DNA extraviral em preparações de vetores virais adeno-associados induz respostas imunológicas inatas dependentes de TLR9 em células dendríticas plasmocitoides humanas

Suspensões de vetores virais adeno-associados (AAV) produzidas em células HEK derivadas de humanos ou em células de inseto Spodoptera frugiperda (Sf9) diferem em termos de componentes residuais da célula hospedeira, bem como modificações pós-traducionais específicas da espécie exibidas nas proteínas do capsídeo AAV . Aqui analisamos o impacto dessas diferenças nas propriedades imunogênicas do vetor. Estimulamos células dendríticas plasmocitoides humanas com vários lotes de vetores AAVCMV-eGFP produzidos por células HEK e produzidos por células Sf9, derivados de diferentes fabricantes. Descobrimos que os vetores AAV8-CMV-eGFP e AAV2-CMV-eGFP induziram respostas de citocinas inflamatórias específicas do lote, mas não específicas da plataforma de produção ou específicas do fabricante. Estes poderiam ser reduzidos ou abolidos bloqueando a sinalização do receptor 9 do tipo toll ou reduzindo enzimaticamente o DNA nos lotes de vetores usando DNase. A transdução bem sucedida de células HEK por lotes de AAV tratados com DNase e análises de DNA demonstraram que a DNase não afetou a integridade do vetor, mas degradou o DNA extraviral. Concluímos que ambas as preparações de AAV derivadas de células HEK e Sf podem conter componentes de DNA extraviral imunogênico que podem desencadear respostas imunes inflamatórias específicas do lote. Isto sugere que estratégias melhoradas para remover impurezas de ADN extraviral podem ser fundamentais na redução das propriedades imunogénicas das preparações de vectores de AAV.

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A última década testemunhou um enorme interesse no desenvolvimento de novas estratégias baseadas em vírus adenoassociados recombinantes (AAV), tanto para pesquisa básica quanto para aplicações clínicas . A principal razão reside no facto de os vectores AAV terem sido ferramentas extremamente versáteis no campo da terapia genética, dada a sua capacidade de entregar genes terapêuticos de forma eficiente e segura aos tecidos alvo4. No entanto, um número crescente de investigadores relata independentemente resultados que sugerem respostas imunitárias locais e sistémicas após a administração de AAV em estudos pré-clínicos e clínicos5–8.

Demonstrou-se que os vetores AAV ativam receptores de reconhecimento de padrões imunes inatos, como o receptor toll-like (TLR)2 e TLR9, resultando na liberação de citocinas inflamatórias e interferons tipo I (IFN)9,10. Os componentes imunogênicos do AAV que podem estimular essas respostas incluem proteínas do capsídeo e genoma do vetor9,10. As respostas imunológicas após a aplicação do AAV também podem ser desencadeadas por impurezas na suspensão do vetor5,11. Estas impurezas foram definidas como qualquer componente presente na suspensão do vetor AAV purificado que não seja o produto desejado12 e resultam do processo de produção do vetor. Dois dos principais métodos de produção de vetores clínicos de AAV recombinantes envolvem a transfecção de DNA plasmídico em células HEK e a infecção de células de inseto Spodoptera frugiperda (Sf9) com bacoluvírus13. Consequentemente, as impurezas potencialmente imunogénicas contidas nas suspensões de vectores de AAV podem incluir endotoxinas, componentes do meio de cultura celular, reagentes que são utilizados para a purificação de AAV, proteínas e ADN derivados de células hospedeiras e ADN baculoviral residual ou ADN plasmídico5. Fatores adicionais que podem influenciar a imunogenicidade das suspensões de vetores de AAV são as modificações pós-traducionais (PTMs) impressas no capsídeo pelas diferentes plataformas de produção de vetores5. É importante ressaltar que os vetores AAV derivados de células HEK e derivados de células Sf9 diferem muito em termos de seus PTMs, suas impurezas residuais de proteínas da célula hospedeira e, potencialmente, também em suas impurezas de DNA (DNA de células HEK vs. DNA de células Sf9, bem como DNA de plasmídeo residual vs. DNA baculoviral)14. As células dendríticas plasmocitóides (pCDs) são um tipo de célula imune inata especializada que secreta grandes quantidades de IFN tipo I e citocinas pró-inflamatórias em infecções virais9,15 e desempenham um papel importante na detecção de vetores AAV9. Assim, para analisar se as diferenças entre vetores AAV produzidos por células HEK e produzidos por células Sf resultam em diferenças em suas propriedades imunogênicas, estimulamos pDCs humanos com lotes diferentes do mesmo vetor AAV obtido dos dois sistemas de produção e diferentes fabricantes. Descobrimos que metade dos lotes de vetores examinados suscitou respostas imunes pró-inflamatórias específicas do lote que não estavam relacionadas ao sistema de produção do vetor nem ao fabricante. Estas respostas foram mediadas pela sinalização TLR9 e suscetíveis ao tratamento dos lotes de vetores com DNase. A transdução bem-sucedida de células HEK por lotes de vetores de AAV não tratados e tratados com DNase e análises de DNA de preparações de AAV sugeriram que a DNase não afetou a integridade das partículas de AAV, mas sim o DNA extraviral não encapsulado. Coletivamente, isto sugere que as preparações de vetores de AAV podem conter DNA extraviral não encapsulado que pode influenciar as propriedades imunogênicas das preparações de vetores de AAV em pDCs humanos.

