Imunidade inata epitelial gastrointestinal - regionalização e organoides como novo modelo

O trato gastrointestinal humano está em constante contato com estímulos microbianos. Suas barreiras devem garantir a coexistência com as bactérias comensais, permitindo a vigilância de patógenos intrusos. No centro da interação está a camada epitelial, que marca os limites do corpo. Ele é equipado com uma infinidade de diferentes sensores imunológicos inatos, como receptores semelhantes a Toll, para montar respostas inflamatórias a micróbios. A disfunção desse intrincado sistema resulta em patologias associadas à inflamação, como a doença inflamatória intestinal. No entanto, a complexidade das interações celulares, sua base molecular e seu desenvolvimento permanecem pouco compreendidos. Nos últimos anos, os organoides derivados de células-tronco ganharam atenção crescente como modelos promissores tanto para o desenvolvimento quanto para uma ampla gama de patologias, incluindo doenças infecciosas. Além disso, os organoides permitem o estudo da imunidade inata epitelial in vitro. Nesta revisão, nos concentramos na barreira epitelial gastrointestinal e sua organização regional para discutir a detecção e o desenvolvimento imune inato.

A exposição a estímulos microbianos pode melhorar a imunidade, porque os estímulos microbianos podem estimular o corpo a produzir células imunes e moléculas imunes, estimulando assim a resposta imune do corpo. Especificamente, a exposição a estímulos microbianos pode ativar células imunes, como macrófagos, células dendríticas e células assassinas naturais, acelerar a proliferação e diferenciação de células imunes e melhorar a vitalidade e a resistência a doenças das células imunes. Além disso, os estímulos microbianos também podem promover respostas inflamatórias e regulação imunológica e melhorar a defesa imunológica do corpo contra patógenos. Portanto, uma exposição razoável a estímulos microbianos pode promover a melhora da imunidade humana. Pode-se ver que precisamos melhorar a imunidade. Cistanche pode melhorar significativamente a imunidade. A cinza da carne contém vários ingredientes biologicamente ativos, como polissacarídeos, dois cogumelos, Huang Li, etc. Esses ingredientes podem estimular vários tipos de carne no sistema imunológico. células, aumentando sua viabilidade imunológica.

Clique em benefícios para a saúde de cistanche

Palavras-chave

Trato gastrointestinal. Imunidade. Regionalização e organoides.

Introdução

O trato gastrointestinal (GI) é necessário para a digestão dos alimentos e se estende da cavidade oral através do esôfago, estômago, intestino delgado e intestino grosso até o ânus. O lúmen GI é colonizado por uma grande variedade de comensais, simbiontes e, ocasionalmente, patógenos. A colonização microbiana segue um gradiente com menos de 103 micróbios/ml no estômago para 103 –107 micróbios/ml no intestino delgado e 1011–1012 micróbios/ml no cólon (revisado em [1-3]). Do estômago glandular em diante, o trato GI é revestido por uma única camada de células epiteliais colunares. Esta camada epitelial compreende diferentes células especializadas, fortemente interligadas por complexos de proteínas juncionais, reforçando a barreira física (Fig. 1).

A interação entre a microbiota intestinal, bem como patógenos ingeridos e células epiteliais é mediada por receptores de reconhecimento de padrão (PRRs), incluindo receptores semelhantes a Toll (TLRs), domínio de oligomerização de ligação a nucleotídeos (NOD) - como receptores (NLRs) e outros receptores citosólicos (Fig. 2, revisado em [7, 11]). Esses PRRs desempenham um papel fundamental no reconhecimento de padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs) e padrões moleculares associados a danos (DAMPs). Após a ativação do PRR nas células epiteliais, as cascatas de sinalização a jusante induzem a expressão de diferentes citocinas e quimiocinas por meio de vias inflamatórias, como a via NF-κB, para direcionar as células imunes profissionais (revisto em [8, 12–16]). Além dos PRRs clássicos, outros sensores de atividades bacterianas, como a alfa-quinase 1 (ALPK1), foram descobertos recentemente [17-19]. Os inflamassomas, complexos citoplasmáticos compostos por proteínas NLR, reconhecem padrões moleculares adicionais, como metabólitos bacterianos (revisado em [7, 9]).

As respostas imunes inatas gastrointestinais, incluindo a detecção de PRR, devem equilibrar a necessidade de proteção contra patógenos potencialmente nocivos com a capacidade de tolerar a exposição ao diverso microbioma luminal. Portanto, espera-se que a expressão e a função da sinalização PRR tenham um grande impacto não apenas na detecção de patógenos, mas também na homeostase tecidual (Caixa 1) e doenças inflamatórias, incluindo gastroenterite aguda, gastrite e doenças inflamatórias intestinais (DIIs) (revisado em [ 12, 13, 20, 21]). Embora cada uma dessas doenças exiba patogêneses completamente diferentes, elas compartilham uma característica crítica: a interface entre o ambiente e o corpo é significativamente perturbada. No entanto, existe um debate em curso sobre se as alterações na camada epitelial intestinal, em particular aquelas que afetam sua função imune inata, são causa ou consequência das doenças acima mencionadas.

A maior parte do conhecimento sobre a sinalização PRR foi obtida a partir de pesquisas em células hematopoiéticas. Tem sido um desafio discriminar as funções da sinalização PRR nas células epiteliais daquelas das células imunes infiltradas. Os principais obstáculos incluem dificuldades em isolar células epiteliais puras e criar anticorpos confiáveis ​​contra PRRs. Com o avanço dos organoides derivados de células-tronco epiteliais intestinais, está disponível um modelo experimental reducionista que permite investigações sobre a resposta imune inata das células epiteliais primárias. Os organoides são definidos como culturas de células 3- dimensionais derivadas de células-tronco que têm a capacidade de auto-organização e retêm algumas das funções do órgão original (por exemplo, secreção, filtração, absorção, contração). Como os organoides podem ser cultivados a partir de células-tronco adultas residentes em tecidos (ASCs) ou de células-tronco pluripotentes (PSCs), as células não são transformadas. Juntos, os dois tipos de organoides cobrem um extenso repertório de órgãos que podem ser imitados (revisado em [4, 22, 23]). Ambas as tecnologias têm suas vantagens (revisadas em [4, 22, 23]). Por exemplo, as culturas de organoides derivados de ASC têm um tremendo potencial de expansão e são relativamente homogêneas, e os organoides derivados de PSC são mais complexos no sentido de que combinam células de origens de desenvolvimento muito diferentes (por exemplo, células epiteliais e mesenquimais). Organoides derivados de PSC permitem a análise das etapas de desenvolvimento, mas podem não atingir o nível total de diferenciação na camada epitelial como encontrado in vivo [24]. Os organoides derivados de ASC gerados a partir de tecidos fetais também podem permitir o estudo da maturação dos epitélios fetais, uma vez que envelhecem em cultura [24, 25].

