Estudo de associação de todo o genoma identifica novos loci para doença renal em estágio final atribuída ao diabetes tipo 2 em afro-americanos
Mar 04, 2022
Meiji Guan1,2, Jacob M. Keaton1,2, Latchezar Dimitrov1,2, Pamela J. Hicks1,2, Jianzhao Xu1,2, Nicholette D. Palmer1,2,3, Lijun Ma4, Swapan K. Das5, Yii-Der I . Chen6, Josef Coresh7, Myriam Fornage8, Nora Franceschini9, Holly Kramer10,11, Carl D. Langefeld12,13, Josyf C. Mychaleckyj14, Rulan S. Parekh15, Wendy S. Post7, Laura J. Rasmussen-Torvik16, Stephen S. Rich14 , Jerome I. Rotter6,17, John R. Sedor18,19, Denyse Thornley-Brown20, Adrienne Tin7, James G. Wilson21, Barry I. Freedman4, Donald W. Bowden1,2,3, Maggie CY Ng1,2,3* e ENCONTRE Consórcio
Abstrato
Antecedentes: Estágio finalrimdoença(ESKD) é um problema significativo de saúde pública que afeta desproporcionalmente os afro-americanos (AAs). Diabetes tipo 2 (T2D) é a principal causa de ESKD nos EUA, e os esforços para descobrir a suscetibilidade genética à doença renal diabética (DKD) tiveram sucesso limitado. Um estudo prévio de associação genômica ampla (GWAS) em AAs com T2D-ESKD foi expandido com casos e controles adicionais de AA e genótipos imputados ao painel de referência de 1000 genomas de maior densidade. A análise de descoberta incluiu 3.432 casos T2D-ESKD e 6.977 controles não diabéticos não nefropatas (N = 10,409), seguido por uma análise de discriminação em 2.756 controles de não nefropatia T2D para excluir variantes associadas a T2D.
Resultados:Seis variantes independentes localizadas em ou pertoRND3/RBM43, SLITRK3, ENPP7, GNG7, eAPOL1alcançou uma associação significativa em todo o genoma (P <5×>−8) com T2D-ESKD. Após análises de extensão em 1910não diabéticoCasos de ESKD e 908 controles não diabéticos sem nefropatia, uma meta-análise de 5342 casos ESKD de todas as causas AA e 6977 controles AA não diabéticos não nefropáticos revelou um novo locus ESKD de todas as causas adicionais emEFNB2(rs77113398;P = 9.84 × 10–9; OU=1.94). A exclusão deAPOL1portadores de genótipos de risco renal identificaram dois loci adicionais associados a T2D-ESKD significativos em todo o genoma emGRAMD3eMGAT4C. Uma segunda variante emGNG7(rs373971520;P = 2.17 × 10–8, OU=1.46) permaneceu associado a ESKD de todas as causas noAPOL1-análise negativa.
Conclusões:Os achados fornecem mais evidências para fatores genéticos associados à doença renal avançada em AAs com DM2.
Palavras-chave:Afro-americanos, estudo de associação de todo o genoma, diabetes tipo 2, doença renal diabética,Doença renal terminal
Para mais informações por favor entre em contato:emily.li@wecistanche.com
Introdução
Evidências crescentes sugerem que fatores genéticos desempenham um papel importante na suscetibilidade ao estágio finalrimdoença(ESKD). Isso é particularmente relevante em afro-americanos (AAs), onde as taxas de incidência de ESKD são mais de três vezes maiores do que nos europeus americanos (EAs) [1]. As taxas de mortalidade para pacientes com ESKD, diálise e transplante são 136, 166 e 30 por 1.000 pacientes-ano, respectivamente, e representam 7,2% dos custos de sinistros pagos pelo Medicare [1]. Diabetes, dos quais 95% dos pacientes têm diabetes tipo 2 (T2D), continua sendo a principal causa relatada de ESKD nos EUA, representando > 44% dos casos [1]. Melhorias no controle glicêmico, lipídico e da pressão arterial não reduziram marcadamente a prevalência de diabetesrimdoença(DKD) [1, 2]. Além disso, a agregação familiar da DKD é independente do status socioeconômico e dos fatores de risco ambientais estabelecidos [3, 4]. Embora os alelos G1 e G2 no gene da apolipoproteína L1 (APOL1) contribuam para 50-70 por cento da ESKD não-diabética em AAs, eles não explicam completamente o risco excessivo de ESKD atribuído a T2D (T2D-ESKD) nesta população. 5-7].
Estudos de associação de todo o genoma (GWAS) identificaram > 70 variantes significativas de todo o genoma associadas a doenças crônicasrimdoença(DRC), albuminúria ou função renal em populações de ascendência europeia [8-11]. No entanto, poucos loci foram associados à DKD em diversas populações e não se replicam consistentemente, em parte devido ao tamanho limitado da amostra [12-18]. A etiologia das complicações renais em pacientes com DM2 é provavelmente mais heterogênea do que em pacientes com diabetes tipo 1 [16]. Portanto, fenotipagem cuidadosa e tamanhos de amostra maiores são necessários para melhorar o poder estatístico. Para explorar a arquitetura genética da doença renal avançada em DM2, estendemos nossos esforços anteriores de GWAS (2.890 pacientes com ESKD e 1.719 controles não diabéticos sem nefropatia) para uma amostra maior de AAs comrimdoença. As análises de associação foram realizadas em seis coortes AA independentes (Wake Forest School of Medicine, WFSM; Family Investigation of Nephropathy and Diabetes, FIND; Atherosclerosis Risk in Communities Study, ARIC; Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis, MESA; Jackson Heart Study, JHS; e Desenvolvimento de Risco de Artéria Coronária em Adultos Jovens, CARDIA) para T2D-ESKD ou ESKD não diabético através de um desenho de estudo em vários estágios (Fig. 1). Isso abrangeu 15.075 AAs classificados em quatro grupos fenotípicos: casos T2D-ESKD (N=3432), controles não diabéticos sem nefropatia (N=6977), controles de nefropatia sem T2D (N {{16} }) e casos de ESKD não diabéticos (N=1910).
