Experimento 3 Efeito do glicosídeo feniletanol de Cistanche Deserticola no modelo de perimenopausa de ratos Ⅲ

Experimento 3 Efeito do glicosídeo feniletanol Cistanche deserticola no modelo de perimenopausa de ratos

1 Materiais experimentais

1.1 Animais experimentais

Ratos Wistar, grau SPF, fêmeas, fornecidos por Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., número de certificado de rato para este lote: 0017216; número do certificado de laboratório SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Medicamentos experimentais

Cistanche deserticola feniletanol glicosídeofoi preparado conforme método do Experimento 1, e o teor atingiu 66,47%. Cápsula Gengnian'an, ingredientes: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, casca de peônia, Poria cocos, madrepérola, curculigo, Schisandra chinensis, magnetita, videira Polygonum multiflorum, Uncaria, trigo flutuante, polygonum multiflorum . Funções e Indicações:Nutrir o yin e subjugar o yang, aliviar problemase acalmar a mente. Usado para ondas de calor e sudorese da menopausa, tonturas, zumbido, irritabilidade e insônia. Especificações: 0,3g por cápsula. Uso e dosagem: Oral, 3 cápsulas de cada vez, 3 vezes ao dia. Fabricante: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Número do lote de produção: 121104. Número de aprovação: Nº de aprovação nacional de medicamentos Z14021848.

Cápsulas moles de isoflavonas de soja e vitamina E, lista de ingredientes: isoflavonas de soja em pó, vitamina E, óleo de girassol, gelatina, glicerina, água, tartrazina, dióxido de titânio. Ingredientes e conteúdo icônicos: Cada 100g contém 55,2 mg de isoflavonas de soja (calculadas como genisteína) e 608,5 mg de vitamina E. Funções para a saúde: Aumentar a densidade óssea. Instruções e dosagem: Tomar 1 cápsula 2 vezes ao dia com água morna. Especificações: 500mg×100 cápsulas. Fabricante: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Número do lote de produção: 13070302. Número de aprovação: National Food Health G20080032.

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1.3 Reagentes experimentais

Carboximetilcelulose sódica, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., número de lote: 20120418; penicilina sódica para injeção, North China Pharmaceutical Co., Ltd., especificação: 4 milhões de unidades, número do lote de produção: c1206807;

Solução de formaldeído (analiticamente pura), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., número do lote de produção: 20130902; Injeção de cloreto de sódio a 0,9%, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; especificação: 250ml, número do lote de produção: 13082405B;

Hidrato de cloral, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, número de lote 20120827; Kit de detecção Rat E2 ELISA, R&D Company, número de lote: 20140101A; Kit de detecção Rat T ELISA, R&D Company, número de lote: 20140101A; Kit de detecção Rat LH ELISA, R&D Company, número de lote: 20140101A; Kit de detecção Rat FSH ELISA, R&D Company, número de lote: 20140101A;

2 métodos experimentais

2.1 Modelagem e Administração de Medicamentos

Método de modelagem: pegue 100 ratas wistar fêmeas com peso corporal de 210 ~ 230g, selecione aleatoriamente 12 ratos como um grupo em branco e submeta-se a uma cirurgia simulada, e os ratos restantes serão usados ​​para criar a menopausa modelos. Após a pesagem dos ratos, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de hidrato de cloral a 10% (0,3ml/100g) e a posição abdominal foi fixada. Em seguida, os ratos foram aparados sob a última costela nas costas, na intersecção da linha axilar média e cerca de 2 cm da face lateral da coluna, e depois desinfetados. A pele e os músculos das costas são incisados ​​​​cerca de 1 cm, e uma massa gorda branca leitosa e brilhante pode ser vista no campo de visão da incisão, e o ovário está embutido nela. Use uma pinça pequena para agarrar suavemente a massa gorda e puxá-la para fora da incisão, separe a massa gorda e você verá um grupo de ovários finos, irregulares e amarelo-avermelhados. Ao cortar, primeiro ligue a trompa de Falópio (incluindo a gordura) sob o ovário com um fio fino, remova completamente o ovário esquerdo e remova 80% do ovário direito. Após a operação, os cornos uterinos foram recolocados na cavidade abdominal, os músculos e a pele foram suturados e ambos os ovários foram removidos da mesma forma. Após a operação, os animais foram cuidadosamente criados e injetados por via intramuscular com 200,{14}} u/kg de penicilina (0,1ml cada) para prevenir infecção, uma vez ao dia durante 3 dias consecutivos. 5 dias após a operação, o exame de esfregaço vaginal das ratas foi iniciado um por um, uma vez ao dia durante 5 dias consecutivos. Ratas com reações de estro no esfregaço foram descartadas. Foram selecionados 72 ratos completamente castrados e divididos aleatoriamente em 6 grupos. Para fins experimentais, eles são o grupo modelo, grupo Gengnianan, grupo isoflavona de soja e grupo glicosídeo feniletanol Cistanche deserticola de dose grande, média e pequena.