Esta revisão destacará insights de estudos usando organoides e discutirá o potencial dessa tecnologia para o estudo da imunidade inata epitelial. Nós nos concentramos na organização regional no trato gastrointestinal.

Identidade regional e sinalização imune inata no trato GI

Ao observar as doenças gastrointestinais, é importante observar que algumas delas estão confinadas a uma seção específica do trato gastrointestinal. A DII inclui a doença de Crohn (DC) e a colite ulcerosa (UC), que apresentam um padrão de inflamação diferencial e específico da doença: enquanto a CU começa no reto e é encontrada no cólon, a DC pode afetar todas as partes do trato gastrointestinal desde da cavidade oral até o ânus. Além disso, a DC é caracterizada por inflamação segmentar e descontínua dentro do trato GI, enquanto a UC é geralmente descrita como uma inflamação contínua do cólon (revisto em [26, 27]). No esôfago, estômago e cólon, a incidência de câncer é alta, e a infecção e a inflamação podem promover o desenvolvimento e a progressão desses cânceres (revisado em [28, 29]). Em contraste, a transformação maligna no intestino delgado é muito rara (revisto em [30]). A aparente especificidade do segmento dessas doenças no trato gastrointestinal permanece enigmática, mas é tentador especular que sua origem específica da região está enraizada em distúrbios específicos da região do sistema fortemente equilibrado de função de barreira epitelial, imunidade inata e regeneração da mucosa . Portanto, é interessante destacar diferenças nos segmentos dentro do trato GI.

O trato GI compreende vários segmentos anatomicamente definidos com funções físicas amplamente distintas (revisto em [31]). A principal função do estômago é a digestão dos alimentos e a eliminação de patógenos recebidos pelo ácido gástrico. Os nutrientes não precisam atingir a camada epitelial do estômago; assim, o corpo investe pesadamente em uma barreira protetora de muco, protegendo as células epiteliais não apenas de seu ácido, mas também do conteúdo luminal (revisto em [32, 33]). Por outro lado, a principal função do intestino delgado não é apenas a digestão, mas também a absorção de nutrientes. De acordo com isso, o intestino delgado tem uma área de superfície significativamente aumentada devido às vilosidades que se projetam para o lúmen intestinal, onde as superfícies celulares entram em contato próximo com os nutrientes. A maior parte da digestão ocorre no intestino delgado proximal, duodeno e jejuno, onde as vilosidades são longas e finas. O jejuno tem a maior proporção de células de Paneth secretando peptídeos antimicrobianos [34], que decoram o muco bastante solto, guardando assim a camada epitelial e mantendo as criptas estéreis (revisto em [35]).

As vilosidades tornam-se progressivamente mais curtas e largas em direção ao íleo (revisto em [36]), onde novamente o muco assume uma parte importante da proteção: com a maior proporção de células caliciformes, o íleo tem uma camada de muco mais espessa e uma menor taxa de digestão e absorção do que o jejuno [34] (revisado em [31]). Por fim, o cólon reabsorve a água e investe em uma cobertura de muco extensa, espessa e de duas camadas para poder abrigar com segurança trilhões de bactérias comensais. O cólon não possui vilosidades e as criptas são menores que as do intestino delgado. Não há células de Paneth, e a proporção de células caliciformes pode ser de até 25% da camada epitelial [37]. Assim, os três segmentos intestinais têm diferentes estratégias para manter uma distância segura entre as células epiteliais e a microbiota. O reconhecimento de MAMP e a ativação de vias imunes é outra camada dessa interação e, portanto, é razoável que eles também sejam estruturados ao longo do trato GI (revisado em [38]). No entanto, continua sendo um enigma fascinante sobre o que exatamente molda a estrutura da organização PRR.

Embora seja intuitivo que genes importantes para funções regionais, como digestão e absorção de nutrientes, sigam a compartimentalização espacial ao longo do eixo cefalocaudal (revisado em [39]), tal organização não era esperada para a sinalização imune inata epitelial. Estudos anteriores relataram a regulação da sinalização PRR em resposta à estimulação com MAMPs. Por exemplo, a capacidade de resposta do TLR4 diminui após o nascimento, presumivelmente devido à exposição ao LPS durante o parto e subsequente colonização do intestino [40]. Além disso, a estimulação de TLR9 com seu ligante CpG-DNA leva a uma diminuição na expressão de TLR4 e inibe a sinalização de TLR4 [41]. Assim, era esperado que o contato com os microorganismos, suas moléculas e metabólitos no trato GI levasse ao silenciamento da expressão de PRR em direção ao lúmen intestinal (revisado em [14]). No entanto, resultados contraditórios, causados ​​por dificuldades técnicas, como anticorpos não confiáveis ​​direcionados a TLRs, levaram à confusão no campo e não ficou claro se um PRR específico foi expresso ou não (revisado em [42]). Northern blots iniciais para mRNA de Tlr2 e Tlr4 em células epiteliais isoladas ex vivo indicaram que os níveis de expressão dessas duas moléculas de Tlr eram específicos do segmento: Tlr2 foi expresso principalmente no cólon, enquanto Tlr4 foi expresso principalmente no estômago e no cólon. compartimentalização estratégica" desses TLRs [43]. Estudos recentes descobriram agora que esse princípio de expressão específica do segmento se estende além desses dois TLRs e desvendou uma organização regional altamente complexa da sinalização PRR que nem sempre segue a carga microbiana [44, 45].