Na fase de descoberta, GWAS foi realizada em 3.432 casos de DT2-ESKD e 6.977 controles não diabéticos não nefropatas, seguido por uma análise de discriminação para excluir loci associados a DM2 em 2.756 controles não nefropatas DM2. As análises de extensão foram realizadas em 1910 AAs com ESKD não diabético e 908 controles sem nefropatia para avaliar a contribuição de loci associados a T2D-ESKD para pacientes não diabéticosrimdoença. Uma meta-análise de casos de ESKD diabéticos e não diabéticos avaliou associações genéticas em ESKD de todas as causas. APOL1-formas associadas de não diabéticosrimdoençae DM2 frequentemente coexistem em pacientes. Assim, muitos pacientes diabéticos comrimdoençapode ser classificado erroneamente como portador de DKD, uma vez que o diagnósticorimbiópsias geralmente não são realizadas. Aqui, uma segunda análise GWAS excluindo indivíduos com genótipos de risco renal APOL1 foi realizada para minimizar a classificação incorreta de T2D-ESKD.
Resultados
Visão geral do estudo
Este estudo tem poder > 80 por cento para detectar variantes comuns (MAF maior ou igual a 0,10) com efeito moderado (OR maior ou igual a 1,3) em um nível de significância de 5 × 10−8 (http: //csg.sph.umich.edu/abecasis/cats/). Ao todo, sete loci significativos em todo o genoma (P<5× 10−8="" )="" associated="" with="" t2d-eskd="" were="" identified="" in="" either="" the="" baseline="" model="" (rnd3/rbm43,="" slitrk3,="" enpp7,="" gng7,="" and="" apol1)="" or="" apol1-negative="" model="" (enpp7,="" gramd3,="" and="" mgat4c).="" in="" addition="" to="" apol1,="" two="" loci,="" efnb2="" and="" gng7,="" also="" reached="" genome-wide="" significance="" in="" the="" all-cause="" eskd="" meta-analysis="" under="" either="" the="" baseline="" or="" apol1-negative="">
Características clínicas dos participantes do estudo
As Tabelas 1 e 2 incluem características detalhadas dos participantes do estudo. Os casos de ESKD foram recrutados dos estudos WFSM (Affy6.0, Axiom e MEGA), FIND e ARIC. Indivíduos com T2D-ESKD ou nefropatia sem T2D eram mais velhos (ou de idade semelhante) em comparação com os controles não diabéticos sem nefropatia no recrutamento. No entanto, a idade média no diagnóstico de DM2 em casos de DT2-ESKD e controles de nefropatia sem DM2 foram mais jovens do que os controles não-diabéticos sem nefropatia no recrutamento. Todos os controles não nefropatas de DM2 e controles não diabéticos e não nefropatas tinham TFGe normal maior ou igual a 60 ml/min/1,73m2. Além disso, controles não diabéticos não nefropatas apresentaram níveis de glicemia de jejum < 126="" mg/dl.="" os="" controles="" com="" nefropatia="" sem="" dm2="" foram="" mais="" obesos="" do="" que="" os="" casos="" dt2-eskd="" ou="" não="" diabéticos="" eskd="" e="" os="" controles="" não="" diabéticos="" e="" não="" nefropatas,="" exceto="" que="" os="" casos="" dt2-eskd="" em="" aric,="" foram="" mais="" obesos="" do="" que="" os="" outros="">
Análise de associação de estágio 1 e estágio 2 T2D-ESKD
Na descoberta do estágio 1, o GWAS foi conduzido separadamente em três conjuntos de dados: (1) 1.513 casos T2D-ESKD e 5.299 controles não diabéticos não nefropatas genotipados em Affy6.0, contribuição de WFSM, FIND, ARIC, JHS, MESA e CARDIA (estágio 1a); (2) 1700 casos T2D-ESKD e 770 controles não diabéticos não nefropatas de WFSM genotipados com matriz de genotipagem Axiom Biobank (estágio 1b); e (3) 219 casos T2D-ESKD e 908 controles não diabéticos e não nefropatas de WFSM genotipados em MEGA (estágio 1c). Uma meta-análise (estágio 2) foi realizada para combinar resultados de associação para 3.432 casos de DT2-ESKD e 6.977 controles não diabéticos e não nefropatas dos estágios 1a, 1b e 1c. Um fator de inflação λ de 1,013 foi observado após correção para controle genômico (Arquivo adicional 1: Figura S1), sugerindo que a estrutura populacional e o parentesco críptico foram suficientemente ajustados. Entre as variantes que demonstram associações sugestivas (P < 1="" ×="" 10−5),="" 59="" variantes="" com="" i2="" maior="" ou="" igual="" a="" 80%="" foram="" excluídas="" devido="" à="" alta="" heterogeneidade="" nos="" tamanhos="" de="" efeito="" entre="" os="" estudos.="" um="" total="" de="" 478="" variantes="" restantes="" foram="" avaliadas="" em="" uma="" análise="" de="" discriminação="" (81="" delas="" alcançaram="" significância="" em="" todo="" o="" genoma;="" arquivo="" adicional="" 1:="" tabela="">
Análise de discriminação de estágio 3
