida, foi realizado um ensaio de lactato usando o meio de cultura, conforme descrito na seção de métodos. (B) Efeito do ácido lático na atividade da tirosinase do cogumelo em um sistema livre de células. Os dados são expressos como a média ± DP de pelo menos três medições independentes (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001) .
3. Discussão
Açúcares ou materiais derivados de açúcar são frequentemente usados como ingredientes cosméticos para proteção da pele e controle fisiológico. Por exemplo, a rafinose aumenta a autofagia independente de mTOR e reduz a morte celular em queratinócitos irradiados com UVB, indicando que o agente natural rafinose tem valor potencial para limitar o fotodano [16]. Trealose e sacarose são novos ativadores da autofagia em queratinócitos humanos através de uma via independente de mTOR [17]. Essas descobertas fornecem uma nova visão sobre a regulação da autofagia mediada por açúcar em queratinócitos. No caso da glicose, a glicose tópica demonstrou induzir a expressão de claudina -1 e filagrina em um modelo de camundongo de dermatite atópica e cultura de queratinócitos, indicando que tem um efeito anti-inflamatório ao reparar a função de barreira da pele [18]. Além disso, a glicose inibe a proliferação e aumenta a diferenciação dos queratinócitos da pele [19]. Portanto, a glicose regula vários aspectos da fisiologia epidérmica, como as funções de barreira da pele e os níveis de hidratação dos queratinócitos.
Os açúcares podem atuar como agentes despigmentantes através de vários mecanismos diferentes que envolvem a tirosinase. Por exemplo, alguns agentes inibem a maturação da tirosinase, enquanto outros agentes induzem a inibição da expressão ou atividade do gene da tirosinase [5,8-10]. No entanto, poucos estudos investigaram os mecanismos subjacentes aos efeitos de despigmentação da glicose.
Para determinar o efeito da glicose na melanogênese, focamos anteriormente nos receptores X do fígado (LXRs), que são receptores nucleares ativados por ligantes que desempenham papéis fundamentais no metabolismo lipídico e na homeostase do colesterol [20]. Descobrimos que a ativação do receptor X do fígado inibe a melanogênese através da aceleração da degradação do fator de transcrição associado à microftalmia (MITF) mediada por quinase regulada por sinal extracelular (ERK) [21]. Além disso, a glicose é um ligante LXR endógeno [22]. Assim, levantamos a hipótese de que a glicose tem efeitos anti-melanogênicos devido à ativação de uma via dependente de LXR. No entanto, como mostrado na Figura 3C, a glicose não alterou os níveis de expressão de tirosinase ou MITF, embora a ativação de LXR tenha reduzido os níveis de expressão dessas proteínas nos melanócitos.
Portanto, concluímos que a glicose teve efeitos despigmentantes nos melanócitos independente da ativação do LXR.
A glicose é o principal substrato para a produção de energia e é hidrolisada por meio de reações seriadas de várias enzimas, conhecidas como glicólise. Numerosos estudos mostraram que a glicólise tem apenas um produto final, o ácido lático, seja em condições aeróbicas ou anaeróbicas. Em condições aeróbias (O2), o lactato é utilizado como substrato da lactato desidrogenase mitocondrial (MLD). Os LDHs o convertem em piruvato que entra no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Sob condições anaeróbias (N2), o lactato é acumulado no citosol. Portanto, a via da glicólise começa com a glicose como substrato e termina com a produção de lactato como seu principal produto final [23]. Além disso, David e cols. mediram a fração de glicose que foi convertida em ácido láctico ou piruvato no melanócito humano normal [24]. A maioria dos metabólitos da glicose era ácido láctico em vez de piruvato.
O ácido lático é um alfa hidroxiácido (AHA); esses ácidos são amplamente utilizados em formulações cosméticas como agentes de peeling superficial [25]. Além disso, o ácido lático suprime a formação de melanina inibindo diretamente a atividade da tirosinase, um efeito independente de sua natureza ácida, o que significa que os efeitos do ácido lático nas lesões pigmentares se devem não apenas à aceleração da renovação celular epidérmica, mas também à inibição direta da formação de melanina em melanócitos [15]. Assim, concluímos que a glicose pode exercer seu efeito antimelanogênico por meio da produção de ácido lático, porque a glicose pode ser convertida em ácido lático. Como esperado, descobrimos que o tratamento com glicose resultou na produção de ácido lático nos melanócitos (Figura 5A).