O primeiro dos dois estudos veio do grupo de Barton e revelou vários níveis de organização da expressão de TLR. O grupo gerou cinco cepas de camundongos repórteres, permitindo a análise da expressão de TLR2, 4, 5, 7 e 9, respectivamente. TLR2 e 5 foram expressos no intestino delgado e cólon proximal, TLR4 foi expresso no cólon e TLR7 e 9 não foram expressos. A expressão do repórter em organoides desses camundongos mimetizou de perto a expressão in vivo, indicando que a expressão é independente do contato com a microbiota ou com células imunes [45].

O segundo estudo utilizou um biobanco de organoides humanos e murinos recém gerados cobrindo os diferentes segmentos do trato GI: corpo, piloro, duodeno, jejuno, íleo e cólon. A análise transcricional dos organoides confirmou os padrões de expressão para os TLRs relatados pelo grupo de Barton, mas, além disso, revelou uma vasta extensão da expressão diferencial de TLRs, NLRs, componentes do inflamassoma e outros genes relacionados à imunidade inata (Fig. 3 e [44 ]). Por exemplo, Nod2 foi expresso principalmente no estômago, enquanto as expressões de vários componentes da via do inflamassoma como Nlrp1b, Nlrp6 e Aim2 foram restritas ao intestino. Vários receptores foram expressos uniformemente; por exemplo, a expressão de Tlr3 foi detectada em todos os segmentos do trato GI murino em grandes quantidades, enquanto Tlr5 foi expressa em todos os segmentos, mas em baixas quantidades [44]. Como resultado, cada segmento parece ter seu próprio complemento específico de receptores imunes inatos e componentes de sinalização.

A comparação do murino com os organoides gastrointestinais humanos demonstrou que em ambas as espécies o princípio da organização complexa dos componentes de sinalização de PRR era o mesmo, mas os perfis de expressão de PRR individuais podem diferir. Alguns PRRs, como TLR4 e NLRP6, foram padronizados de forma semelhante ao longo do trato GI de ambas as espécies. TLR4 foi expresso predominantemente no estômago e cólon e a expressão de NLRP6 foi restrita aos segmentos do intestino. Por outro lado, vários PRRs como TLR1 e TLR2 apresentaram padrões que diferiram entre as duas espécies. Enquanto em organoides murinos, a expressão de ambos aumentou ao longo do trato GI e foi maior no cólon, em organoides humanos a expressão foi maior no estômago e diminuiu ao longo do trato GI [44]. Além disso, a expressão de TLR5 foi maior em organoides humanos, com os níveis mais altos observados no estômago [44].

Conforme mencionado acima, os organoides também permitem testar se uma determinada via é funcional pela adição do ligante e análise subsequente da expressão do gene alvo a jusante. Complementando a análise de expressão específica da região, o estudo também descobriu que os organoides humanos e murinos apresentam função específica da região: o estômago murino respondeu ao ligante TLR4 LPS, mas não ao ligante TLR2 PAM3CSK4 ou à flagelina do ligante TLR5, regulando positivamente o NF- Gene alvo κB Cxcl2. O jejuno murino superrregulado Cxcl2 em resposta a PAM3CSK4 e flagelina, mas não em resposta a LPS. Além disso, o cólon expressou Cxcl2 em resposta a todos esses 3 ligantes testados [44]. Em contraste, organoides humanos de todas as regiões expressaram o análogo humano Cxcl2 IL-8 em resposta à flagelina, mas não em resposta a LPS e PAM3CSK [44]. Assim, não apenas a expressão, mas também a função dos PRRs no intestino é altamente organizada e específica do segmento. Esses experimentos foram conduzidos adicionando o estímulo ao meio organoide, estimulando assim apenas o lado basal, já que o lado apical está voltado para o lúmen selado dos organoides. Outros experimentos demonstraram que há um nível de organização ainda maior, pois a expressão de PRR dentro de um segmento pode ser restrita a tipos celulares específicos ou mesmo a localizações subcelulares, como apenas o compartimento basal. Estes são descritos em mais detalhes abaixo.

Cada região do trato GI expressa seu conjunto específico de genes imunes inatos. Embora uma generalização seja difícil, os dados atuais sugerem que os TLRs são mais expressos no estômago e no cólon, enquanto o intestino delgado é caracterizado pela expressão de componentes do inflamassoma. Atualmente, o mecanismo molecular subjacente e o benefício evolutivo não são claros.

Suspeitamos que as barreiras físicas e químicas que cobrem as camadas epiteliais nos diferentes segmentos intestinais requerem o monitoramento de ameaças específicas. Por exemplo, o estômago e o cólon têm uma camada espessa de muco com duas camadas, com a camada interna de muco firmemente ligada à camada epitelial, enquanto o intestino delgado é coberto por uma camada fina e viscosa de muco [46]. As diferentes constituições das camadas de muco, por sua vez, provavelmente se devem às diferentes funções dos respectivos segmentos intestinais (digestão versus absorção de nutrientes versus reabsorção de água). É concebível que a espessura do muco influencie o tipo de PRRs necessários em locais específicos.

Células especializadas com função imune no epitélio

Um conceito de longa data na imunidade inata epitelial é a existência de reconhecimento imune inato específico do tipo de célula. Protótipos de células epiteliais especializadas com função de defesa são as células micropregueadas (M) e as células de Paneth - recentemente complementadas por uma célula caliciforme especializada, a célula caliciforme sentinela. A existência dessas células especializadas destaca os sistemas intrincados e redundantes que garantem o equilíbrio da absorção de nutrientes, a coexistência com a microbiota e o monitoramento de possíveis invasores. Diferenciação dirigida de organoides agora também permite o estudo dessas células em cultura de células.