Para determinar se as associações T2D-ESKD identificadas na meta-análise do estágio 1 foram conduzidas pela associação com T2D per se, uma análise de discriminação foi realizada para T2D contrastando 2.756 AAs com nefropatia sem T2D com 6.977 controles não diabéticos e não nefropáticos do estágio 1 (Affy6.0, Axiom, MEGA; Arquivo adicional 1: Tabela S3). Em seguida, excluímos 174 das 478 variantes associadas ao T2D-ESK D nominalmente associadas ao DM2 na ausência de nefropatia. Entre as associações T2D-ESKD restantes, as principais variantes representando 6 associações independentes alcançaram significância em todo o genoma (Tabela 3, Fig. 2a). A associação mais forte foi observada para rs9622363 localizado em APOL1 (P=1.42 × 10−10, OR=0.77, EAF=0.45). Esta variante estava em desequilíbrio de ligação moderado (r2=0.33 e 0,34, respectivamente em YRI) com os alelos APOL1 G1 (rs60910145, rs73885319) associados a ESKD não diabético [6]. A segunda associação mais forte foi em rs58627064, uma variante intergênica localizada perto de SLITRK3, (P=6.81 × 10−10, OR=1.62, EAF=0.06). Dois sinais independentes, rs142563193 (P=1.24 × 10−8, OR=0.74, EAF=0.23) e rs142671759 (P=5,53 × 10) −9 , OR=2.26, EAF=0.02) no cromossomo 17 localizado perto de ENPP7, respectivamente, também foram significativos em todo o genoma. Além disso, duas associações com T2D-ESKD, rs4807299 (P=3.21 × 10−8, OR=1.67, EAF=0.05) localizadas em GNG7 e rs72858591 (P=4.54 × 10−8, OR=1.43, EAF=0.10) localizados em RND3/RBM43 foram identificados (Fig. 1a).
Análise ESKD não diabética de estágio 4 e meta-análise ESKD de todas as causas de estágio 5
Após o estágio de discriminação, 304 variantes exibindo associação sugestiva com T2D-ESKD (P < 1="" ×="" 10−5)="" foram="" testadas="" em="" 1.910="" casos="" independentes="" de="" eskd="" não="" diabéticos="" e="" 908="" controles="" do="" estágio="" 1c.="" o="" objetivo="" da="" análise="" do="" estágio="" 4="" foi="" avaliar="" a="" contribuição="" de="" loci="" associados="" a="" t2d-eskd="" para="" pacientes="" não="">rimdoença. Após excluir variantes com heterogeneidade I2 maior ou igual a 80 por cento, 25 variantes foram nominalmente associadas a ESKD não diabética (P < 0,05).="" associações="" fortes="" (1,27="" ×="" 10−29="">< p="">< 8.86="" ×="" 10−15)="" foram="" observadas="" na="" região="" apol1-myh9,="" confirmando="" seu="" papel="" em="" pacientes="" não="">rim doença. Uma meta-análise ESKD de todas as causas, incluindo 5342 ESKD de todas as causas e 6977 controles não diabéticos não nefropáticos, foi conduzida para avaliar a generalização das 25 variantes associadas a T2D-ESKD com formas mais amplas de ESKD (estágio 5). Trinta e cinco variantes significativas em todo o genoma em dois loci foram encontradas associadas a ESKD de todas as causas, incluindo 15 variantes dentro ou perto de EFNB2 e 20 variantes em APOL1 (Fig. 1b). A associação superior em APOL1 foi rs9622363 (P=1.96 × 10−25, OR=0.68, EAF=0.43), e o sinal superior perto de EFNB2 foi rs77113398 (P=9.84 × 10−9 , OR=1.94, EAF=0.023) (Tabela 4, Fig. 2b). Quatro loci independentes adicionais demonstraram associação sugestiva (P < 5="" ×="" 10−6)="" com="" eskd="" de="" todas="" as="" causas="" em="" lpp,="" fstl5,="" oprk1/atpv1h="" e="" sybu/kcnv1="" (tabela="" 4,="" fig.="">
Análise de associação excluindo portadores de genótipo de risco renal APOL1
Uma análise secundária foi realizada excluindo portadores de genótipo de risco renal APOL1 em casos de T2D-ESKD e controles não diabéticos não nefropáticos (modelo APOL1-negativo) para enriquecer para ESKD associado a T2D. O modelo de linha de base mostrou uma forte associação de APOL1 e MYH9 com T2D-ESKD (Tabela 3, Fig. 1a), sugerindo que alguns casos podem ter sido classificados erroneamente e mais provavelmente tinham ESKD não diabético. Um total de 664 casos T2D-ESKD e 918 controles não diabéticos não nefropatas foram excluídos da análise do estágio 1, deixando 2.768 casos T2D-ESKD e 6.059 controles no modelo APOL{28}}negativo. Associações nominais com T2D-ESKD (P < 1="" ×="" 10−5="" )="" foram="" observadas="" com="" 522="" variantes="" (66="" delas="" alcançaram="" significância="" em="" todo="" o="" genoma;="" arquivo="" adicional="" 1:="" tabela="" s2),="" e="" estas="" foram="" selecionadas="" para="" análise="" de="" discriminação="" de="" estágio="" 3.="" duzentas="" e="" vinte="" e="" três="" variantes="" que="" apresentavam="" evidência="" de="" associação="" com="" dm2="" per="" se="" (arquivo="" adicional="" 1:="" tabela="" s4)="" e="" 24="" variantes="" mostrando="" forte="" heterogeneidade="" (i2="" maior="" ou="" igual="" a="" 80)="" na="" meta-análise="" foram="" removidas.="" entre="" as="" variantes="" significativas="" em="" todo="" o="" genoma="" identificadas="" no="" modelo="" de="" linha="" de="" base,="" rs142671759="" em="" enpp7="" (p="4.10" ×="" 10−8,="" or="2.30," eaf="0.024)" mostrou="" um="" associação="" consistente="" com="" t2d-eskd="" no="" modelo="" apol{61}}negativo.="" duas="" variantes="" adicionais="" alcançaram="" significância="" em="" todo="" o="" genoma,="" rs75029938="" em="" gramd3="" (p="2,02" ×="" 10–9,="" or="1,89," eaf="0,042)" e="" rs17577888="" na="" região="" mgat4c="" (p="3,87" ×="" 10−8,="" or="0,67," eaf="0,087)" (tabela="" 5,="" fig.="">