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Resultados

AAV induz respostas imunes inatas específicas de lote em pDCs humanos.

Estudos demonstraram que os vetores AAV derivados de células HEK e Sf9 diferem em termos de seus PTMs e impurezas contidas nas suspensões virais . Nossa hipótese é que esses fatores poderiam resultar em diferenças nas propriedades imunogênicas entre lotes de vetores derivados de células HEK e células Sf9. Para testar essa hipótese, analisamos um total de oito lotes de vetores de AAV sorotipo 8 (AAV8) contendo a sequência de DNA idêntica do promotor do citomegalovírus (CMV) e o transgene idêntico para a proteína de fluorescência verde aprimorada (eGFP) (AAV8- CMV-eGFP; cinco lotes derivados de células HEK e três Sf9) e quatro lotes AAV2-CMV-eGFP (dois lotes derivados de células HEK e dois Sf9) de três fabricantes diferentes [fabricante A; Viral Vector Core Facility da Universidade de Iowa (Iowa, EUA), fabricante B; Virovek (CA, EUA) e fabricante C; Vigene Biosciences (MD, EUA)]. Para maximizar as semelhanças entre os lotes, os sete lotes de AAV8 do fabricante A e do fabricante B (Tabela 1) foram produzidos utilizando o mesmo plasmídeo original. Além disso, um registro de PCR digital de gotículas (ddPCR) dos genomas vetoriais (vg) dos lotes de vetores AAV foi realizado em uma medição lado a lado usando dois alvos diferentes: um dentro da sequência de CMV e outro dentro da sequência eGFP de os vetores. Os resultados obtidos pela quantificação do alvo de CMV foram utilizados para a titulação dos lotes de vetores AAV nos experimentos seguintes (Tabela 1). Os pDCs são sensores virais especializados que produzem massivamente IFNs tipo I após infecção viral15, incluindo vetores AAV9. Para investigar se os vetores AAV produzidos por células HEK e produzidos por células Sf9- diferem em sua capacidade de induzir respostas imunes inatas em células imunocompetentes, estimulamos pDCs humanos com os lotes de vetores AAV listados acima. Para este fim, os pDCs foram purificados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores humanos saudáveis ​​individuais por selecção negativa utilizando triagem de células activadas magnéticas (MACS). A análise de citometria de fluxo confirmou a pureza dos pDCs isolados acima de 90% (Fig. S1). Dez pDCs de um doador individual foram semeados e estimulados com lotes de vetores AAV8 e AAV2 a um MOI de 1:1 × 106 vg/célula por 18 h. O MOI de 1:106 vg/célula aplicado a um total de 12.500 células em 50 ul/poço traduz-se num título de 2,5× 1011 vg/ml. Usamos esse título porque está dentro da faixa aplicada em estudos de terapia genética retinal em humanos (por exemplo, 1 × 1012 vg/ml16 ou 4 × 1011–1,3 × 1012 vg/ml17) e primatas não humanos (por exemplo, 5 × 1011–5 × 1012 vg/ml6). A estimulação com o veículo serviu como controle. A incubação com lotes de vetores AAV8 e AAV2 não resultou em qualquer expressão transgênica detectável em pDCs. No entanto, quatro dos oito lotes AAV8 (lotes A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) e dois dos quatro lotes de AAV2 (lotes B-Sf9-1, B-Sf9-2) induziram proliferação celular reativa nos pDCs estimulados (Fig. 1a). Isto foi acompanhado por uma liberação de citocinas pró-inflamatórias (IP-10, MIP-1 e TNF-) e IFN tipo I (IFN-). Por outro lado, nem a proliferação celular nem a liberação de citocinas foram induzidas pelo AAV8 restante (lotes A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92} }) e lotes AAV2 (lotes C-HEK-1, C-HEK-2). Esses resultados foram confirmados em três a quatro experimentos independentes, cada um realizado com células de um doador individual (Fig. 1a-c e Tabela S1). As diferenças específicas dos lotes nas concentrações de citocinas nesses experimentos independentes foram analisadas estatisticamente usando um modelo linear de efeito misto e o teste post hoc de Dunnett (Q=2.6), comparando as médias dos mínimos quadrados dos diferentes lotes de vetores AAV com o controle do veículo (Tabelas S2 e S3). Isso demonstrou diferenças estatisticamente significativas nas respostas de citocinas entre lotes de vetores AAV "imunogênicos" (lotes AAV8 A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{ {114}}, ou AAV2 lotes B-Sf9-1, B-Sf9-2 respectivamente) e controle, mas não há diferenças significativas entre lotes de vetores AAV "não imunogênicos" (AAV8 lotes A-Sf{{ 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 ou lotes AAV2 C-HEK-1, C-HEK-2 respectivamente) e controle (Tabela S3). As concentrações do restante das citocinas medidas incluídas no ensaio multiplex estavam abaixo da faixa do ensaio (ou seja, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN- ) ou nem o "imunogênico" nem os lotes de vetores "não imunogênicos" induziram quaisquer aumentos significativos em sua liberação (ou seja, IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (Fig. S2), sugerindo um grau de especificidade na resposta de citocinas mediada por AAV. Para investigar as respostas de citocinas em um momento anterior, os pDCs foram estimulados com o vetor AAV8 "imunogênico" lote A-HEK-1. Observamos um aumento significativo na concentração de TNF- no sobrenadante já 2 h após a estimulação com pDC. Este padrão de resposta pode ser confirmado em três experimentos, cada um realizado com células de um doador individual (Fig. S3). Para investigar se uma dose mais elevada de um lote de vetor AAV8 "não imunogênico" foi capaz de desencadear uma resposta imune, estimulamos os pDCs com o MOI aplicável tecnicamente máximo (1: 4,61 × 106 vg). Curiosamente, nem a proliferação celular reativa nem as respostas de citocinas foram detectadas após estimulação com este título aumentado (Fig. S4). Contrariamente à nossa hipótese, estes resultados demonstram que as respostas imunes inatas ao AAV em pDCs eram específicas do lote e não relacionadas a um sistema de produção específico ou método de fabricante/purificação.