As células M estão localizadas no epitélio associado ao folículo que cobre as placas de Peyer. Eles têm uma morfologia única com bordas em escova irregulares e estruturas de microvilosidades reduzidas. Seu papel é transportar antígenos no lúmen intestinal através da camada epitelial para o tecido linfóide subjacente para a regulação das respostas imunes [47]. As próprias células M, bem como o epitélio associado ao folículo, demonstraram expressar vários TLRs [48] (revisado em [14]). No entanto, as células M têm sido difíceis de estudar, pois não são muitas no tecido epitelial e são encontradas apenas perto da estrutura complexa das placas de Peyer [47]. No entanto, as células M podem ser geradas em culturas de organoides usando diferenciação direcionada. Para isso, adiciona-se ao meio o ativador do receptor do ligante NF-κB (RANKL), que regula positivamente o fator de transcrição SpiB, característico da diferenciação de células M [49]. Organoides gerados a partir de camundongos geneticamente deficientes para a subunidade NF-κB RelB não são capazes de produzir células M após estimulação com RANKL, indicando que a ativação de NF-κB é essencial para o desenvolvimento de células M [50]. Na cultura de organoides humanos, além do RANKL, a linfotoxina e o ácido retinóico são cruciais para induzir a diferenciação em células M. Essas células M absorvem especificamente vírus entéricos como rotavírus e reovírus, indicando a fenocópia correta da função natural das células M também em culturas de organoides [51]. O trabalho futuro de organoides terá que continuar a desvendar a interconexão da sinalização epitelial de NF-κB, o desenvolvimento de células M e a comunicação com células imunes.

As células de Paneth estão misturadas com as células-tronco intestinais na base da cripta e há muito são consideradas as guardiãs do compartimento das células-tronco porque secretam peptídeos antimicrobianos. Por exemplo, as células de Paneth secretam alfa-defensinas, um processo que se mostra regulado por padrões microbianos e mecanismos imunes inatos [52, 53]. Além disso, NOD2, que foi detectado pela primeira vez na região da cripta do intestino delgado murino [54], regula a secreção de várias alfa-defensinas pelas células de Paneth, que por sua vez leva à ativação da imunidade adaptativa. As células de Paneth também expressam TLR5 e os organoides enriquecidos com células de Paneth expressam níveis especialmente altos de TLR5. O sequenciamento de RNA após a estimulação revela que, enquanto os organoides normais do intestino delgado expressam apenas níveis moderados dos genes-alvo a jusante TLR5 em resposta à estimulação com flagelina, como citocinas induzidas por NF-kB, os organoides direcionados para conter um grande número de células de Paneth montam uma estrutura muito mais forte resposta, indicando que as células de Paneth são os principais respondedores à flagelina no intestino delgado [44, 45]. Em contraste com a expressão do gene alvo, a resposta mais dramática das células de Paneth (desgranulação, extrusão e morte celular) não é desencadeada pela estimulação com ligantes TLR, mas requer estimulação com a citocina gama interferon derivada de células imunes profissionais [55]. Esses resultados de organoides estão de acordo com as observações que mostram degranulação e extrusão de células de Paneth após estimulação com interferon-gama in vivo [55]. Isso sublinha elegantemente o sistema de freios e contrapesos na camada epitelial.

As células caliciformes são importantes para a defesa epitelial porque produzem as mucinas glicosiladas cruciais para a formação de uma barreira de muco na camada epitelial (revisado em [56]). Em camundongos, a deficiência de MUC2 resulta em inflamação espontânea e aumenta a suscetibilidade à infecção [57, 58]. Recentemente, um subconjunto de células caliciformes denominadas células caliciformes sentinelas foi descrito no cólon de camundongos. Usando explantes de tecido, o estudo identificou o espessamento da camada de muco em resposta à exposição aos ligantes TLR1/2, 4 e 5, mas não aos ligantes TLR9, NOD1 e NOD2 [59], em congruência com um relatório anterior de Tlr 2 ,4 e 5 sendo expressos em células caliciformes [60]. Os autores determinaram que a resposta também dependia da presença do inflamassoma Nlrp6 e era independente dos linfócitos da mucosa usando tecidos de uma variedade de camundongos knockout [59]. Além disso, um relatório anterior demonstrou a importância do inflamassoma NLRP6 para a secreção de muco pelas células caliciformes [61]. A imagem revelou que células caliciformes específicas localizadas nas regiões apicais da cripta endocitaram LPS marcados com fluorescência [59]. Essas recém-denominadas células caliciformes sentinelas não apenas sofrem rápida degranulação e expulsão epitelial após o tratamento com os ligantes TLR, mas também transmitem um sinal de cálcio para as células vizinhas por meio de pontes citoplasmáticas intercelulares formadas por junções comunicantes, provavelmente estimulando outras células caliciformes a aumentar a secreção de muco [59] . Tanto as células caliciformes quanto as células de Paneth pertencem à linhagem secretora. Os organoides permitem a diferenciação direcionada para ambas as identidades celulares, produzindo organoides fortemente enriquecidos em células caliciformes ou células de Paneth [62]. A comparação de transcriptomas desses organoides distorcidos ajudou a identificar os principais reguladores da via de diferenciação [63]. Uma análise mais aprofundada dos dados ômicos, bem como a análise funcional desses organoides, permitirá uma melhor compreensão do papel de ambos os tipos de células na defesa imune inata.

Por fim, também foi relatado que as próprias células-tronco expressam PRRs específicos, como TLR4 [64, 65], que não são encontrados nas vilosidades do intestino delgado murino ou nas células de Paneth [66]. Além disso, a maioria da expressão de Nod2 na cripta murina parece estar restrita a células-tronco [67]. A estimulação com o ligante NOD2 aumentou a sobrevivência de células-tronco e a formação de organoides, indicando que a estimulação de PRRs também pode regular diretamente a regeneração epitelial do intestino.

Sem dúvida, os esforços atuais para gerar atlas de expressão gênica cobrindo cada tipo de célula com cada vez mais detalhes em breve fornecerão uma imagem mais completa da organização celular da sinalização imune inata no intestino, bem como em todo o corpo [68-71 ].