Testamos ainda 275 associações sugestivas de T2D-ESKD que passaram na discriminação e tiveram I2 < 80="" em="" 1019="" casos="" de="" eskd="" não="" diabéticos="" aa="" adicionais="" que="" excluíram="" portadores="" de="" genótipo="" de="" risco="" renal="" apol1.="" quinze="" variantes="" mostraram="" evidência="" nominal="" de="" associação="" com="" eskd="" não="" diabética.="" estes="" foram="" posteriormente="" testados="" em="" uma="" meta-análise="" eskd="" de="" todas="" as="" causas,="" incluindo="" 3.787="" casos="" de="" eskd="" de="" todas="" as="" causas="" e="" 6.059="" controles="" não="" diabéticos="" não="" nefropáticos,="" dos="" quais="" os="" portadores="" de="" genótipo="" de="" risco="" renal="" apol1="" foram="" excluídos.="" uma="" 2-exclusão="" de="" par="" de="" bases="" em="" gng7,="" rs373971520="" (p="2.17" ×="" 10−8="" ,="" or="1.46," eaf="0.11)," alcançou="" todo="" o="" genoma="" associação="" significativa="" com="" eskd="" de="" todas="" as="" causas="" (fig.="" 3b).="" sete="" loci="" adicionais="" exibiram="" associação="" nominal="" com="" eskd="" de="" todas="" as="" causas="" (p="">< 5="" ×="" 10−6),="" incluindo="" lpp,="" alk/ypel5,="" mnx1-as1/ube3c,="" nup98,="" linc01075/linc00448,="" tmco5a="" e="" sulf2/linc01522="" (tabela="" 6).="" as="" associações="" superiores="" do="" modelo="" de="" linha="" de="" base="" tiveram="" insignificância="" de="" atenuação="" moderada,="" apesar="" dos="" tamanhos="" de="" efeito="" semelhantes,="" devido="" em="" parte="" ao="" tamanho="" reduzido="" da="" amostra="" (arquivo="" adicional="" 1:="" tabela="" s5).="" além="" disso,="" um="" terceiro="" gwas="" foi="" realizado="" com="" apol1="" incluído="" como="" covariável="" no="" modelo="" (apo="" l1-modelo="" ajustado)="" e="" comparando="" os="" valores="" −log="" (p)="" com="" os="" modelos="" de="" linha="" de="" base="" e="" apol1-negativos.="" uma="" alta="" correlação="" (coeficiente="" de="" correlação="" de="" pessoa="" r="0.95)" foi="" observada="" entre="" os="" modelos="" apol1-ajustados="" e="" apol1--="" negativos.="" os="" resultados="" de="" todas="" as="" três="" comparações="" estão="" incluídos="" na="" documentação="" complementar="" (arquivo="" adicional="" 1:="" figura="">
Discussão
Relatamos os resultados de um GWAS de alta densidade investigando a suscetibilidade genética para T2D-ESKD em 15.075 AAs. As principais variantes associadas com T2D-ESKD foram posteriormente avaliadas para associação com ESKD não diabética, e uma meta-análise foi realizada para testar sua generalização para formas comuns de ESKD. Oito associações independentes em sete loci genéticos exibiram associação significativa em todo o genoma com T2D-ESKD na linha de base ou modelos{12}}negativos de APOL, incluindo RND 3/RBM43, SLITRK3, ENPP7, GNG7, APOL1, GRAMD3 e MGAT4C. Além de APOL1, dois loci significativos em todo o genoma foram associados a ESKD de todas as causas, EFNB2 e GNG7. Além disso, 10 loci genéticos demonstraram associação nominal com ESKD de todas as causas (P < 5="" ×="" 10−6),="" incluindo="" lpp,="" fstl5,="" oprk1/atp6v1h,="" sybu/kcnv1,="" alk/ypel5,="" mnx1-as1/ube3c,="" nup="" 98,="" linc01075/linc00448,="" tmco5a="" e="" sulf2/lin="">
A associação mais significativa entre T2D-ESKD (OR=0,77, P=1,42 × 10−10) e ESKD de todas as causas (OR=0,69, P {{11) }} .96 × 10−25) no modelo de linha de base era uma variante intrônica rs9622363 na região APOL1 associada a não-diabéticosrim doençaem indivíduos com ascendência africana. O condicionamento nos alelos APOL1 G1 e G2 diminui drasticamente sua significância [6]. rs9622363 é relatado para alterar os motivos de ligação do fator de transcrição (TF) (Arquivo adicional 1: Tabela S6). Em um estudo recente, os alelos rs9622363 e APOL1 G1 formaram um haplótipo que alcançou a associação mais forte com DRC em nigerianos [19]. Ao contrário de G1 ou G2, o alelo principal em rs9622363 (G, EAF=0.57) está associado ao risco de DRC. Após a exclusão de portadores do genótipo de risco renal APOL1, a associação com rs9622363 foi atenuada. Isso confirmou que os alelos rs9622363 e APOL1 G1 e G2 contribuem para o mesmo sinal. A identificação de rs9622363 no modelo de linha de base pode sugerir a classificação errônea de alguns casos como T2D-ESKD.