Além disso, confirmamos que o ácido lático inibiu poderosa e diretamente a atividade da tirosinase (Figura 5B). Usuki et ai. também descobriram que o ácido lático diminuiu a atividade da tirosinase intracelular em células B16 e células HM3KO humanas [15]. No relatório, os níveis de mRNA e proteína de tirosinase e Tyrp-1 não foram afetados pelo ácido lático. Juntos, esses dados indicam que a glicose aumenta a produção de ácido lático e que esse ácido lático inibe diretamente a atividade da tirosinase sem afetar os níveis de expressão gênica, indicando que a glicose tem um efeito antimelanogênico nos melanócitos via inativação indireta da tirosinase dependente da produção de ácido lático. Entretanto, mais experimentos são necessários para validar o papel do ácido lático e da glicose na despigmentação.
Os dados coletivos deste estudo fornecem evidências preliminares que apóiam a utilidade da glicose tópica como um clareador eficaz, bem como um reagente hidratante que pode ser usado com segurança em cosméticos e formulações medicinais.
4. Materiais e Métodos
4.1. Materiais
D-glicose, -MSH, ácido kójico (KA), L-tirosina, L-DOPA e ácido lático foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Anticorpos contra tirosinase e actina foram adquiridos da Abcam (Cambridge, Reino Unido). O anticorpo contra Tyrp-1 foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (CA, EUA). O anticorpo contra MITF foi adquirido da Proteintech (cidade, IL, EUA).
4.2. Cultura Celular e Ensaio de Viabilidade
Adquirimos células B16 de melanoma murino, meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e soro fetal bovino (FBS) da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). Células B16 foram cultivadas em DMEM contendo 4500 mg/L de alta glicose (ATCC 30-2002) conforme recomendado pelo fabricante (ATCC) suplementado com 5 por cento de FBS e incubadas a 37 ◦C em uma atmosfera umidificada contendo 95 por cento de ar e 10 por cento de CO2. Os NHMs primários de pigmentação escura foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific (#C2025C; Waltham, MA, EUA). As células foram cultivadas em Meio 254 (#M254500) suplementado com Suplemento de Crescimento de Melanócitos Humanos (#S0025) e incubadas a 37 ◦C sob uma atmosfera de 5% de CO2. Para experimentos, NHMs primários entre as passagens 4 e 7 foram usados. A viabilidade das células cultivadas foi avaliada usando um Cell Counting Kit-8 (CCK-8) conforme descrito pelo fabricante (DOJINDO, Tóquio, Japão).
4.3. Medição do conteúdo de melanina
O conteúdo de melanina foi determinado conforme descrito em relatórios anteriores [2-4]. Resumidamente, as células B16 foram tratadas com as concentrações indicadas de glicose na presença de -MSH (200 nM) por 72 h. Os NHMs foram tratados com as concentrações indicadas de glicose por 4 dias. A seguir, todas as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e dissolvidas em NaOH 1 N a 60 ◦C por 1 h. Os lisados celulares foram transferidos para uma placa de 96-poços e a absorbância foi medida a 405 nm. Os valores foram normalizados com base nas concentrações de proteína em cada poço de amostra.
4.4. Ensaio de atividade de tirosinase de cogumelo
Nós investigamos os efeitos diretos das concentrações indicadas de glicose na atividade da tirosinase de cogumelo. Resumidamente, 100 µL de tampão fosfato contendo glicose foi misturado com tirosinase de cogumelo (10 unidades/poço) e combinado com 50 µL de 0,03 por cento de L-tirosina ou L-DOPA em água destilada. Em seguida, a mistura foi incubada conjuntamente a 37 ◦C por 10 min e a absorbância foi medida a 405 nm. O ácido kójico (KA), um conhecido agente anti-tirosinase, foi usado como composto de referência.
4.5. Ensaio de atividade de tirosinase intracelular
Resumidamente, as células B16 ou NHMs foram tratadas com as concentrações indicadas de glicose para os tempos indicados. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e lisadas por incubação em tampão fosfato 50 mM (pH 6,8) contendo 1 por cento de Triton X-100 e 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil. Os lisados celulares foram então centrifugados a 12,000 rpm a 4 ◦C por 20 min. O sobrenadante contendo tirosinase celular foi coletado e o teor de proteína foi determinado para normalização. O extrato celular foi incubado com L-DOPA em tampão fosfato e a formação de dopacromo foi monitorada medindo a absorbância a 405 nm em 30 min.