Tabela 1. Diferentes lotes de vetores virais AAV8 e AAV2 utilizados neste estudo.

Figura 1. Indução de respostas imunes específicas do lote do vetor AAV em pDCs humanos. Os pDCs humanos foram estimulados com diferentes lotes de AAV8-CMV-eGFP e AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1× 106 vg) por 18 h (a) Imagens representativas de campo claro de pDCs estimulados com controle de veículo (imagem superior) ou um lote de vetor AAV imunogênico (imagem inferior). A barra de escala é 100 μm. (b) Liberação de citocinas de IP-10, MIP-1 , TNF- e IFN- 2 por pDCs estimulados por AAV8-. (C) Liberação de citocinas por pDCs2-estimulados por AAV. Parcelas representativas de um dos três a quatro experimentos independentes. Como nas medições de IFN- 2 (b,c) e na medição de TNF- (c) alguns valores ficaram abaixo da faixa de ensaio, a constante 1 foi adicionada a todos os valores medidos de IFN- 2 e TNF- para apresentação em um gráfico semi-logarítmico. São mostradas medianas e intervalos interquartis. Nos rótulos dos lotes de vetores individuais, os três fabricantes são representados pelas letras A, B e C; Os vetores derivados de células HEK e derivados de células Sf9- são indicados por "HEK e "Sf9" e os lotes correspondentes do mesmo fabricante e do mesmo sistema de produção são numerados "1, 2, 3". Círculo: derivados de HEK lote de vetor; triângulo: lote de vetor derivado de Sf9-; preto: lote de vetor do fabricante A; laranja: lote de vetor do fabricante B; verde: lote de vetor do fabricante C.

A resposta imune à estimulação de AAV em pDCs não é influenciada por diferenças na relação capsídeo/VG.

Estudos pré-clínicos demonstraram que diferenças no número de partículas de vetor cheias e vazias em suspensões de vetores de AAV podem influenciar uma resposta imune18. A fim de avaliar se as diferenças nas propriedades imunogênicas entre os lotes de vetores analisados ​​foram devidas a diferenças na proporção de partículas de vetor cheias e vazias, determinamos o título de capsídeos de vetor em todos os lotes de AAV por ELISA de titulação de AAV e calculamos o capsídeo/VG razão. Curiosamente, foram encontradas grandes diferenças na relação capsídeo/vg entre todos os lotes de AAV (Fig. 2). Aproximadamente duas vezes mais capsídeos do que vg (2:1) foram encontrados em AAV8-CMV-eGFP lotes A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} } e AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; e quatro vezes mais (4:1) em AAV8 lote A-Sf9-1. Foi observada uma proporção de 1:1 nos demais lotes. No entanto, não foram encontradas diferenças significativas entre as proporções capsídeo/vg de lotes de vetores AAV "imunogênicos" e "não imunogênicos" em AAV8 (P=0,27) nem em AAV2 (P=0,37). lotes vetoriais (Fig. 2). Isto sugere que as diferenças nas propriedades imunogénicas dos lotes de vectores de AAV analisados ​​também não estavam relacionadas com diferenças na proporção de partículas de vector cheias e vazias.

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Reconhecimento de lotes de vetores AAV8 "imunogênicos" por TLR9.

Foi demonstrado que o reconhecimento imune inato do AAV por pDCs murinos e humanos é mediado pela detecção de DNA TLR99. Assim, avaliamos se o TLR9 também estava envolvido no reconhecimento dos nossos lotes de vetores AAV8 "imunogênicos". Para este fim, os pDCs foram semeados conforme descrito e cultivados com o antagonista de TLR9 H154 (50 µM) seguido de estimulação com os lotes de vetores AAV8 "imunogênicos" A-HEK-1, A-HEK-2, A -HEK-3 e A-Sf9-1 (MOI: 1:1× 106 vg). Após 18 h, nenhuma evidência de proliferação celular foi observada (Fig. 3a) e uma redução significativa na liberação de IP-10, MIP-1, TNF- e IFN- foi medida (Fig. 3b). Isto indica que as respostas imunitárias a lotes de vectores AAV8 "imunogénicos" em pDCs humanos são mediadas pela sinalização TLR9.