Uma variante intergênica (rs72858591) localizada entre um gene da proteína GTPase RND3 e RBM43, que codifica a proteína 43 do motivo de ligação ao RNA, revelou uma associação significativa em todo o genoma com T2D-ESKD. Está associado a alterações de motivos de ligação a TF e sobreposições com regiões promotoras e potenciadoras (Arquivo adicional 1: Tabela S6). Uma variante intergênica independente (rs7560163, r2=0.01, YRI) nesta região foi previamente associada ao DM2 em AAs [20]. Em contraste, rs72858591 não foi associado com DM2 (P=0.073) no presente estudo. Isso pode sugerir que dois conjuntos diferentes de variações neste locus contribuem de forma independente para DM2 e DT2-ESK, um possível efeito pleiotrópico. Duas variantes independentes (rs142563193 e rs142671759) que foram significativamente associadas a todo o genoma com T2D-ESKD estão localizadas perto de ENPP7. Essas variantes se sobrepõem a regiões de intensificador e promotor, picos hipersensíveis a DNase e/ou motivos de ligação a TF (Arquivo adicional 1: Tabela S6). A proteína codificada pela ENPP7 é uma esfingomielina fosfodiesterase alcalina intestinal que converte a esfingomielina em ceramida e fosfocolina. A ENPP7 afeta a absorção de colesterol [21], e vários estudos sugerem que os níveis de colesterol de lipoproteína de alta densidade são fatores de risco para DRC em pacientes com diabetes [22-24].
Duas variantes localizadas em GNG7 foram associadas a T2D-ESKD (rs4807299; P=3,21 × 10−8, modelo de linha de base) ou ESKD de todas as causas (rs373971520; P=2,17 × 10− 8; APOL1-modelo negativo). Rs4807299 está associado a alterações de motivos de ligação a TF e sobreposições com regiões promotoras e potenciadoras (Arquivo adicional 1: Tabela S6). GNG7 codifica a subunidade de proteína G Gamma 7, envolvida na função do sistema nervoso central [25] e risco de câncer [26, 27].
Como os afro-americanos com diabetes e proteinúria muitas vezes não fazem uma biópsia renal diagnóstica, presume-se que sua ESKD tenha sido causada por DKD. No entanto, APOL1-associou pacientes não diabéticosrimdoençapode ser a verdadeira causa da doença renal em muitos desses pacientes. Análises excluindo portadores de genótipo de risco renal APOL1 criaram um grupo de casos mais homogêneo e ofereceram uma oportunidade para descobrir a arquitetura genética de T2D-ESKD que é independente do efeito APOL1. No modelo APOL1-negativo, além de replicar a ENPP7 identificada no modelo de linha de base, dois novos loci
alcançaram uma associação significativa em todo o genoma com T2D ESKD: GRAMD3 (rs75029938; P=2,02 × 10−9) e MGA T4C (rs17577888; P=3,87 × 10−8). A anotação funcional sugeriu que ambas as variantes estão co-localizadas com motivos de ligação a TF. Rs75029938 pode cair em regiões de intensificador e promotor, e rs17577888 foi associado à abundância de transcrição do gene FLVCR1 em monócitos de sangue periférico (P=6 0,41 × 10−6; Arquivo adicional 1: Tabela S6). A variação genética no GRAMD3 foi associada à adiposidade em uma meta-análise multiétnica do genoma [28]. Estudos anteriores sugerem que a obesidade é um importante fator de risco para DKD [29]. MGAT4C codifica Manosil (Alfa-1,3-)-Glicoproteína Beta-1,4-N-Acetilglucosaminiltransferase, Isozima C, que participa da transferência de N-acetilglucosamina (GlcNAc) aos resíduos de manose do núcleo de glicanos ligados a N. O potencial envolvimento de MGAT4C na DKD requer mais estudos.
Esta análise incluiu uma coorte de AAs com ESKD não diabética para avaliar a generalização de loci associados a T2D-ESKD em formas comuns de DRC. A meta-análise combinando casos com T2D-ESKD e ESKD não diabético identificou dois novos loci significativos em todo o genoma associados a ESKD de todas as causas, além de APOL1; rs77113398 perto de EFNB2 (P=9,84 × 10−9; modelo de linha de base) e rs373971520 em GNG7 (2,17 × 10−8; APOL1-modelo negativo). Rs77113398 se sobrepõe com intensificador, regiões promotoras e picos de DNase (Arquivo adicional 1: Tabela S6). Varreduras prévias do genoma em AAs identificaram evidências significativas de ligação ao ESKD no cromossomo 13q33, incluindo a região EFNB2 em ESKD diabético e ESKD não diabético [30, 31]. Um estudo de acompanhamento examinou 28 variantes de marcação abrangendo 39 quilobases (kb) da região de codificação EFNB2 demonstrou associações nominais entre duas variantes e ESKD de todas as causas [32]. No entanto, essas variantes relatadas não foram correlacionadas com rs77113398. A efrina-B2 (EFNB2) é expressa no néfron em desenvolvimento; interações entre efrina-B2 e seus receptores desempenham um papel importante na montagem microvascular glomerular [33]. Além disso, a sinalização reversa da efrina-B2 protege contra a rarefação capilar peritubular regulando a angiogênese e a estabilidade vascular duranterimprejuízo[34]. A efrina-B1 também co-localiza com a proteína associada a CD2-(CD2AP) e nefrina no diafragma da fenda do podócito e desempenha um papel importante na manutenção da função de barreira no diafragma da fenda [35]. Camundongos transgênicos para receptor de efrina B4 quinase desenvolvem glomerulopatia, manifestada por arteríolas aferentes e eferentes fundidas contornando os glomérulos [36]. Assim, várias linhas de evidência apoiam a potencial associação do EFNB2 com a DRC, e é o gene causal mais promissor da associação de rs77113398.