Polaridade celular e respostas imunes inatas específicas do lado

Finalmente, também é relevante considerar que as células epiteliais gastrointestinais são altamente polarizadas, com um lado apical especializado voltado para o lúmen do intestino com sua microbiota e um lado basolateral voltado para o tecido. Sob homeostase, os MAMPs atingem apenas o lado apical. No entanto, quando a barreira epitelial é rompida, os microorganismos também podem atacar o lado basolateral. Assim, foi levantada a hipótese de que as células epiteliais podem montar seletivamente uma resposta pró-inflamatória apenas quando estimuladas do lado basolateral, para corresponder à ameaça representada pelo sinal. Por exemplo, foi demonstrado que TLR9 induz vias de sinalização distintas quando estimulado do lado apical ou basolateral em linhagens celulares de câncer [72] e TLR5 induziu apenas o gene de resposta NF-κB IL-8 quando estimulado do lado basal [73 ].
Embora estudos anteriores usando marcação de anticorpos contra TLRs tenham relatado expressão específica em apenas um lado (revisado em [14, 16]), a análise de camundongos repórteres de TLR usando coloração de uma etiqueta HA não confirmou isso, mas demonstrou TLR2, 4 e 5 receptores em ambos os lados apical e basal do cólon proximal, bem como alguns TLR4 intracelulares [45]. Essas diferenças aparentes provavelmente se devem às diferentes abordagens técnicas.

Os organoides agora permitem o teste funcional direto de respostas imunes específicas do lado, uma vez que a polarização celular é retida nos organoides. Sob condições padrão, quando os organoides são cultivados em uma matriz extracelular, o lado apical fica voltado para o lúmen do organoide e o lado basal fica voltado para a matriz extracelular [74-76]. Quando crescido fora de uma matriz extracelular, a polaridade pode ser invertida [77, 78]. Quando células de organoides são semeadas em superfícies de cultura de células padrão, como placas de cultura ou transwells, o lado apical fica voltado para o lúmen do poço [44, 79–82].

Vários estudos usaram organoides para testar a função geral de PRRs específicos sem abordar diferenças específicas entre estimulação apical e basal. Esses estudos incluíram o estímulo no meio dos organoides, que, em condições padrão, estimula o lado basal da célula. Usando esta técnica, a regulação positiva de genes-alvo a jusante de NF-κB foi identificada após estimulação basal com ligantes de TLR4 no estômago, TLR2 e 3 no intestino delgado e TLR2, 3, 4 e 5 no cólon de camundongos [44, 45, 83] e aos ligantes de TLR2 e 5 no estômago e TLR5 no intestino delgado e cólon de humanos [44]. Além disso, a estimulação basal de organoides do cólon murino com agonistas de TLR4 induziu a diferenciação celular, especialmente em relação à linhagem secretora [64], enquanto os agonistas de NOD2 induziram aumento da sobrevida de células-tronco [67, 84] e a regulação positiva dependente de NLRP estimulada por taurina do gene alvo a jusante do inflamassoma IL-18 [85]. Em todos esses estudos, a estimulação apical não foi testada.

Apenas alguns estudos abordaram as funções específicas dos PRRs. É digno de nota que, ao contrário dos estudos usando linhas celulares de câncer polarizadas, até agora, nenhum dos estudos usando organoides identificou uma ativação específica do lado de um gene pró-inflamatório dependente de NF-κB típico. Monocamadas transwell derivadas de organoides de cólon humano expressam níveis semelhantes do gene alvo NF-κB IL-6 quando estimuladas do lado apical ou basal com ligantes de TLR1/2, 3, 4, 5, 7/8 e 9 [82]. Os organoides gástricos murinos também responderam a uma estimulação apical com o ligante TLR4 LPS em vários ensaios, inclusive em transwells e microinjeção de LPS no lúmen dos organoides [44]. Células epiteliais do intestino delgado murino não expressam o gene alvo NF-κB icam1 em resposta a uma variedade de ligantes, independentemente de terem sido adicionados a organoides intactos, estimulando assim o lado basal, ou adicionados a células isoladas e dissociadas, estimulando assim todos lados [55].

No entanto, olhando além da resposta do NF-κB, um estudo recente identificou uma função específica do TLR3 e sua importância na infecção viral [82]. Resultados de experimentos com monocamadas derivadas de organoides de cólon humano mostraram que a expressão dos genes críticos de defesa do vírus tipo I e interferon tipo III foi regulada positivamente após estimulação basal com agonista de TLR3, mas não após estimulação com outros agonistas de TLR. Da mesma forma, quando infectados com um vírus, a resposta do interferon dos organoides foi muito mais forte quando infectados do lado basal em comparação com a infecção do lado apical. Isso foi visível em monocamadas derivadas de organoides, bem como em organoides microinjetados com o vírus. O estudo identificou ainda o adaptador de triagem de clatrina AP-1B como a molécula responsável pela expressão polarizada de TLR3. Da mesma forma, camundongos deficientes em Ap-1b mostraram respostas imunes exacerbadas após a infecção viral [82]. Isso confirma a função polarizada dos PRRs e destaca a importância desse nível de regulação na modulação do reconhecimento e defesa do patógeno.

Até agora, não há uma resposta "tamanho único" para a questão da polaridade, e resolver a natureza específica do local da sinalização PRR continua sendo uma tarefa tecnicamente desafiadora para o futuro.

Tolerância como resposta à colonização e como programa padrão de desenvolvimento

Os mecanismos que contribuem para a organização da imunidade inata epitelial ainda não estão claros. O principal conceito a esse respeito tem sido a indução de tolerância após a colonização do intestino estéril durante o nascimento, a chamada janela de oportunidade (revisado em [86–88]). Este conceito postula um período de preparação do sistema imunológico inato e adaptativo após o nascimento, que prepara o terreno para a homeostase imunológica e subsequentes interações hospedeiro-microbiana.

O sistema imunológico neonatal e a imunidade inata epitelial são exclusivamente equipados para dominar essa transição da esterilidade para a coexistência com a microbiota. Ao nascimento, o intestino humano neonatal está totalmente maduro com vilosidades intestinais e criptas contendo células de Paneth. A camada epitelial intestinal neonatal murina é mais imatura e sofre uma mudança dramática mensurável no nível do transcriptoma comparando diferentes estágios de desenvolvimento [89] e visível na arquitetura do tecido e diferenciação celular: o eixo cripta-vilosidade ainda não está formado e a proliferação celular é inferior, sem migração celular ou esfoliação. Não contém células de Paneth maduras; no entanto, os enterócitos produzem o peptídeo antimicrobiano semelhante à catelicidina (CRAMP) [90]. As células de Paneth aparecem quando as criptas se formam 2 semanas após o nascimento [91]. No momento do desmame, o epitélio está totalmente formado com criptas e vilosidades, enterócitos, células caliciformes e células enteroendócrinas; As células de Paneth assumiram a produção de peptídeos antimicrobianos; e as células caliciformes aumentaram a produção de mucinas para formar a camada de muco (revisto em [92]).