4.6. Isolamento de RNA e Transcrição Reversa Quantitativa em Tempo Real-Reação em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR)
Para determinar a expressão relativa de mRNA de genes selecionados, o RNA total foi isolado com TRIzol (Invitrogen, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, e 4 µg de RNA foram transcritos reversamente em cDNA usando RT-premix (Bioneer, Seoul, South Coréia). A PCR quantitativa foi realizada usando um sistema ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os conjuntos de iniciadores qRT-PCR para tirosinase e Tyrp-1 foram adquiridos da Applied Biosystems, e os kits TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) foram usados para amplificação. A expressão do gene alvo foi normalizada para aquela do gene de limpeza que codifica a subunidade P0 da haste lateral da proteína ribossômica (RPLP0). A quantização relativa foi realizada usando o método ∆∆Ct comparativo de acordo com as instruções do fabricante.
4.7. Western Blotting
As células foram lavadas duas vezes com PBS frio e depois lisadas em tampão RIPA modificado gelado (Cell Signaling Technology, MA, EUA) contendo inibidores de protease (Calbiochem, La Jolla, CA, EUA). A concentração total de proteína foi determinada e as proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE em géis Bis-Tris com gradiente de 4-12 por cento (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), transferidos para membranas de nitrocelulose (Thermo Fisher Scientific). Após a transferência, as membranas foram bloqueadas em uma solução de bloqueio de 5 por cento. As membranas foram incubadas com anticorpos primários a 4 ◦C por 24 h, lavadas com solução salina tamponada com Tris contendo 0,1 por cento Tween-20 (TBST) e expostas a anticorpos secundários conjugados com peroxidase por 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas três vezes com TBST. Um sinal quimioluminescente foi desenvolvido usando o reagente Western blotting ECL (GE Healthcare, Hatfield, Reino Unido).
4.8. Equivalente de pele humana tridimensional (3D)
Usamos MelanoDerm (MEL-300-B; MatTek Corp., Ashland, MA, EUA) como modelo de tecido de pele humana. Este equivalente de pele humana 3D viável e reconstituída foi derivado de doadores negros e contém melanócitos e queratinócitos normais. MelanoDerm foi cultivado na interface ar-líquido em meio EPI-100-NMM-113 (MatTek Corp, Ashland, MA, EUA). Antes do tratamento com glicose, os tecidos foram lavados com 1 mL de PBS para remover compostos residuais. A glicose foi dissolvida em PBS. A concentração final de glicose foi de 2%. A amostra controle foi tratada apenas com PBS. A glicose foi aplicada ao MelanoDerm nos dias 1, 4, 6, 8, 11, 13 e 15. Após 18 dias, os tecidos MelanoDerm foram fixados em formaldeído tamponado a 4 por cento, embebidos em parafina, cortados em uma espessura de 3 µm e submetidos à coloração H&E e F&M. A viabilidade das amostras de tecido foi avaliada usando um Cell Counting Kit-8 (CCK-8) conforme descrito pelo fabricante (DOJINDO, Tóquio, Japão). A pigmentação do MelanoDerm foi avaliada comparando a mudança no valor L*.
4.9. Imagens de Fluorescência de Excitação de Dois Fótons (TPEF)
Para visualizar a distribuição da melanina no equivalente 3D da pele humana, realizamos imagens TPEF, conforme descrito em nossos relatórios anteriores [3,4]. Resumidamente, cada preparação de MelanoDerm foi fixada em formol a 4 por cento por 24 h a 4 ◦C e depois lavada com PBS/0,1 por cento de BSA (albumina de soro bovino, Merck, Branchburg, NJ, EUA). As imagens TPEF foram adquiridas da camada basal para medir a melanina intracelular na camada de melanócitos. As intensidades relativas do sinal TPEF para melanina no volume de medição foram quantificadas usando o software Image-Pro Premier 3D (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, EUA).
4.10. Ensaio de L-lactato
As células B16 foram semeadas a 1,0 × 105 células por poço em uma placa de 12-poços. Após tratamento com glicose por 3 dias, os níveis de lactato extracelular foram quantificados usando um kit de ensaio colorimétrico de L-lactato (Abcam, ab65331, Cambridge, Reino Unido) de acordo com o protocolo do fabricante.