Este estudo tem pontos fortes e limitações. Embora o desenho do estudo em vários estágios tenha sido bem desenvolvido, incluindo 15.075 AAs, faltava replicação de associações T2D-ESKD, particularmente para variantes raras. Além disso, vários sinais significativos em todo o genoma mostraram tamanhos de efeito significativamente diferentes entre os estágios, o que provavelmente foi atribuído às diferenças de tamanho da amostra entre os estágios e uma consequência da "maldição do vencedor", um fenômeno que descreve que o verdadeiro tamanho do efeito genético é superestimado por causa de o achado inicial positivo. Replicação futura é necessária para confirmar esses achados. Existem poucas outras coleções existentes com amostras apropriadas em AAs; isso limitava os esforços de replicação. Além disso, é difícil excluir todos os indivíduos classificados erroneamente com DKD devido à frequente falta de biópsias renais. Portanto, excluímos cuidadosamente amostras com ESKD atribuídas a etiologias não diabéticas com base em fenótipos clínicos e, posteriormente, excluímos portadores de genótipo de risco renal APOL1 com alto risco de ESKD não diabética. Isso deve minimizar erros de classificação.
Conclusão
Em conclusão, um GWAS foi conduzido em AAs com T2D-ESKD e sete loci genéticos exibiram evidências significativas de associação em todo o genoma, incluindo RND3/RBM43, SLITRK3, ENPP7, GNG7, APOL1, GRAMD3 e MGAT4C. Além de APOL1, EFNB2 e GNG7 também foram associados a ESKD não diabético e revelaram uma associação significativa em todo o genoma com ESKD de todas as causas. Investigações futuras, incluindo replicação genética e validação experimental dessas associações recém-identificadas, são necessárias para avaliar seus impactos potenciais nos processos biológicos que levam à DKD avançada em populações com ascendência africana recente.
Métodos
Participantes do estudo
Os participantes do estudo foram recrutados pela Wake Forest School of Medicine (WFSM; N=8052), Family Investigation of Nephropathy and Diabetes (FIND; N=926), Jack son Heart Study (JHS; N {{2 }}), Estudo de Risco de Aterosclerose em Comunidades (ARIC; N=2221), Desenvolvimento de Risco de Artéria Coronária em Adultos Jovens (CARDIA; N=912) e Estudo Multiétnico de Aterosclerose (MESA; N { {6}}). As análises foram aprovadas por conselhos de revisão institucional locais e todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito. Foram considerados casos de DRT-DMT, incluindo DK grave, quando o diagnóstico de diabetes foi maior ou igual a 5 anos antes do início da DRT ou com retinopatia diabética para garantir duração adequada de DMT2, com terapia de substituição renal, taxa de filtração glomerular estimada ( eGFR) menor ou igual a 30 ml/min/1,73 m2 (CKD4), ou razão albumina/creatinina na urina (UACR) maior ou igual a 300 mg/g (macroalbuminúria). Participantes com DRC4 ou macroalbuminúria (N=138) foram incluídos como casos devido ao alto risco de desenvolver ESKD. O DM2 foi diagnosticado de acordo com os critérios da American Diabetes Association com glicemia de jejum maior ou igual a 126 mg/dl, 2-h teste oral de tolerância à glicose glicose maior ou igual a 200 mg/dl, glicose aleatória maior ou igual a 200 mg/dl, uso de medicamentos para diabetes ou diagnóstico médico de diabetes. Casos com ESKD não diabética não apresentavam diabetes (ou tinham DM2 por < 5="" anos)="" no="" início="" da="" terapia="" de="" substituição="" renal,="" e="" a="" eskd="" foi="" atribuída="" a="" doença="" glomerular="" crônica="" (por="" exemplo,="" glomeruloesclerose="" segmentar="" focal),="" nefropatia="" associada="" ao="" hiv,="" hipertensão="" ou="" desconhecido="" causa.="" pacientes="" com="" drt="" atribuída="" a="" causas="" cirúrgicas="" ou="" urológicas,="">doenca renal, doença autoimune, hepatite, nefropatia por IgA, glomerulonefrite membranosa, glomerulonefrite membranoproliferativa ou monogênicarimdoençasforam excluídos. Os controles não diabéticos não nefropáticos incluíram participantes sem diabetes ourim doença(eGFR maior ou igual a 60 ml/min/ 1,73 m2 e UACR < 30="" mg/g).="" indivíduos="" com="" nefropatia="" sem="" dm2="" tinham="" tfge="" maior="" ou="" igual="" a="" 60="" ml/min/1,73="" m2="" e="" uacr="">< 30="">
Preparação de amostras, genotipagem, imputação e controle de qualidade
Os participantes do estudo foram genotipados em todo o genoma usando três plataformas diferentes: (1) 8704 amostras recrutadas de WFSM, ARIC, CARDIA, JHS, MESA e FIND foram genotipadas no polimorfismo de nucleotídeo único humano Affymetrix Genome-wide (SNP) matriz 6.0 (Affy6.0); (2) 3133 amostras recrutadas do WFSM foram genotipadas no Affymetrix Axiom Biobank Genotyping Array (Axiom); e (3) 3.238 amostras recrutadas do WFSM foram genotipadas no Illumina Multi-Ethnic Genotyping Array (MEGA). O controle de qualidade e a imputação foram realizados separadamente por cada plataforma de genotipagem conforme descrito abaixo.
