Matéria particulada fina 2.5 regula positivamente a melanogênese em células de melanoma humano A375
Jul 19, 2023
Ao Editor: Estudos epidemiológicos mostraram que a exposição ao material particulado fino 2.5 (PM2.5) aumenta o risco de hiperpigmentação da pele.[1] Um estudo recente provou que PM2.5 pode induzir a melanogênese regulando a expressão da tirosinase (TYR) e da proteína relacionada à tirosinase 1 (TYRP1) e 2 (TYRP2) via receptor de hidrocarboneto aril (AhR)/ativação da sinalização de proteína quinase ativada por mitógeno.[ 2] O AhR está amplamente distribuído nas células da pele e sua ligação controla a oxidação/antioxidação, a função de barreira epidérmica, a resposta fotoinduzida, a imunidade inata e a melanogênese. Pode ser ativado por dioxinas e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (os constituintes do PM2.5) e sua ativação induz a transcrição de genes que codificam enzimas do metabolismo xenobiótico de fase I e fase II (citocromos P450 [CYP] 1A1, CYP1A2 e CYP1B1). [3,4] BaP e dioxinas perigosas ativam AhR com geração robusta de espécies reativas de oxigênio (ROS), que é pelo menos parcialmente mediada por CYP1A1. Além disso, o estresse oxidativo mediado por CYP1A1-é responsável pela produção de citocinas pró-inflamatórias, como interleucina (IL)-1, IL-6 e IL-8 em queratinócitos humanos tratados com contaminantes.[3,5] No entanto, há muito poucos estudos sobre os efeitos tóxicos de PM2.5 em células melanogenéticas. Aqui, tratamos células de melanoma humano A375 com várias concentrações de PM2.5 para investigar se PM2.5 pode promover a melanogênese e sua relação com a sinalização de AhR, estresse oxidativo e resposta inflamatória.
O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados pelos radicais livres da timina.
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O PM2.5 foi coletado durante o inverno (de dezembro a janeiro) em Pequim. HY-1000 amostrador inteligente de partículas suspensas totais (TSP) de grande fluxo (cortador PM2.5 opcional, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, China) foi usado para amostragem de filtro de quartzo. A membrana de quartzo foi imersa em etanol 75 por cento seguido de agitação ultrassônica. Água estéril foi usada para preparar uma solução estoque de alta concentração. Células de melanoma humano A375 foram cultivadas em 5 por cento de CO2 a 37 graus em meio Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen Co., Ltd., Carlsbad, CA, EUA) contendo soro bovino fetal (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). As células A375 foram tratadas com diferentes concentrações de PM2.5 (0, 100, 200 e 400 ug/mL) por 24 horas, e as células foram usadas para os estudos seguintes. O teste t de Student não pareado e a análise de variância de uma via foram usados para análise estatística, e P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Para investigar a influência de PM2.5 em células A375, a proliferação celular foi detectada usando um kit CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e a apoptose celular foi detectada usando anexina V fluoresceína isotiocianato/ kit de apoptose de iodeto de propídio (FITC/PI) (Multisciences, EUA), com base nas instruções do fabricante. Os resultados indicaram que PM2.5 exibiu citotoxicidade dependente da concentração para células A375, mas não afetou a apoptose [Figura suplementar 1, http://links.lww.com/CM9/A917].
O método NaOH foi usado para determinar o conteúdo de melanina. As células A375 tratadas com PM2.5-foram lavadas com tampão fosfato salino (PBS) e lisadas com água. Os lisados foram centrifugados a 12, 000 r/min por 5 minutos, lavados com 10 por cento de ácido tricloroacético (500 mL) (Sigma, St. Louis , MO, EUA) e etanol 75 por cento (500 mL) e depois clarificado novamente. Em seguida, 50 mL de NaOH 1 mol/L contendo 10% de dimetil sulfóxido foram adicionados aos pellets por 1 hora a 80 graus. A absorbância a 490 nm (OD 490) foi medida usando um leitor de microplacas. Como TYR é a enzima melanogênica mais importante, detectamos a atividade de TYR usando o ensaio de levodopa (L-DOPA). Placas Sixwell (Corning, EUA) foram semeadas com células A375 a uma densidade de 3 105 células/poço. As células foram então lavadas com PBS e lisadas com 0,5 por cento desoxicolato de sódio (Sigma). O lisado foi dividido em três grupos e 0,1 por cento de L-DOPA (Sigma) foi adicionado a cada amostra. Após 5 minutos, o OD 490 foi medido e 0,1 por cento de L-DOPA foi usado como padrão. Também medimos os níveis de expressão de mRNA e proteína de TYR. O RNA total foi extraído usando um mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EUA). A transcrição reversa foi realizada usando o kit ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Japão). Posteriormente, a reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) foi realizada no Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Japão). Os primers da Invitrogen são apresentados na Tabela Suplementar 1, http://links. lww.com/CM9/A917, e o nível de expressão de cada mRNA foi calculado usando o método 2*DDCT. Os níveis de expressão da proteína foram analisados por Western blotting. As células foram lavadas com PBS e lisadas em tampão RIPA (Beyotime, China) contendo fluoreto de fenilmetilsulfonil (mistura de inibidores de protease, 20:1, Sigma-Aldrich). As concentrações de proteína foram medidas usando um kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime, China). A proteína total foi fervida a 70 graus por 10 minutos, separada em um gel de 4 por cento a 12 por cento a 200 V por 40 minutos, transferida para uma membrana a 4 graus usando 120 mA por 75 a 100 minutos e depois incubada com 5 por cento leite desnatado por 1 hora. As membranas foram então sondadas com anticorpos anti-TYR, anti-AhR, anti-CYP1A1 e anti-CYP1B1 (Abcam) durante a noite a 4 graus. Anticorpo IgG anti-camundongo conjugado com peroxidase de rábano (Proteintech, EUA) foi usado como anticorpo secundário. Os resultados indicaram que o PM2,5 aumentou o conteúdo de melanina e a atividade de TYR de maneira dose-dependente. Ambos os níveis de expressão de mRNA e proteína de TYR foram regulados positivamente [Figura suplementar 2 A-D, http://links.lww.com/CM9/A917].