4.11. Statistical Analysis
Os dados são expressos como média ± DP (desvio padrão) e a significância estatística foi determinada pelo teste t de Student. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Contribuições do autor:
Conceituação, H.-JK, JL e CSL; Curadoria de dados, SHL; Investigação, SHL; Metodologia, SHL, I.-HB e E.-SL; Supervisão, JL e CSL; Redação—rascunho original, SHL e CSL; Redação—revisão e edição, JL Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento:
Esta pesquisa foi financiada pelo Programa de Pesquisa em Ciências Básicas por meio da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiada pelo Ministério da Educação (Número da concessão: 2018R1D1A1B07049402).
Conflitos de interesse:
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Abreviaturas
-MSH -hormônio estimulante de melanócitos
Tyrp-1 proteína relacionada à tirosinase 1
Fator de transcrição associado à microftalmia MITF
NHMs melanócitos humanos normais
Fluorescência de excitação de dois fótons TPEF
Receptor X do fígado LXR
AHAs alfa hidroxiácidos
H&E hematoxilina e eosina
F&M Fontana-Masson
Referências
1. Swalwell, H.; Latimer, J.; Haywood, RM; Birch-Machin, MA Investigando o papel da melanina na produção de ROS mitocondrial e celular induzida por UVA/UVB e peróxido de hidrogênio e danos ao DNA mitocondrial em células de melanoma humano. Radic Livre. Biol. Med. 2012, 52, 626–634. [CruzRef]
2. Lee, CS; Jang, WH; Parque, M.; Jung, K.; Baek, HS; João, YH; Parque, YH; Lim, KM Um novo derivado de adamantil benzilbenzamida, AP736, suprime a melanogênese através da inibição do fator de transcrição associado à microftalmia ativada por cAMP-PKA-CREB e à expressão da tirosinase. Exp. Dermatol. 2013, 22, 762–764. [CrossRef] [PubMed]
3. Lee, JH; Lee, ES; Bae, IH; Hwang, JA; Kim, SH; Kim, DY; Parque, NH; Rho, HS; Kim, YJ; Ah, SG; e outros Eficácia antimelanogênica de Melasolv (3,4,5-trimetoxicinamato timol éster) em melanócitos e equivalente tridimensional da pele humana. Skin Pharmacol. Physiol. 2017, 30, 190–196. [CrossRef] [PubMed]
4. Bae, IH; Lee, ES; Yoo, JW; Lee, SH; Ko, JY; Kim, YJ; Lee, TR; Kim, DY; Lee, CS Manosylerythritol lipídios inibem a melanogênese através da supressão da sinalização ERK-CREB-MITF-tirosinase em melanócitos humanos normais e um equivalente tridimensional da pele humana. Exp. Dermatol. 2019, 28, 738–741. [CrossRef] [PubMed]
5. Bin, BH; Kim, ST; Bhin, J.; Lee, TR; Cho, EG O desenvolvimento de agentes anti-melanogênicos à base de açúcar. Int. J. Mol. ciência 2016, 17, 583. [CrossRef]
6. Kumari, S.; Tien Guan Thng, S.; Kumar Verma, N.; Gautam, HK Melanogenesis Inhibitors. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 924–931. [CruzRef]
7. Ando, H.; Kondoh, H.; Ichihashi, M.; Hearing, VJ Abordagens para identificar inibidores da biossíntese de melanina por meio do controle de qualidade da tirosinase. J. Invest Dermatol. 2007, 127, 751-761. [CruzRef]
8. Hwang, JS; Lee, HY; Lim, TY; Kim, MY; Yoon, TJ Interrupção da glicosilação da tirosinase pela N-acetilglicosamina e seus efeitos despigmentantes na pele de porquinhos-da-índia e na pele humana. J. Dermatol. ciência 2011, 63, 199–201. [CruzRef]
9. Lee, CS; Baek, HS; Bae, IH; Choi, SJ; Kim, YJ; Lee, JH; Kim, JW Eficácia da despigmentação do ácido galacturônico através da regulação da tirosinase em células B16 de melanoma murino e um equivalente tridimensional da pele humana. Clin. Exp. Dermatol. 2018, 43, 708–712. [CruzRef]