Esta transição dependente da idade do epitélio anda de mãos dadas com uma diminuição gradual da expressão de TLR5 no epitélio do intestino delgado. Ao mesmo tempo, a expressão de TLR3 aumenta durante o período neonatal. Outros PRRs, como TLR2, 4 e 9, são expressos em níveis semelhantes em camundongos neonatos e adultos [45, 93].

Os mecanismos que levam à regulação da expressão e função do PRR após o nascimento permanecem obscuros. Como mencionado acima, vários estudos propuseram uma contribuição do ambiente, em particular a colonização microbiana, para a regulação da expressão de PRR após o nascimento [40, 41] (revisado em [14]). No entanto, camundongos livres de germes versus livres de patógenos específicos não mostraram diferenças na expressão de TLR no intestino delgado ou no cólon, indicando que nem a regulação positiva de TLR3 nem a regulação negativa de TLR5 neste período inicial dependem da microbiota [45, 93]. Além disso, em organoides, a expressão de muitos, mas não todos, componentes de sinalização de PRR já foi definida em organoides de tecidos que nunca estiveram em contato com produtos microbianos [44]. Isso indica que grande parte da organização das vias de sinalização imune inata é definida independentemente do contato com a microbiota e parece ser determinada por processos de desenvolvimento padrão, como os descritos acima, que moldam a identidade geral do tecido ao longo do trato GI . Isso não exclui um ajuste mais fino da expressão de PRR por fatores ambientais durante a idade adulta.

A importância da regulação oportuna das interações microbianas epiteliais torna-se clara quando o epitélio imaturo é prematuramente confrontado com a colonização microbiana: bebês prematuros são propensos ao desenvolvimento de enterocolite necrotizante (NEC), caracterizada por necrose intestinal, sepse sistêmica e infecção de múltiplos órgãos. falha. Embora a patogênese seja considerada multifatorial, vários estudos indicaram que ela se desenvolve em resposta a um desequilíbrio entre a sinalização pró-inflamatória e os mecanismos de reparo no intestino prematuro (revisado em [94]) e uma contribuição dos PRRs foi sugerida [41, 65, 95 –97]. Vários estudos usaram organoides fetais humanos [24, 98, 99], organoides murinos normais expostos a bactérias e hipóxia para modelar NEC [100] ou organoides de um modelo murino de NEC, bem como de pacientes com NEC [101]. Estudos futuros usarão esses modelos organoides estabelecidos e novos para definir melhor a contribuição do epitélio na NEC.

Modelando aspectos dependentes do epitélio da DII com organoides

A perda da integridade da barreira epitelial intestinal é uma característica definidora da DII, ou seja, DC e UC, e parece ser causada por uma interação multifatorial de predisposição genética, fatores ambientais, alterações da microbiota intestinal e alterações da resposta imune local e sistêmica (revisado em [27]). A terapêutica atual visa predominantemente as respostas imunes (aberrantes) na DII, que estão associadas a altas taxas de não-resposta e efeitos colaterais (revisado em [27]). É necessária uma melhor compreensão da contribuição específica do epitélio para a fisiopatologia da DII para identificar novos alvos terapêuticos que também possam impactar diretamente na restauração da barreira epitelial intestinal e, assim, na cicatrização da mucosa.

Para obter informações sobre a patologia epitelial, vários grupos estabeleceram biobancos vivos compostos de organoides gerados a partir de pacientes individuais com UC ou DC. Embora essa abordagem seja óbvia, até agora, apenas alguns estudos relataram resultados de organoides derivados desse grupo de pacientes [102-104]. Isso pode ser explicado pela observação de que os organoides de pacientes com DII são mais difíceis de gerar. Nossa própria experiência é que os organoides gerados a partir de pacientes com DC crescem mais lentamente durante as primeiras passagens e algumas amostras foram perdidas – o que foi associado a uma maior taxa de contaminação bacteriana nas culturas [105].

A caracterização de organoides derivados de pacientes com DII revelou um fenótipo com diminuição do tamanho e capacidade de brotamento, aumento da taxa de morte celular, detritos luminais e polarização parcialmente invertida das células epiteliais [106]. A comparação global de organoides de pacientes com UC ou DC e controles saudáveis ​​mostrou que as diferenças de transcrição e metilação observadas no epitélio intestinal foram mantidas in vitro [102, 103, 107]. Além disso, um estudo anterior de organoides gerados de pacientes com DC sugeriu alterações permanentes das células-tronco intestinais na DII. Isso foi baseado na observação de que os organoides gerados a partir de lesões ativas de DC mantinham altos níveis de expressão de marcadores de células-tronco epiteliais intestinais [108]. Isso foi até certo ponto confirmado em um estudo recente no qual os organoides do cólon derivados de pacientes pediátricos com DII mostraram um padrão de expressão prolongada de genes apresentadores de antígenos [109].

Concentrando-se nas alterações na função da barreira epitelial intestinal, incluindo a perda de junções estreitas e desmossomos, que geralmente são encontrados na DII [110], foi demonstrado que os organoides de pacientes com DC mantêm esse fenótipo de alterações juncionais sob condições de cultura [105]. Este foi especialmente o caso quando os organoides foram gerados a partir de locais de inflamação grave [105]. Uma diminuição nas proteínas juncionais também pode ser induzida em organoides de doadores saudáveis ​​pela aplicação da citocina pró-inflamatória TNF- e/ou IFN- [106, 111]. No entanto, o padrão fixo de alterações de proteínas juncionais em organoides de pacientes com DII foi observado apenas no nível de proteína, mas não no nível de mRNA [105].

Essas observações sugerem que várias alterações são fixadas em organoides de pacientes com DII. A observação de que algumas, mas não todas, as mudanças permanentes são visíveis apenas na proteína, mas não no nível do RNA, sugere que há alterações permanentes nas modificações pós-transcricionais ou degradação de proteínas em organoides de pacientes com DII. No entanto, isso ainda precisa ser investigado em detalhes.