Método de preparação: Método de preparação: {{0}},5% CMC Método de preparação: Pesar 4g de carboximetilcelulose sódica e misturar com água destilada para perfazer 800ml. As dosagens de doses grandes, médias e pequenas do grupo feniletanol glicosídeo Cistanche deserticola foram 133,33mg/kg, 66,67mg/kg e 33,33mg/kg respectivamente (volume de administração 1ml/100g). Método de preparo: Pesar 1333,3mg, 666,7mg e 333,3mg de flavonóides totais de framboesa respectivamente, dissolver com uma pequena quantidade de 0,5% CMC, ajustar o volume para 100ml, misturar bem e pronto. Cápsulas de Gengniangan (450mg/kg, misturadas com água destilada até 45 mg/ml, 1ml/100g, equivalente a 10 vezes a dosagem clínica); Modo de preparo: Tomar 15 Cápsulas de Gengniangan, primeiro dissolvê-las com uma pequena quantidade de CMC 0,5%, depois ajustar o volume para 100ml e misturar bem, que é a dose da Suspensão de Cápsulas de Gengnianan (450mg/kg). Cápsulas moles de vitamina E de isoflavona de soja (166,67mg/kg, use água destilada para fazer 16,67mg/ml, 1ml/100g, equivalente a 10 vezes a dosagem clínica); Método de preparação: Tome 4 cápsulas moles de vitamina E de isoflavonas de soja, primeiro dissolva com uma pequena quantidade de 0,5% CMC, depois ajuste o volume para 120ml e misture bem para obter a dose de suspensão de cápsulas moles de vitamina E de isoflavona de soja (16,67mg/kg ).

Método de administração: Os animais de cada grupo receberam os medicamentos correspondentes no primeiro0dia após a cirurgia. O grupo branco e o grupo modelo foram gavajados com o mesmo volume de solução de CMC a 0,5% (o volume de gavagem foi de 1ml/100g), e o grupo Gengnianan foi gavajado com suspensão de cápsula de Gengnianan (450mg/kg, equivalente a 10 vezes a dose clínica ). ), o grupo de isoflavonas de soja recebeu suspensão de cápsulas moles de vitamina E de isoflavonas de soja por via oral (166,67 mg/kg, equivalente a 10 vezes a dose clínica), e as doses grande, média e pequenaCistanche deserticola feniletanol glicosídeoos grupos foram administrados por via oral de acordo com o grupo. Doses grandes, médias e pequenas de glicosídeo feniletanol Cistanche deserticola (as dosagens são 133,33mg/kg, 66,67mg/kg e 33,33mg/kg respectivamente, o volume de dosagem é 1ml/100g), administradas uma vez ao dia por administração intragástrica, continuamente . remédio por 30 dias.

2.2 Itens de observação e métodos de detecção

As pontuações de movimento horizontal-vertical dos ratos em cada grupo foram medidas 29 dias após a administração. 2 horas após a última administração gástrica (jejum de 15 horas), retirar os globos oculares para coletar sangue, separar o soro eplasma, e medir o conteúdo de E2, T, LH, FSH, GnRH e BGP no soro, e o conteúdo de -EP no plasma; os ratos foram dissecados. Remova o timo, baço, útero e os 20% restantes do tecido ovariano, pese seus pesos úmidos e calcule o índice de órgão do timo, baço e útero (índice de órgão=peso úmido do órgão mg/peso do rato g) e, em seguida, remova o cérebro Para o hipotálamo e a glândula pituitária, foram preparados homogeneizados de tecido a partir do hipotálamo, glândula pituitária e 1/2 do útero, e o conteúdo de receptores de estrogênio no hipotálamo, glândula pituitária e homogeneizados de tecido uterino e o andrógeno O conteúdo do receptor nos homogenatos de tecido hipotalâmico foi determinado. O timo, baço, útero e ovário foram fixados em solução de formaldeído a 10%, embebidos em parafina, seccionados e corados com HE. Oalterações histomorfológicasem cada grupo foram observados ao microscópio óptico.