10. Nakamura, S.; Kunikata, T.; Matsumoto, Y.; Hanaya, T.; Harashima, A.; Nishimoto, T.; Ushio, S. Efeitos de um carboidrato cíclico não ciclodextrina em células de melanoma de camundongo: Caracterização de um novo tipo de açúcar hipopigmentado. PLoS ONE 2017, 12, e0186640. [CruzRef]
11. Khan, MT Novos inibidores de tirosinase de recursos naturais – seus estudos computacionais. atual Med. Chem. 2012, 19, 2262–2272. [CrossRef] [PubMed]
12. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, G. Hypopigmentingagents: Uma revisão atualizada sobre aspectos biológicos, químicos e clínicos. Pigmento. Célula. Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]
13. Lee, CS; João, YH; Baek, HS; Parque, M.; Kim, JH; Shin, HJ; Parque, NH; Lee, JH; Parque, YH; Shin, SS; e outros Efeitos diferentes de cinco compostos despigmentantes, rododendro, cetona de framboesa, monobenzona, rucinol e AP736 na melanogênese e viabilidade de melanócitos epidérmicos humanos. Exp. Dermatol. 2016, 25, 44–49. [CrossRef] [PubMed]
14. Mulukutla, BC; Khan, S.; Lange, A.; Hu, WS Metabolismo da glicose na cultura de células de mamíferos: novos insights para ajustar os caminhos antigos. Tendências. Biotecnologia. 2010, 28, 476-484. [CruzRef]
15. Usuki, A.; Ohashi, A.; Sato, H.; Ochiai, Y.; Ichihashi, M.; Funasaka, Y. O efeito inibitório do ácido glicólico e do ácido lático na síntese de melanina em células de melanoma. Exp. Dermatol. 2003, 12, 43–50. [CruzRef]
16. Lin, S.; Li, L.; Li, M.; Gu, H.; Chen, X. A rafinose aumenta a autofagia e reduz a morte celular em queratinócitos irradiados com UVB. J. Photochem. Fotobiol. B 2019, 201, 111653. [CrossRef]
17. Chen, X.; Li, M.; Li, L.; Xu, S.; Huang, D.; Ju, M.; Huang, J.; Chen, K.; Gu, H. Trealose, sacarose e rafinose são novos ativadores da autofagia em queratinócitos humanos por meio de uma via independente de mTOR. ciência Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]
18. Yamada, K.; Matsushita, K.; Wang, J.; Kanekura, T. Glicose Tópica Induz a Expressão de Claudina-1 e Filagrina em um Modelo de Camundongo de Dermatite Atópica e em Cultura de Queratinócitos, Exercendo Efeitos Antiinflamatórios ao Reparar a Função de Barreira da Pele. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 19–25. [CruzRef]
19. Spravchikov, N.; Sizyakov, G.; Gartsbein, M.; Accili, D.; Tennenbaum, T.; Wertheimer, E. Efeitos da glicose nos queratinócitos da pele: Implicações para as complicações cutâneas do diabetes. Diabetes 2001, 50, 1627–1635. [CruzRef]
20. Castrillo, A.; Tontonoz, P. Receptores nucleares na biologia de macrófagos: na encruzilhada do metabolismo lipídico e inflamação. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2004, 20, 455–480. [CruzRef]
21. Lee, CS; Parque, M.; Han, J.; Lee, JH; Bae, IH; Choi, H.; Filho, ED; Parque, YH; Lim, a ativação do receptor KM Liver X inibe a melanogênese através da aceleração da degradação do MITF mediada por ERK. J. Invest. Dermatol. 2013, 133, 1063–1071. [CrossRef] [PubMed]
22. Mitro, N.; Mak, PA; Vargas, L.; Godio, C.; Hampton, E.; Molteni, V.; Kreusch, A.; Saez, E. O receptor nuclear LXR é um sensor de glicose. Nature 2007, 445, 219–223. [CrossRef] [PubMed]
23. Schurr, A. Carboidrato; IntechOpen: Londres, Reino Unido, 2017; pp. 21–35.
24. Scott, D.; Richardson, A.; Filipp, F.; Knutzen, C.; Chiang, G.; Ronai, Z.; Osterman, A.; Smith, J. Perfil de fluxo metabólico comparativo de linhas celulares de melanoma: além do efeito Warburg. J. Biol. Chem. 2011, 286, 42626–42634. [CrossRef] [PubMed]
25. Tang, SC; Yang, JH Efeitos duplos de ácidos alfa-hidroxi na pele. Moléculas 2018, 23, 863. [CruzRef]
For more information:1950477648nn@gmail.com