PM2.5 pode regular positivamente a atividade TYR ativando a via AhR. Para determinar se PM2.5 afeta a sinalização de AhR, detectamos os níveis de transcrição de AhR e seus genes downstream clássicos CYP1A1 e CYP1B1 por qRT-PCR e western blotting. Os resultados mostraram que PM2.5 regulou positivamente os níveis de expressão de mRNA de AhR e CYP1A1, bem como a expressão de proteína de CYP1A1 [Figura suplementar 2 E–G, http://links.lww.com/CM9/A917].
A ativação do AhR causa a geração de ROS, que também pode aumentar a atividade do TYR.[5] Assim, avaliamos a produção de ERO usando 20,70 -diacetato de diclorofluoresceína (DCFHDA) e citometria de fluxo. Após 24 horas de tratamento com PM2.5, as células A375 foram incubadas com DCFH-DA (5mmol/L) por 30 minutos a 37 graus no escuro. As células foram lavadas duas vezes em PBS e a fluorescência foi medida por um citômetro de fluxo. A intensidade média de fluorescência foi quantificada usando o software FACS Diva 6.0 (BD Bioscience, New York, NY, EUA). Como a produção de ROS induzida por CYP1A1-é considerada responsável pela resposta inflamatória,[5] os níveis de expressão de mRNA de citocinas pró-inflamatórias (IL-1a, IL-6, IL{ {19}} e fator de necrose tumoral [TNF]-a) foram medidos. Verificou-se que o PM2.5 aumentou a produção de ROS, bem como os níveis de mRNA de IL-1a, IL-6 e IL-8 em células A375 [Figura complementar 2 H e I, http ://links. lww.com/CM9/A917].
Os achados deste estudo indicaram que PM2.5 promoveu a melanogênese e aumentou tanto a atividade quanto a expressão de TYR em células A375. Além disso, PM2.5 poderia ativar a sinalização de AhR e induzir estresse oxidativo e resposta inflamatória, que pode ser uma cascata de sinalização melanogênica responsável pela hiperpigmentação.
Agradecimentos
Expressamos nossa sincera gratidão aos seguintes: Prof. Dr. Masutaka Furue e Prof. Dr. Tsuji Gaku do Kyushu University Hospital, que melhoraram o manuscrito e ajudaram com as informações relacionadas ao AhR. Agradecemos também a edição em inglês fornecida pelo Prof. Dr. Robert Schwartz da Rutgers New Jersey Medical School.
Financiamento
Este estudo foi financiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 2101000271).
Conflitos de interesse
Nenhum.
Referências
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Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q, et al. O material particulado promove a hiperpigmentação por meio da ativação da sinalização AhR/MAPK e pelo aumento dos níveis parácrinos de a-MSH nos queratinócitos. Environ Pollut 2021;278:116850. doi: 10.1016/j.envpol.2021. 116850.
Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. Papel potencial de PM2.5 na melanogênese. Environ Int 2019;132:105063. doi 10.1016/j. envit.2019.105063.
Napolitano M, Patruno C. Receptor de hidrocarboneto arílico (AhR) um possível alvo para o tratamento de doenças de pele. Med Hypotheses 2018;116:96–100. doi: 10.1016/j.mehy.2018.05.001.
Dijkhoff IM, Drasler B, Karakocak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M, et al. Impacto do material particulado transportado pelo ar na pele: uma revisão sistemática da epidemiologia aos estudos in vitro. Parte Fibra Toxicol 2020;17:35. doi 10.1186/s12989-020-00366-a.
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