2.2.1 Teste do método de campo aberto

O dispositivo experimental é uma caixa cúbica aberta com altura de 40cm e comprimento e largura de 80cm. As paredes circundantes e o fundo são pretos. A parte inferior é composta por 25 blocos de áreas iguais, divididos por linhas brancas. Durante o experimento, o rato foi colocado no quadrado no centro da caixa aberta, e a pontuação de atividade horizontal do número de blocos que o rato cruzou no fundo em 5 minutos (quadrados com todas as quatro patas inseridas podem ser contados), e o número de vezes que os membros posteriores ficaram em pé (duas patas dianteiras estavam no ar). (ou agarrado a uma parede) pontuação de atividade vertical. As fezes devem ser completamente removidas após cada experiência, e cada rato é medido uma vez 2 horas após a administração. Este experimento foi conduzido em uma sala silenciosa.

2.2.2 Método de determinação do kit

Obtenha amostras de soro: Use tubos de ensaio livres de pirogênios e endotoxinas. Evite qualquer estimulação celular durante a operação. Após a coleta do sangue, centrifugue-o a 3.000 rpm por 10 minutos para separar rápida e cuidadosamente o soro e os glóbulos vermelhos. Obtenha amostras de plasma: anticoaguladas com tubos anticoagulantes de heparina. Centrifugar a 3000 rpm durante 30 minutos e retirar o sobrenadante. Obtenha amostras homogeneizadas de tecido: Adicione uma quantidade adequada de solução salina fisiológica ao tecido e amasse-o. Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos e retirar o sobrenadante.

O método de determinação do kit ELISA de estradiol (E2) de rato (Rato) é o mesmo do Experimento 2. As concentrações dos padrões (S0-S5) são 0, 4, 8, 16, 32, e 64 pmol/L.

O método de ensaio do Kit Testosterona (T) ELISA de Rato (Rato) é o mesmo que o método de ensaio do Kit Estradiol ELISA. As concentrações dos padrões (S{{0}}S5) são {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 e 320 pg /mL. O método de determinação do kit de detecção de hormônio luteinizante (LH) ELISA de rato (Rato) é o mesmo que o método de determinação do kit de detecção de estradiol ELISA. As concentrações dos padrões (S0-S5) são 0, 3, 6, 12, 24 e 48 ml/ml. O método de ensaio do kit ELISA de hormônio folículo-estimulante (FSH) de rato (Rato) é o mesmo que o método de ensaio do kit ELISA de estradiol. As concentrações dos padrões (S0-S5) são 0, 0,75, 1,5, 3, 6 e 12 UI/L. O método de determinação do kit de detecção ELISA do hormônio liberador de gonadotrofina de rato (Rato) (GnRH) é o mesmo que o método de determinação do kit de detecção ELISA de estradiol. As concentrações dos padrões (S0-S5) são 0, 5, 10, 20, 40 e 80 mlU/ml.

O método de determinação do kit de detecção ELISA de osteocalcina de rato (Rato) (BGP/OCN) é o mesmo que o método de determinação do kit de detecção de estradiol ELISA. As concentrações dos padrões (S{{0}}S5) são 0, 00,75, 1,5, 3, 6 e 12 ng/ml. O método de determinação do kit de detecção ELISA de rato (Rato) -endorfina (-EP) é o mesmo que o método de determinação do kit de detecção ELISA de estradiol. As concentrações dos padrões (S0-S5) são 0, 3, 6, 12, 24 e 48 pg/mL. O método de determinação do kit de detecção ELISA do receptor de estrogênio (ER) de rato (Rato) é o mesmo que o método de determinação do kit de detecção ELISA de estradiol. As concentrações dos padrões (S{{20}}S5) são 0, 4, 8, 16, 32 e 64 pg/mL. O método de determinação do kit de detecção ELISA de receptor de andrógeno (AR) de rato (Rato) é o mesmo que o método de determinação do kit de detecção ELISA de estradiol. As concentrações dos padrões (S0-S5) são 0, 25, 50, 100, 200 e 400 pg/mL.

2.3 Métodos de processamento estatístico

Para análise dos dados foi utilizado o pacote estatístico médico SPSS17.0 para o processamento estatístico dos dados. Os dados de medição foram expressos como média ± desvio padrão (-x±s). Análise de variância unidirecional foi utilizada para comparação entre grupos. O método LSD foi usado para testar a homogeneidade das variâncias. , o teste Games-Howell foi utilizado para variâncias desiguais e o teste Ridit foi utilizado para dados de notas.

Pode-se observar na Tabela 11 e na Figura 14 que, em comparação com o grupo branco, o índice do timo, o índice do baço e o índice uterino dos ratos no grupo modelo foram significativamente diminuídos (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Efeitos nos níveis do índice bioquímico sanguíneo em ratos modelo na perimenopausa

Os conteúdos séricos de E2, T, LH, FSH, GnRH e BGP e os conteúdos plasmáticos de -EP de ratos em cada grupo são mostrados nas Tabelas 12 a 13 e Figuras 15 a 17.