O que exatamente induz as alterações permanentes nos padrões de expressão do epitélio inflamado não está claro. Há muito se suspeitava de um efeito da microbiota; no entanto, um estudo recente demonstrou que o efeito da microbiota no epitélio se perde com o tempo [112]. O estudo comparou várias instalações de camundongos porque as diferentes composições do microbioma das colônias de camundongos foram identificadas como fatores de confusão em estudos in vivo. Para esclarecer esse efeito, o estudo comparou isolados epiteliais e culturas de organoides de camundongos livres de germes e duas colônias separadas de camundongos livres de patógenos específicos com microbiota diferente. Enquanto o epitélio recém-isolado mostrou uma impressão da exposição da microbiota nos níveis de RNA e proteína, esse efeito foi perdido após várias semanas de cultura de organoides do intestino delgado [112]. Além disso, uma comparação global da expressão gênica de organoides gerados a partir de regiões inflamadas ou não inflamadas dos mesmos pacientes com DII demonstrou que os organoides IBD das regiões inflamadas perderam a expressão gênica inflamatória já após algumas semanas em cultura. Os transcriptomas dos organoides foram então agrupados por paciente; assim, as diferenças permanentes entre IBD e controles saudáveis ​​permaneceram. O fenótipo inflamatório nos organoides da DII poderia então ser re-induzido pela adição de um coquetel de citocinas [107]. No geral, isso sugere que as alterações permanentes observadas nos organoides de pacientes com DII são independentes do contato com a microbiota ou citocinas.

Assim, embora seja razoável especular que algumas das alterações permanentes nas células epiteliais intestinais de pacientes com DII possam ser causadas por alterações na sinalização imune inata, as evidências atualmente são escassas. Além disso, nem todas as alterações epiteliais observadas nas regiões inflamadas do intestino são permanentemente conservadas no epitélio purificado, indicando importantes contribuições do ambiente local. No futuro, novos estudos com modelos organoides mais complexos, incorporando também células imunes, estimulação de citocinas inflamatórias e coculturas com microrganismos, devem ajudar a abordar essa hipótese com mais detalhes.

Conclusões, perspectivas futuras e Perspectivas

Em resumo, embora muitas doenças do trato gastrointestinal permaneçam incompletamente compreendidas, evidências crescentes apontam para um papel crítico do epitélio gastrointestinal na patogênese de muitas delas - embora seu papel específico permaneça obscuro.

O conhecimento limitado da função imune inata do epitélio gastrointestinal tem sido atribuído à falta de modelos experimentais apropriados. Com a implementação da tecnologia de organoides, um grande passo foi dado para superar esse problema. Os organoides gerados de cada região do trato gastrointestinal agregarão significativamente ao conhecimento existente. Conforme revelado por estudos anteriores, a geração de organoides oferece a vantagem crucial de poder observar respostas de células gastrointestinais primárias em oposição a linhas celulares transformadas, que são geradas principalmente a partir de tumores malignos gastrointestinais. Uma das características mais fascinantes dos organoides é que eles mantêm características específicas do segmento do trato gastrointestinal de onde foram gerados como parte de sua identidade celular durante a vida adulta. De acordo com estudos experimentais atuais, a identidade regional é fixada nas células-tronco gastrointestinais. Neste contexto, uma questão remanescente será determinar exatamente como e quando durante o desenvolvimento esta programação intrínseca ocorre.

Ao olhar para conceitos específicos de como o epitélio pode responder ou interagir com o ambiente, a tecnologia organoide agora permitiu a iluminação da expressão e função diferencial e específica do segmento de PRRs dentro do epitélio gastrointestinal. As consequências funcionais globais para os sistemas regulatórios complexos dentro de todo o trato gastrointestinal ainda não estão claras e terão que ser abordadas no futuro. Para isso, também será importante cocultivar organoides com células imunes (revisado em [113]), células do sistema nervoso entérico [114] e fatores luminais como co-culturas bacterianas (revisado em [115]) (Fig. .4).

Outro aspecto importante é que os organoides gerados a partir de tecidos de pacientes afetados por doenças gastrointestinais, como IBD, mantêm algumas das características observadas nos espécimes de tecidos correspondentes dos quais foram derivados. Isso oferece a possibilidade única de desvendar ainda mais a contribuição específica do epitélio e da doença para a patogênese das doenças gastrointestinais - não apenas aquelas que envolvem alterações induzidas por inflamação, mas também aquelas que envolvem alterações em doenças malignas. Ambos podem envolver uma contribuição específica da imunidade inata derivada do epitélio. Para isso, o estabelecimento sistemático de "biobancos vivos" seria um passo importante. Como uma visão para o futuro, esses biobancos vivos poderiam ser anexados aos biobancos já existentes, que atualmente fornecem apenas biomateriais "mortos". Isso representaria outro passo importante não apenas para a pesquisa, mas também para facilitar o diagnóstico individualizado e a terapia para os pacientes.

Quadro 1. A imunidade inata e as células epiteliais no trato gastrointestinal não estão claras se o impacto observado se deve à sinalização imune inata em células epiteliais ou células imunes profissionais.

Para desemaranhar a interação entre células imunes profissionais e células epiteliais, vários estudos usaram nocautes específicos do epitélio ou, mais recentemente, organoides epiteliais. Em modelos de camundongos, nenhuma das deleções específicas do epitélio de PRRs leva à inflamação espontânea. No entanto, camundongos com nocaute específico do epitélio de MyD88 são mais suscetíveis à colite experimental e apresentam ruptura grave da barreira, resposta prejudicada das células caliciformes e de Paneth [121] e produção reduzida de mucina e peptídeos antimicrobianos [121, 122]. Os organoides do intestino delgado não montam uma resposta inflamatória a vários ligantes PRR purificados [55], embora isso não possa ser generalizado e dependa da espécie, localização e idade do tecido a partir do qual os organoides são gerados [44, 45].