Figura 2. Comparação das proporções capsídeo/vg entre diferentes lotes de vetores AAV8-CMV-eGFP e AAV{3}}CMV-eGFP. As proporções capsídeo/vg derivam de medições de absorvância (ELISA) e resultados de ddPCR de (a) oito lotes de vetores AAV8 e (b) quatro lotes de vetores AAV2. As linhas tracejadas separam os lotes de vetores AAV "imunogênicos" dos "não imunogênicos". As barras indicam médias e desvios padrão das réplicas. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student não pareado.

Figura 3. O reconhecimento de lotes de vetores AAV{1}}CMV-eGFP "imunogênicos" por pDCs depende de TLR9. Os pDCs humanos foram tratados com o antagonista de TLR9 H154 (50 μM) seguido de estimulação com lotes de vetores AAV8 "imunogênicos" (MOI: 1:1× 106 vg) por 18 h. (a) Imagens representativas de campo claro de pDCs purificados tratados com lotes de vetores AAV "imunogênicos" (imagem superior) ou lotes de vetores AAV "imunogênicos" e H154 (imagem inferior). A barra de escala é 100 μm. (b) Liberação de citocinas de IP-10, MIP-1, TNF- e IFN- 2 por pDCs estimulados. Como nas medições de IFN- 2 alguns valores ficaram abaixo da faixa de ensaio, a constante 1 foi adicionada a todos os valores medidos de IFN- 2 para apresentação em um gráfico semi-logarítmico. São mostradas médias e desvios padrão. A significância estatística foi determinada usando ANOVA unidirecional e análise post hoc de Holm-Sidak. Valores de P: Menores ou iguais a 0,05: *; Menor ou igual a 0,01: **; Menor ou igual a 0,001: ***.

O tratamento com DNase reduz as respostas imunes de lotes de vetores AAV8 e AAV2 "imunogênicos".

Embora os vetores AAV8 "imunogênicos" tenham desencadeado uma resposta imune9-dependente de TLR em pDCs, nenhuma dessas respostas foi induzida pelos lotes "não imunogênicos". O TLR9 é ativado em resposta ao DNA, em particular ao DNA contendo motivos CpG não metilados9. É importante ressaltar que nossas medições de ddPCR confirmaram que os mesmos componentes de DNA viral estavam presentes em lotes de vetores “imunogênicos” e “não imunogênicos”. Coletivamente, isto sugeriu que o DNA não embalado/livre na suspensão viral, em vez do DNA intraviral, poderia ser o agente causador das respostas imunes observadas a lotes de vetores de AAV "imunogênicos". Assim, se o ADN residual livre estivesse presente na suspensão viral dos lotes de vectores AAV8 "imunogénicos", a resposta imunitária inata deveria ser atenuada pela DNase. Para testar esta hipótese, lotes de vectores AAV8 e AAV2 "imunogénicos" foram pré-tratados com DNase I (100 µg/ml) durante 30 min antes da estimulação de AAV. Para excluir efeitos não específicos do tratamento com DNase nos pDCs ou nas partículas de AAV, nas estimulações apenas de AAV, os vectores foram submetidos ao tratamento com DNasemock antes da estimulação com pDC. Nestes tratamentos simulados sem DNase, as partículas de AAV foram incubadas a 37 graus num meio de digestão de DNase idêntico durante o mesmo período de tempo que os AAV tratados com DNase. Dez pDCs foram semeados e estimulados com lotes de vetores AAV "imunogênicos" pré-tratados com DNase ou tratados simuladamente (MOI: 1:1 × 106 vg). Os pDCs que foram incubados apenas com DNase ou tratados de forma simulada com um veículo serviram como controlos. Curiosamente, o tratamento com DNase dos lotes de vetores "imunogênicos" AAV8 e AAV2 diminuiu a proliferação de células reativas (Fig. 4a) e foi completamente abolido (lotes AAV8 A-HEK-2 e A-Sf9-1; lotes AAV2 B-Sf9-1 e B-Sf9-2) ou reduziu significativamente (AAV8 lotes A-HEK-1 e A-HEK-3) a liberação de IP{{40} }, MIP-1, TNF- e IFN- após estimulação com AAV (Fig. 4b, c). Para confirmar que o efeito da DNase observado foi realmente causado pela digestão do DNA extraviral e não por um efeito da DNase na integridade do vetor, investigamos se o tratamento com DNase de lotes de vetores de AAV afetou a capacidade de transdução do AAV. Uma vez que a aplicação de AAV não resultou em qualquer transdução de pDC detectável, as células HEK foram utilizadas para estes ensaios, uma vez que as células HEK são um modelo celular bem conhecido para analisar a eficiência da transdução na transdução de AAV. Estimulamos células HEK293T com lotes de vetores AAV8 e AAV2 tratados com DNase e tratados com simulação (MOI: 1: 8 × 104 vg) e avaliamos a eficiência de transdução por microscopia de fluorescência 3 dias após a aplicação do vetor. Tal como descrito, os vectores AAV2 mostraram uma potência de transdução mais elevada em comparação com os vectores AAV8. Além disso, é importante ressaltar que o pré-tratamento com DNase não reduziu a eficiência de transdução nos lotes de vetores AAV8 e AAV2 derivados de células HEK nem em Sf 9- (Fig. S5a, b). Estes resultados fornecem evidência adicional de que o efeito da DNase nas propriedades imunogénicas dos lotes de vectores é devido à degradação do ADN extraviral. Embora o antagonista de TLR9 H154 tenha essencialmente abolido a liberação de citocinas pró-inflamatórias para todos os quatro lotes imunogênicos de AAV8 (Fig. 3), o pré-tratamento com DNase também poderia eliminar a resposta de citocinas pró-inflamatórias para os lotes de AAV8 A-HEK{{75} } e A-Sf9-1, embora não o tenha removido totalmente para os lotes AAV8 A-HEK-1 e A-HEK-3 (Fig. 4). Para testar se um tempo aumentado de tratamento com DNase poderia anular essa resposta de citocinas, repetimos os experimentos de simulação de pDCs após um aumento de dez vezes no tempo de incubação de DNase dos respectivos lotes (A-HEK-1 e A-HEK{{87} }). Observamos que após o tratamento com DNase dos vetores por 5 h, as concentrações médias de citocinas no sobrenadante das células estimuladas por AAV diminuíram ainda mais, não sendo mais significativamente diferentes daquelas do controle do veículo. Este padrão de resposta pode ser confirmado em três experimentos, cada um realizado com células de um doador individual (Fig. S6). Isso sugere que a causa central da resposta imune pró-inflamatória dependente de TLR em pDCs é de fato o DNA extraviral. A fim de testar se a liberação de DNA intraviral aumenta a atividade imunoestimulatória dos vetores AAV, abrimos deliberadamente os capsídeos virais do AAV8 "imunogênico" lote A-HEK -1 por tratamento térmico a 95 graus por 10 min . O lote de vetores tratado termicamente foi então usado para estimular pDCs. Embora não tenha havido diferenças na proliferação de células reativas após a estimulação do lote AAV8 A-HEK-1 com e sem tratamento térmico, houve um aumento significativo na liberação de IP-10, MIP-1 , TNF- e IFN- na condição de tratamento aquecido, indicando que a liberação de DNA viral encapsulado na suspensão do vetor pode contribuir para a indução de respostas imunes (Fig. 5). Juntos, estes dados indicam que as preparações de vetores de AAV podem conter contaminantes de DNA extraviral que podem desencadear respostas imunes específicas do lote em pDCs. Estas respostas são mediadas pela sinalização TLR9 e podem ser reduzidas/abolidas pelo tratamento dos lotes de vetores com DNase.