Pode-se observar nas Tabelas 12 a 13 e nas Figuras 15 a 18 que, em comparação com o grupo branco, os níveis séricos de E2 e T dos ratos no grupo modelo foram significativamente diminuídos (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Tabela 14 Efeito do glicosídeo feniletanol Cistanche deserticola nos níveis séricos de GnRH e plasma -EP em modelo de perimenopausa de ratos (-x±s)

Pode-se observar na Tabela 14 e nas Figuras 19-20 que, em comparação com o grupo branco, o nível sérico de GnRH dos ratos no grupo modelo aumentou significativamente e o nível plasmático de -EP diminuiu significativamente (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Efeitos sobre o conteúdo de ER e AR em tecidos de ratos modelo na perimenopausa

Os conteúdos de ER e AR em tecidos relevantes de ratos em cada grupo são mostrados nas Tabelas 16 a 17 e Figuras 22 a 23.

Pode-se observar na Tabela 17 e na Figura 23 que, em comparação com o grupo branco, o nível de AR no hipotálamo do grupo modelo foi significativamente menor (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Efeitos na morfologia do tecido orgânico em ratos modelo perimenopausa

Os resultados da observação patológica e histológica do útero, timo e baço de ratos em cada grupo experimental são os seguintes. As fotos patológicas são mostradas no Apêndice 1 para as fotos patológicas de ratos modelo na perimenopausa.

5.1 Efeito na morfologia do tecido uterino em ratos modelo perimenopausa

De acordo com os vários graus de alterações no endométrio, glândulas e miométrio dos ratos em cada grupo experimental, padrões semiquantitativos foram utilizados para dividir a morfologia patológica do tecido em quatro níveis, e os úteros dos ratos em cada grupo experimental foram medido. Os resultados da observação são mostrados na Tabela 18.

"-" As células epiteliais do endométrio, glândulas, miométrio e serosa estão todas normais; "+" as células epiteliais e glândulas do endométrio estão atrofiadas e o miométrio e a serosa estão normais; "++" o epitélio endometrial As células e glândulas estão parcialmente atrofiadas, a camada muscular está ligeiramente atrofiada e a serosa está normal; "+++" células epiteliais e glândulas endometriais estão significativamente atrofiadas e a serosa é normal.

Após o teste de Ridit, pode-se observar na Tabela 18 que, em comparação com o grupo branco, o útero dos ratos do grupo modelo apresentou lesões teciduais patológicas significativas (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Efeito na morfologia do tecido ovariano em ratos modelo perimenopausa

De acordo com os vários graus de alterações nos folículos, corpo lúteo, células da granulosa e vasos sanguíneos nos ovários de ratos em cada grupo de experimentos, padrões semiquantitativos foram usados ​​para dividir a morfologia patológica do tecido em quatro níveis. Os ovários dos ratos em cada grupo de experimentos foram medidos e observados. Os resultados são mostrados na Tabela 19.

Tabela 19 Efeito do glicosídeo feniletanol Cistanche deserticola nas alterações patológicas ovarianas em ratos modelo perimenopausa Unidade: apenas

"-" pode mostrar folículos em crescimento, folículos maduros e corpo lúteo em todos os níveis. O corpo lúteo é bem desenvolvido, com muitas camadas de células da granulosa, rico fluido folicular e ricos vasos sanguíneos; "+" pode mostrar folículos em crescimento, folículos maduros e corpo lúteo, mas o número de folículos maduros e corpo lúteo é pequeno. , os folículos são menores e as células da granulosa têm menos camadas; "++" pode mostrar folículos maduros e o corpo lúteo, com mais corpo lúteo, menos células da granulosa e menos vasos sanguíneos; "+++" não possui folículos, mais corpo lúteo e ovário atrófico, avascular.

Após o teste de Ridit, pode-se observar na Tabela 19 que, em comparação com o grupo branco, os ovários dos ratos do grupo modelo apresentaram lesões teciduais patológicas significativas (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Efeitos na morfologia do tecido do timo e do baço em ratos modelo perimenopausa

Usando um micrômetro, meça a espessura das partes mais espessas e estreitas do córtex tímico de cada rato em cada grupo experimental para obter a média; Use a linha de base do micrômetro para cair nos nódulos esplênicos, meça a espessura dos nódulos esplênicos em ambos os lados com a artéria central como centro e calcule a média. Os resultados medidos são mostrados na Tabela 20 e na Figura 24.

Pode-se observar na Tabela 20 e na Figura 24 que, em comparação com o grupo branco, a espessura do córtex do timo e o volume dos nódulos esplênicos no grupo modelo foram significativamente reduzidos (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).