A ausência de um fenótipo inflamatório espontâneo em modelos nocaute PRR específicos de células epiteliais suporta a hipótese de que outros fatores além de uma resposta inflamatória geral do epitélio têm um impacto na homeostase epitelial. Por exemplo, a estimulação com o agonista NOD2 muramil dipeptídeo (MDP) aumentou o número de organoides crescendo a partir de células-tronco isoladas, indicando que a sinalização imune inata apoiou a sobrevivência das células-tronco [67, 84]. Além disso, dados de camundongos destacam a importância dos efeitos antiapoptóticos da sinalização do NF-κB em resposta a outros estímulos, como o TNF- [123]. Curiosamente, em humanos, polimorfismos em genes imunes inatos, incluindo NOD2 e TLR4, estão associados a um risco aumentado de desenvolver IBD [124] e o bloqueio de TNF- é atualmente o tratamento mais eficaz para IBD em alguns pacientes (revisado em [125]).

Surge um quadro em que um baixo nível de estimulação imune inata é importante para a secreção de muco, integridade da barreira e sobrevivência das células epiteliais. Seu comprometimento pode permitir a translocação de bactérias intestinais do lúmen para o tecido subepitelial, levando à inflamação.

Agradecimentos

Agradecemos a Ömer Kaya pela ajuda com as ilustrações e a Rike Zietlow pela edição.

Contribuição do autor

Ideia: SB Conceito inicial: SB e Ö.K.; pesquisa de literatura: Ö.K., NS e SB; Projeto inicial: Ö.K. Revisando, reescrevendo, adicionando seções: NS, SB Todos os autores revisaram criticamente o manuscrito final.

Financiamento

Financiamento de Acesso Aberto habilitado e organizado pelo Projekt DEAL. Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG GRK 2157; Modelos de tecidos 3D para estudar infecções microbianas por patógenos humanos, Projeto 10, para SB), o Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF; www.med.uni-wuerzburg.de/izkf /startseite) em Würzburg (Conceder AD-427 para NS e SB), e o DFG SPP1982 SCHL1962/5-2 para NS.

Declarações

Conflito de interesses

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Acesso livre

Este artigo está licenciado sob uma Licença Creative Commons Attribution 4.0 Internacional, que permite o uso, compartilhamento, adaptação, distribuição e reprodução em qualquer meio ou formato, desde que você dê o devido crédito ao(s) autor(es) original(is) ) e a fonte, forneça um link para a licença Creative Commons e indique se foram feitas alterações. As imagens ou outro material de terceiros neste artigo estão incluídos na licença Creative Commons do artigo, a menos que indicado de outra forma em uma linha de crédito para o material. Se o material não estiver incluído na licença Creative Commons do artigo e seu uso pretendido não for permitido pela regulamentação estatutária ou exceder o uso permitido, você precisará obter permissão diretamente do detentor dos direitos autorais.

Referências

1. Goodwin CS (1984) Micróbios e infecções do intestino

2. Sekirov I, Russell SL, Antunes LCM, Finlay BB (2010) Microbiota intestinal na saúde e na doença. Physiol Rev 90:859–904

3. Simon GL, Gorbach SL (1986) A microflora intestinal humana. Dig Dis Sci 31:147S–162S

4. Bartfeld S, Clevers H (2017) Organoides derivados de células-tronco e sua aplicação para pesquisa médica e tratamento de pacientes. J Mol Med: 1–10. https://doi.org/10.1007/s00109-017-1531-7

5. Barker N (2014) Células-tronco intestinais adultas: impulsionadores críticos da homeostase e regeneração epitelial. Nat Rev Mol Cell Biol 15:19–33

6. Bartfeld S, Koo BK (2017) Células-tronco gástricas adultas e seus nichos. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol 6:e261. https://doi.org/10.1002/wdev.261

7. Liwinski T, Zheng D, Elinav E (2020) O microbioma e os receptores imunológicos inatos citosólicos. Immunol Rev 297:1–18

8. Burgueño JF, Abreu MT (2020) Receptores epiteliais do tipo Toll e seu papel na homeostase e doença intestinal. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 17:263–278

9. Christian S, Kanneganti TD (2020) Inflammassomas e a linha tênue entre defesa e doença. Curr Opin Immunol 62:39–44

10. Ying L, Ferrero RL (2019) Papel da sinalização de NOD1 e ALPK1/TIFA na imunidade inata contra Helicobacter pylori. Infecção pp:159–177

11. Takeuchi O, Akira S (2010) Receptores de reconhecimento de padrão e inflamação. Cela 140:805–820

12. Peterson LW, Artis D (2014) Células epiteliais intestinais: reguladores da função de barreira e homeostase imunológica. Nat Rev Immunol 14:141–153

13. Pott J, Hornef M (2012) Sinalização imune inata no epitélio intestinal na homeostase e na doença. EMBO Rep 13:684–698

14. Abreu MT (2010) Sinalização do receptor Toll-like no epitélio intestinal: como o reconhecimento bacteriano molda a função intestinal. Nat Rev Immunol 10:131–144

15. Zhang K, Hornef MW, Dupont A (2015) O epitélio intestinal como guardião da integridade da barreira intestinal. Cell Microbiol 17:1561–1569

16. Yu S, Gao N (2015) Compartimentando receptores do tipo toll de células epiteliais intestinais para vigilância imunológica. Cell Mol Life Sci 72: 3343–3353

17. Zhou P, She Y, Dong N, Li P, He H, Borio A, Wu Q, Lu S, Ding X, Cao Y, Xu Y, Gao W, Dong M, Ding J, Wang DC, Zamyatina A, Shao F (2018) Alfa-quinase 1 é um receptor imune inato citosólico para ADP-heptose bacteriana. Natureza. 561:122–126

18. Milivojevic M, Dangeard AS, Kasper CA, Tschon T, Emmenlauer M, Pique C, Schnupf P, Guignot J, Arrieumerlou C (2017) ALPK1 controla TIFA/TRAF6-imunidade inata dependente contra heptose{{5} },7-bifosfato de bactérias gram-negativas. PLoS Pathog 13:e1006224. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1006224

19. Zimmermann S, Pfannkuch L, Al-Zeer MA et al (2017) ALPK1- e resposta imune inata dependente de TIFA desencadeada pelo sistema de secreção de Helicobacter pylori tipo IV. Célula Rep 20:2384–2395

20. Abreu MT, Fukata M, Arditi M (2005) Sinalização TLR no intestino na saúde e na doença. J Immunol 174:4453–4460 174/8/4453 [pii]

For more information:1950477648nn@gamil.com