As variantes que passaram no controle de qualidade (QC) foram imputadas a um painel de referência de haplótipos combinados, incluindo o painel de referência cosmopolita 1000 Genomes fase 3 (versão de outubro de 2014) [37] e uma versão do painel de referência do African Genome Variation Project (AGVP), incluindo 640 Haplótipos de ascendência africana gentilmente cedidos pela Parceria Africana paraPesquisa de Doenças Crônicase Wellcome Trust Sanger Institute [38]. A pré-fase foi realizada usando SHAPEIT2 [39], e a imputação foi realizada usando IMPUTE2 [40]. O CQ pós-imputação foi realizado para excluir variantes com incompatibilidade de alelos ou com grande discrepância de frequência (maior ou igual a 0,2) com o painel de referência (0,2 × frequência em EUR mais {{ 13}},8 × frequência em AFR) e pontuação de informação de imputação < 0,4.="" um="" subconjunto="" de="" amostras="" foi="" genotipado="" diretamente="" para="" variantes="" apol1="" g1="" e="" g2="" usando="" sequenom="" (sequenom,="" san="" diego,="" ca).="" a="" concordância="" foi="" de="" 95="" por="" cento="" com="" os="" genótipos="">
Affy6.0 conjuntos de dados
Conforme descrito anteriormente [41], 1.513 casos T2D-ESKD, 5.299 controles não diabéticos sem nefropatia e 1.892 controles T2D sem nefropatia das coortes WFSM, FIND, JHS, ARIC, CARDIA e MESA foram genotipados usando Affy6.{{ 11}} (Tabela 1). Em cada estudo, medidas de CQ padrão foram aplicadas para excluir variantes com taxa de chamada < 95="" por="" cento="" ,="" frequência="" de="" alelos="" menores="" (maf)="">< 0.01="" ou="" mostrando="" desvio="" do="" equilíbrio="" de="" hardy-weinberg="" (hwe)="" (p="">< 0,0001).="" o="" qc="" da="" amostra="" foi="" realizado="" para="" excluir="" indivíduos="" com="" taxas="" de="" chamadas="">< 95="" por="" cento,="" contaminação="" de="" dna,="" duplicatas="" ou="" valores="" discrepantes="" da="" população.="" dado="" que="" cardia,="" jhs="" e="" mesa="" não="" tinham="" casos="" com="" t2d-eskd,="" as="" amostras="" desses="" estudos="" foram="" combinadas="" para="" análises="" de="" imputação="" e="" associação="" juntamente="" com="" wfsm,="" find="" e="">
Conjunto de dados Axiom
No WFSM, 1700 casos AA com T2D-ESKD, 770 controles AA sem diabetes ou nefropatia e 663 controles AA com T2D sem nefropatia foram genotipados em uma matriz de genotipagem Axiom personalizada (Tabela 2). Informações detalhadas de variantes, design de conteúdo personalizado, incluindo mapeamento fino de regiões candidatas, métodos de genotipagem e QC foram relatados anteriormente [42]. Em resumo, essa matriz incluiu aproximadamente 264 mil variantes de codificação e inserções/exclusões (indels), 70 mil variantes de perda de função, 2 mil variantes farmacogenômicas, 23 mil marcadores eQTL, 246 mil marcadores multiétnicos com base no genoma e 115 mil marcadores personalizados marcadores de conteúdo. Foram excluídas variantes com taxas de chamada < 95="" por="" cento,="" desvio="" de="" hwe="" (p="">< 0,0001)="" e="" variantes="" monomórficas.="" um="" total="" de="" 724.530="" variantes="" foram="" chamadas="" com="" sucesso="" para="" cq,="" imputação="" e="" análises="" a="" jusante.="" o="" qc="" da="" amostra="" foi="" realizado="" para="" excluir="" indivíduos="" com="" baixas="" taxas="" de="" chamadas="">< 95%),="" gender="" discordance,="" dna="" contamination,="" duplication,="" or="" population="">
Conjunto de dados MEGA
No WFSM, 1910 casos de ESKD não diabéticos, 219 casos de ESKD T2D, 201 controles com T2D sem nefropatia e 908 controles sem nefropatia não diabéticos foram genotipados na matriz MEGA (Tabela 2). Essa matriz foi projetada para melhorar o mapeamento fino e a descoberta funcional, aumentando a cobertura de variantes em várias etnias. A matriz inclui (1) conteúdo de backbone contendo variantes altamente informativas para GWAS e análises de exoma em populações ancestralmente diversas e (2) conteúdo personalizado usado para replicar ou generalizar associações GWAS de índice, aumentar variantes de marcação GWAS em regiões prioritárias, aprimorar o conteúdo de exoma em regiões prioritárias , mapear loci GWAS, identificar variantes regulatórias funcionais, explorar variantes medicamente importantes e identificar novos loci variantes em vias candidatas [43]. A genotipagem foi realizada no WFSM. O DNA de casos e controles foi igualmente intercalado em 96-placas de poços para minimizar erros de artefatos durante o processamento da amostra. Um total de 48 amostras sequenciadas como parte do Projeto 1000 Genomas [44] no Coriell Institute for Medical Research foram incluídas na genotipagem e tiveram uma taxa de concordância de 98,57%. A chamada do genótipo foi realizada usando o Genome Studio (Illumina, CA, EUA). Variantes com posição ausente, alelo ausente, incompatibilidade de alelos, taxas de chamada < 95="" por="" cento,="" desvio="" de="" hwe="" (p="">< 0,0001),="" diferença="" de="" frequência=""> 0,2 em comparação com o painel de referência da fase 3 do Projeto Genoma 1000 e variantes monomórficas foram removidas. Vários conjuntos de sondas foram comparados e apenas aquele com a maior taxa de chamadas foi mantido. Um total de 1.705.970 variantes foram chamadas com sucesso para controle de qualidade, imputação e análises downstream. O QC da amostra foi realizado para excluir indivíduos com baixa taxa de chamadas (< 95%),="" gender="" discordance,="" dna="" contamination,="" duplication,="" or="" population="" outliers.="" dna="" swapping="" was="" identified="" and="">