Figura 4. O pré-tratamento com DNase reduz as respostas imunes induzidas por lotes de vetores "imunogênicos" de AAV8-CMV-eGFP e AAV2-CMV-eGFP. Os pDCs humanos foram estimulados com lotes de vetores AAV8 "imunogênicos" tratados com DNase por 18 h (MOI: 1:1 × 106 vg). (a) Imagens representativas de campo brilhante de pDCs purificados estimulados com lotes de vetores AAV "imunogênicos" (imagem superior) e lotes de vetores AAV "imunogênicos" pré-tratados com 1{{30}}0 ug/ ml de DNase Eu (imagem inferior). A barra de escala é 500 μm. (b) Liberação de citocinas de IP-10, MIP-1 , TNF- e IFN- 2 por pDCs estimulados por AAV8-. (c) Liberação de citocinas por pDCs2-estimulados por AAV. Como nas medições de IFN- 2 (b e c) e na medição de TNF- (b), alguns valores ficaram abaixo da faixa de ensaio, a constante 1 foi adicionada a todos os valores medidos de IFN- 2 e TNF- para apresentação em um gráfico semi-logarítmico. São mostradas médias e desvios padrão. A significância estatística foi determinada usando ANOVA unidirecional e análise post hoc de Holm-Sidak. Valores de P: Menores ou iguais a 0,05: *; Menor ou igual a 0,01: **; Menor ou igual a 0,001: ***.

Análise exploratória de contaminantes de DNA extraviral em preparações de vetores AAV8.

Para realizar a primeira caracterização exploratória dos componentes de DNA extraviral nos lotes de vetores AAV, um representante "imunogênico" (A-HEK-1) e "não imunogênico" (B-HEK-1) O lote de vetores derivados de células HEK foi analisado. Esses lotes foram tratados com DNase em meio pDC por 30 min a 37 graus, conforme descrito acima, ou foram tratados de forma simulada e ultrafiltrados usando um dispositivo de filtragem de corte de 100 kDa, ou foram apenas tratados de forma simulada (Fig. S7a- g). A separação consecutiva do Bioanalyzer LabChip e a avaliação do DNA purificado revelaram a presença de quantidades comparáveis ​​de DNA vetorial (Fig. S7b-g) em amostras tratadas e simuladas de cada lote, confirmando que nem a ultrafiltração nem o tratamento com DNase influenciaram o conteúdo de DNA dentro do capsídeo. Além disso, mostrou que apenas o lote de vetores "imunogênicos" (Fig. S7a-d), mas não o lote de vetores "não imunogênicos" (Fig. S7a, e-g), continha moléculas de DNA adicionais variando em tamanho de 100 a 450 pb (Fig. S7a, e-g) .S7c,d e h). É importante ressaltar que essas moléculas adicionais de DNA puderam ser detectadas na amostra tratada de forma simulada e na amostra ultrafiltrada, mas estavam virtualmente ausentes na amostra tratada com DNase (Fig. S7a-d). Isto indica que estas moléculas de ADN representam contaminantes de ADN extraviral que podem ser degradados pela DNase mas não podem ser removidos da suspensão do vector por ultrafiltração. O financiamento de que estes contaminantes só poderiam ser detectados no lote de vectores "imunogénicos", mas não no lote de vectores "não imunogénicos", prova que a ocorrência destas moléculas de ADN extraviral é específica do lote e pode adicionalmente sugerir que estas moléculas induzem ou contribuem às propriedades imunoestimulantes do vetor. Para avaliar a fonte potencial do DNA contaminante nos lotes "imunogênicos" (A-HEK-1) e "não imunogênicos" (B-HEK-1) de análises quantitativas (q)PCR de HEK DNA celular, DNA plasmídico e DNA do vetor AAV foram realizados. DNA modelo de amostras tratadas com DNase, tratadas simuladamente e ultrafiltradas e apenas amostras tratadas simuladamente de cada lote foi usado para amplificação de repetição Alu, gene NPIP multicópia do genoma nuclear e sequências do gene mitocondrial 16S rRNA (mt16S) de origem de células HEK , para a amplificação de um amplicon de repetição terminal invertida AAV8 (ITR2; origem do DNA plasmídico do vetor e do transgene) e para a amplificação de um amplicon para o gene blá (resistência à ampicilina) (Amp; origem do DNA plasmídico) (Tabela S4). Comparação das proporções dos valores ΔCt do amplicon específico de DNA de células HEK vs. o amplicon ITR2 (ou seja, Alu vs. ITR2, NPIP vs. ITR2 e mt16S vs. ITR2) e o amplicon específico de DNA de plasmídeo versus o amplicon ITR2 (Amp vs. ITR2), respectivamente, indica que os dois lotes contêm quantidades insignificantes de DNA nuclear e mitocondrial de células HEK. Em contraste, a análise revelou uma quantidade razoável de DNA plasmídico tanto no lote de vetores "imunogênicos" quanto no "não imunogênico" (cerca de 1/32 e 1/50, respectivamente, em termos de número de cópias relativo ao DNA de AAV), uma proporção que está bem dentro da faixa de valores relatados para outros vetores de AAV (Fig. S7). No entanto, não houve diferenças óbvias na proporção relativa de DNA vetorial para plasmídeo e DNA de células HEK entre as amostras tratadas com DNase e tratadas simuladamente ou ultrafiltradas e tratadas simuladamente de ambos os lotes de vetores (Fig. S8). Isto pode sugerir que o ADN contaminante não empacotado é semelhante na composição da sequência alvo à do ADN empacotado. No entanto, uma limitação da análise qPCR é o tamanho do DNA contaminante (100-450 pb), que conterá uma fração decente de fragmentos com sequência alvo incompleta.

Figura 5. A liberação de DNA intraviral por tratamento térmico de vetores aumenta as respostas de citocinas pró-inflamatórias em pDCs. Liberação de citocinas de IP-10, MIP-1 , TNF- e IFN- 2 por pDCs 18 h após estimulação com AAV8 tratado termicamente lote A-HEK-1 (MOI: 1:1× 106 vg). As linhas horizontais indicam médias e desvios padrão. Diferenças estatisticamente significativas entre as respostas de citocinas induzidas por vetores tratados termicamente e não tratados foram determinadas usando o teste t de Student. Valor P: Menor ou igual a 0.01: **; Menor ou igual a 0,001: ***.