Análise estatística
Estágio de descoberta
Usamos um desenho de estudo em vários estágios para identificar variantes associadas ao T2D-ESKD e seu papel potencial em ESKD de todas as causas. Na fase de descoberta, foram incluídos 3.432 casos T2D-ESKD e 6.977 controles não diabéticos não nefropatas de todos os três conjuntos de dados (Fig. 1). A análise de associação foi realizada para cada conjunto de dados usando um método de modelo logístico misto implementado no programa GMMAT [45] sob um modelo genético aditivo. Este método controla a estrutura populacional e a relação enigmática, incluindo uma matriz de relacionamento genético (GRM) estimada a partir de um conjunto de variantes autossômicas de alta qualidade como um efeito aleatório. A análise de componentes principais foi realizada usando EIGENSOFT [46] para cada plataforma de genotipagem. O primeiro autovetor (PC1) juntamente com idade e sexo foram usados como covariáveis. Uma meta-análise foi realizada nos três conjuntos de dados usando um método de ponderação de variância inversa de efeito fixo implementado em METAL [47]. Associações sugestivas para T2D-ESKD com P < 1="" ×="" 10−5,="" contagem="" de="" alelos="" menores="" (mac)=""> 400 e heterogeneidade I2 < 80="" foram="" selecionadas="" para="" análise="" de="">
Fase de discriminação
Para determinar se loci putativos associados a T2D-ESKD no estágio de descoberta foram impulsionados por associações com T2D per se, uma meta-análise combinando 2.756 AAs com nefropatia sem T2D e 6.977 controles sem nefropatia não diabéticos dos três conjuntos de dados (Affy6 .0, Axiom e MEGA) (estágio 3, Fig. 1). Variantes mostrando associação nominal (P < 0="" 0,05)="" com="" t2d="" foram="" excluídas="" para="" remover="" variantes="" associadas="" a="">
Análise de extensão de ESKD não diabético e meta-análise de ESKD de todas as causas
Variantes genéticas mostrando associação sugestiva com T2D-ESKD (P < 1 × 10−5), mas não associadas com DM2, foram examinadas em uma coorte ESKD não diabética, incluindo 1910 casos ESKD não diabéticos e 908 controles não diabéticos não nefropatas do Conjunto de dados WFSM-MEGA para associação com etiologias não diabéticas dedoenca renal(etapa 4). Variantes mostrando associação nominal (P < 0.05)="" foram="" testadas="" em="" uma="" meta-análise="" de="" eskd="" de="" todas="" as="" causas="" usando="" todos="" os="" eskd="" t2d,="" eskd="" não="" diabéticos="" e="" controles="" dos="" três="" conjuntos="" de="" dados="" (="" n="12,319," affy6.0,="" axiom,="" mega)="" (fig.="" 1).="" esta="" meta-análise="" avaliou="" se="" as="" associações="" t2d-eskd="" contribuíram="" para="" o="" risco="" de="" eskd="" por="" todas="" as="" causas.="" também="" pesquisamos="" nossas="" principais="" variantes="" associadas="" à="" doença="" renal="" para="" associação="" putativa="" com="" dm2="" em="" aas="" do="" consórcio="" media="" (n="15.043" casos="" e="" 22.318="" controles);="" snps="" com="" p="">< 0,05="" após="" múltiplas="" correções="" de="" comparação="" foram="">
Exclusão de portadores do genótipo de risco APOL1
Os alelos APOL1 G1 e G2 contribuem para o risco dedoença renal não diabética[6, 48]. Para minimizar a classificação errônea de T2D-ESKD, uma segunda análise foi realizada excluindo portadores de duas variantes de risco renal APOL1 e aqueles com genótipos APOL1 ausentes de casos T2D ESKD e controles não diabéticos sem nefropatia (APOL1-modelo negativo ). Essa análise reduziu a heterogeneidade da população apesar de reduzir o tamanho da amostra e ter menor poder estatístico. Especificamente, 308 casos T2D-ESKD e 630 controles dos conjuntos de dados Affy6.0, 323 casos T2D-ESKD e 113 controles do conjunto de dados Axiom e 33 casos T2D-ESKD e 175 controles do conjunto de dados MEGA foram removidos. Além disso, removemos 891 dos casos de ESKD de todas as causas de 1910. Esta análise pode desmascarar os efeitos de outros loci ESKD não diabéticos além do APOL1. Os indivíduos foram considerados portadores da variante de risco renal APOL1 se carregassem dois alelos G1 (alelo rs60910145 G, alelo rs73885319 G), dois alelos G2 (rs143830837, deleção de 6 pares de base em quadro), ou eram heterozigotos compostos (um G1 e um alelo G2) [6].
Caracterização funcional
Proxies de variantes associadas a T2D-ESKD significativas em todo o genoma (r2 maior ou igual a 0,7 em 1000 genomas da população AFR) da linha de base e modelos APOL1-negativos foram selecionados usando LDlink [49 ]. As variantes principais e proxies foram então consultadas para anotações funcionais do HaploReg [50], que incluíam o estado da cromatina e a anotação de ligação a proteínas dos projetos Roadmap Epigenomics [51] e ENCODE [52], conservação de sequência em mamíferos, o efeito de variantes na regulação motivos e expressão gênica de estudos de QTL.
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