Discussão

Os vetores AAV são uma das ferramentas mais promissoras na terapia genética. No entanto, o acúmulo de evidências desafia a visão de que a imunogenicidade do AAV é insignificante5. À luz disto, tornou-se cada vez mais importante compreender melhor os mecanismos pelos quais ocorrem as respostas imunes ao AAV. Neste estudo demonstramos que (1) AAV8 e AAV2 induzem respostas imunes inatas específicas de lote em pDCs humanos que não são específicas para a razão capsídeo/vg, nem para a plataforma de produção, nem para o método de fabricante/purificação; (2) as respostas imunes inatas nos pDCs dependem da sinalização do TLR9 e podem ser reduzidas pelo pré-tratamento com DNase; (3) O tratamento com DNase não afeta a integridade da partícula do vetor, pois não reduz a taxa de transdução dos lotes de vetores AAV8 e AAV2 em células HEK293T; e (4) os lotes de vectores de AAV podem compreender moléculas de ADN extravirais que podem ser removidas por tratamento do lote de vectores com DNase. Isso sugere que as preparações de AAV derivadas de células HEK e Sf9-podem conter impurezas de DNA extraviral que estimulam uma resposta imune inata. Em um estudo recente, foi realizada uma análise comparativa utilizando vetores AAV de diferentes espécies de células hospedeiras (células HEK e células Sf9)11. Os autores descobriram que os vetores derivados de HEK e Sf9-diferem em termos de seus PTMs e suas impurezas residuais de proteína da célula hospedeira em todos os sorotipos e fabricantes de AAV que testaram. Além disso, eles analisaram a resposta de citocinas de fibroblastos humanos primários à transdução de AAV e descobriram que vetores derivados de HEK e Sf9-podem diferir em suas propriedades imunogênicas. Em nosso estudo, também comparamos esses dois sistemas de produção principais usando lotes diferentes da mesma construção de AAV de fabricantes diferentes e dois sorotipos diferentes. No entanto, as respostas imunitárias induzidas por vectores que observámos no nosso modelo pDC humano não estavam especificamente relacionadas com um determinado sistema de produção, fabricante ou serotipo; em vez disso, eram específicas do lote. Estudos pré-clínicos e clínicos anteriores de terapia genética retinal relataram que as respostas imunes aos vetores AAV, como inflamação ocular ou infiltração de células imunes, podem ser influenciadas por diferenças nas proporções capsídeo/vg18 ou diferenças de dose5. Timmers et al.18 mostraram que a remoção de capsídeos vazios de AAV da suspensão viral reduziu a inflamação e melhorou a transdução viral em um estudo pré-clínico com primatas não humanos. No entanto, nossos resultados mostraram que proporções elevadas de capsídeo/vg estavam presentes entre lotes de vetores de AAV "imunogênicos" e "não imunogênicos", o que significa que um número maior de capsídeos (capsídeos vazios) na suspensão viral não foi responsável pela indução de as respostas imunes específicas do lote do vetor em nosso modelo pDC humano. Além disso, mostramos anteriormente que o AAV8 induz respostas imunes de maneira dose-dependente em primatas não humanos6,8. No entanto, o aumento da dose dos vectores AAV "não imunogénicos" neste estudo não foi suficiente para desencadear uma resposta imunitária em pDCs humanos. Portanto, para compreender a causa das diferenças nas propriedades imunogênicas dos vetores, investigamos o mecanismo envolvido no reconhecimento dos lotes "imunogênicos" de AAV. O uso de modelos celulares imunocompetentes in vitro permitiu aos cientistas estudar com mais precisão o papel das vias TLR nas respostas imunes inatas geradas pelos vetores AAV9,10. Zhu et al.9primeiro descreveram que pDCs, mas não DCs convencionais ou não-pDCs, liberam grandes quantidades de IFN tipo I e citocinas pró-inflamatórias em resposta à estimulação de AAV e demonstraram o envolvimento da via TLR9 no reconhecimento de AAV8 e AAV2 usando pDCs de mouse. Os autores também observaram que o AAV2 induziu respostas imunes dependentes de TLR9-em pDCs humanos. Em nosso estudo, com o uso de um dos antagonistas de TLR9 mais específicos, H1549,21–24, mostramos indiretamente que não apenas AAV2, mas também vetores AAV8 induzem respostas imunes inatas dependentes de TLR9- em pDCs humanos, mas de uma maneira muito específica. Como o TLR9 é um receptor de ADN, isto sugere que as respostas imunitárias a lotes de vectores AAV "imunogénicos" foram induzidas por componentes de ADN. No entanto, embora as nossas medições de ddPCR tenham confirmado que os mesmos componentes de ADN empacotados estavam presentes em lotes de vectores "imunogénicos" e "não imunogénicos", os lotes "não imunogénicos" não desencadearam respostas imunitárias em pDCs. Além disso, o tratamento com DNase reduziu ou aboliu as propriedades imunoestimulantes dos lotes de vetores AAV "imunogênicos", mas não diminuiu a potência de transdução desses vetores em células HEK, sugerindo que o tratamento com DNase de AAV tinha como alvo DNA extraviral não encapsulado no suspensão do vetor, mas não afetou a integridade do genoma do vetor dentro do capsídeo intacto. Isto foi ainda confirmado por análises comparativas de DNA de lotes representativos de vetores "imunogênicos" e "não imunogênicos" tratados com DNase e tratados de forma simulada.

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Coletivamente, todos esses experimentos indicam que a resposta imune a lotes de vetores "imunogênicos" em pDCs não foi orquestrada pelo DNA contido nas partículas de AAV (ou seja, genoma do vetor ou potenciais impurezas de DNA empacotadas nos capsídeos de AAV), mas por DNA extraviral acessível. componentes contidos nas suspensões virais (ou seja, DNA fora ou não protegido pela cápside viral). Observámos também que quando o ADN contido nas cápsides virais de um lote de vector "imunogénico" foi exposto às células por tratamento térmico do vector houve um aumento na resposta imunitária. Não está claro se o aumento na atividade imunoestimulante após a abertura dos capsídeos foi devido ao DNA de fita simples do vetor ou devido a impurezas potenciais empacotadas nos capsídeos do AAV, tais como ácidos nucleicos residuais da célula hospedeira, sequências de DNA auxiliares residuais, sequência da espinha dorsal fragmentos empacotados junto com o cassete ou iniciação reversa de ITRs resultando em pequenos fragmentos de esqueleto empacotados no AAV12,25. O mecanismo exato de captação de DNA extraviral pelos pDCs permanece desconhecido. A capacidade de resposta dos pDCs aos oligonucleotídeos CpG demonstra que os pDCs podem reagir ao DNA livre26. Isto sugere que a resposta imunitária em pDCs pode ser desencadeada pela absorção de ADN contaminante livre contido na suspensão do vector. Além disso, foi demonstrado que os pDCs podem absorver vetores de AAV, sugerindo alternativamente que o potencial DNA ligado ao capsídeo poderia ser transportado para a célula durante a captação de partículas de AAV. A presença de contaminação de DNA extraviral em preparações de vetores de AAV pode ser uma propriedade inerente do respectivo lote de vetores resultante do processo de produção e purificação dos vetores, ou pode ser devida à liberação de DNA encapsulado devido a condições inadequadas de armazenamento . Todos os lotes de vetores examinados nesses experimentos foram obtidos durante o mesmo período de tempo (5 dos 8 lotes de vetores AAV8 examinados, dos quais dois eram "imunogênicos" (A-HEK-2; A-HEK-3) e três eram "não imunogênicos" (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) foram produzidos em paralelo especificamente para este estudo), os lotes de cada fabricante foi enviado nas mesmas caixas de transporte e, após o recebimento, todos os lotes foram armazenados lado a lado na mesma gaveta de um freezer de -80 graus protegido por alarme de temperatura antes que alíquotas de todos os lotes fossem descongeladas simultaneamente e aplicadas aos pDCs em experimentos lado a lado. Isto sugere fortemente que o processo de produção e purificação de AAV, em vez do armazenamento inadequado, foi responsável pelas diferenças no conteúdo de ADN extraviral e nas propriedades imunoestimulantes destes lotes. No passado, os lotes de vectores AAV de grau clínico produzidos para terapia genética (alipogene tiparvovec, Glybera) já não eram autorizados devido a grandes quantidades de impurezas, incluindo ADN residual da célula hospedeira potencialmente imunogénico28. A remoção de impurezas de DNA das suspensões virais é normalmente realizada durante o processo de produção. Aqui o tratamento com Benzonase29 ou DNase30 é aplicado rotineiramente para eliminar o DNA residual da suspensão viral final. Esse tratamento, dependendo do protocolo, dura entre 30 minutos e 3 horas e depois a enzima é inativada por produtos químicos como sais de cloreto de césio30. Em nossos experimentos, quatro dos cinco lotes de AAV8 derivados do Viral Vector Core Facility da Universidade de Iowa, e ambos os lotes de vetores AAV2 de Virovek, foram considerados imunogênicos em pDCs. Conforme descrito na seção "Materiais e métodos", o processo de purificação dos lotes de vetores de ambos os fabricantes envolve diversas etapas de purificação, algumas das quais diferem bastante umas das outras. Assim, o processo de purificação na Central Facility em Iowa inclui tratamento com turbonuclease, seguido de ultracentrifugação em gradiente de iodixanol, cromatografia em coluna de troca aniônica, esterilização flutter e troca de tampão usando filtros centrífugos. Em contrapartida, Virovek aplica tratamento com Benzonase, ultracentrifugação em CsCl seguida de dessalinização e esterilização por filtro. O processo de purificação do Vigene, por outro lado, não compreende o tratamento com DNase, mas, como é usado pela Core Facility em Iowa, inclui ultracentrifugação em gradiente de iodixanol. Surpreendentemente, no entanto, nenhum dos três lotes de vetores derivados de Vigene (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 e 2) induziu respostas imunes em pDCs, sugerindo que "não imunogênicos "Os lotes de vetores também podem ser gerados com processos de produção que não envolvem tratamento com DNase.

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Globalmente, os passos de purificação parcialmente semelhantes e parcialmente diferentes utilizados pelos três fabricantes tornam difícil ligar as propriedades imunogénicas dos vectores observados em pDC a um único passo no processo de fabrico. Os ensaios clínicos utilizam vetores de grau de boas práticas de fabricação (GMP) que são submetidos a rigorosos controles de qualidade. Nenhum dos vetores dos três fabricantes utilizados neste estudo é de grau de boas práticas laboratoriais (BPL) e pode, portanto, ser de pureza inferior aos vetores de grau clínico. Assim, é importante reconhecer que os vetores GMP utilizados em ensaios clínicos em humanos podem ou não apresentar as diferenças que observamos no presente estudo e que a relevância dos nossos achados para o uso clínico de terapias genéticas não é clara. No entanto, na nossa própria experiência, podem ocorrer diferenças consideráveis ​​específicas entre lotes na concentração de componentes contaminantes, tais como proteínas da célula hospedeira, mesmo com vectores de qualidade GMP, e mesmo em vectores de qualidade GMP não existem especificações uniformemente acordadas sobre quais os níveis que são aceitável5. Coletivamente, melhorar o processo de fabricação de vetores AAV é fundamental para evitar a presença de impurezas residuais nas suspensões virais, a fim de minimizar o potencial de respostas imunes indesejadas. Em conclusão, demonstramos que as impurezas extravirais do DNA podem influenciar as propriedades imunogênicas dos vetores AAV em pDCs humanos. Mais estudos são necessários para investigar as implicações destes resultados para a segurança da terapia genética mediada por AAV em modelos animais ou pacientes humanos.

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