Exame da variação diurna e diferenças sexuais na neurofisiologia do hipocampo e na memória espacial, parte 1

Abstrato

Os ritmos circadianos são processos biológicos que circulam ao longo de 24 horas e regulam muitas facetas da neurofisiologia, incluindo aprendizagem e memória. A variação circadiana no desempenho de tarefas de memória espacial está bem documentada; no entanto, o efeito do sexo ao longo do tempo circadiano (TC) permanece obscuro.

Neurofisiologia é o estudo da estrutura, função e patologia do sistema nervoso. Memória refere-se à capacidade de um indivíduo de preservar, reproduzir e utilizar informações da memória. Existe uma relação inseparável entre neurofisiologia e memória.

Na neurofisiologia, existe uma estrutura chamada sinapse, que é parte integrante do sistema nervoso. As sinapses são o local onde as informações são transmitidas entre os neurônios, e a memória é baseada nas sinapses. Quando um neurônio recebe informações, ele se comunica com outros neurônios por meio de sinapses e transmite as informações. O fortalecimento ou enfraquecimento desses contatos constitui a base para a formação e mudança da memória.

A memória é apenas o resultado de múltiplas trocas e cálculos entre diferentes neurônios do cérebro humano. O número de neurônios do corpo é fixo, ou seja, nossa reserva de memória é fixa. Portanto, melhorar a memória significa melhorar a força das conexões entre os neurônios, bem como o número e a qualidade das conexões entre as sinapses, o que exige maior conhecimento da neurofisiologia.

Portanto, a pesquisa neurofisiológica é muito benéfica para melhorar a memória individual. Aprender sobre neurofisiologia pode nos ajudar a entender melhor como funciona o cérebro humano, permitindo-nos melhorar a memória por meio de exercícios e treinamento. Alguns métodos incluem o fortalecimento das conexões entre os neurônios, lendo mais e pensando mais, e melhorando a quantidade e a qualidade das sinapses, realizando vários exercícios mentais.

Em suma, a investigação neurofisiológica pode não só ajudar-nos a compreender melhor a relação entre o cérebro humano e a memória, mas também fornecer vários métodos e técnicas para melhorar a memória individual. Portanto, devemos aprender ativamente conhecimentos relevantes sobre neurofisiologia para criar um ambiente melhor para a nossa memória. Percebe-se que precisamos melhorar nossa memória. Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória porque Cistanche deserticola é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da carne picada vem dos vários ingredientes ativos que contém, incluindo ácidos, polissacarídeos, flavonóides, etc. Esses ingredientes podem promover a saúde do cérebro de várias maneiras.

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Além disso, pouco se sabe sobre o impacto da hora do dia na fisiologia neuronal do hipocampo. Aqui, investigamos a influência do sexo e da hora do dia na neurofisiologia e na memória do hipocampo em camundongos. O desempenho na tarefa de memória de localização de objetos (OLM) dependia tanto do tempo circadiano quanto do sexo, com a memória melhorada à noite nos homens, mas durante o dia nas mulheres. A magnitude da potenciação sináptica de longo prazo (LTP) nas sinapses CA3-CA1 foi maior à noite em comparação com o dia em ambos os sexos.
Em seguida, medimos a excitação sináptica espontânea e a inibição dos neurônios piramidais CA1. A frequência e amplitude da inibição foram maiores durante o dia em comparação à noite, independentemente do sexo. A frequência e a amplitude da excitação foram maiores nas mulheres, em comparação com os homens, independentemente da hora do dia, embora tanto a hora do dia como o sexo influenciassem a probabilidade de libertação pré-sináptica.

À noite, os neurônios piramidais CA1 apresentaram excitabilidade aumentada (disparo do potencial de ação e/ou potencial basal) que dependia da excitação e inibição sináptica, independentemente do sexo. Este estudo enfatiza a importância do sexo e da hora do dia na fisiologia do hipocampo, especialmente tendo em conta que muitos distúrbios neurológicos que afetam o hipocampo estão ligados à perturbação circadiana e apresentam-se de forma diferente em homens e mulheres. O conhecimento sobre como o sexo e os ritmos circadianos afetam a fisiologia do hipocampo pode melhorar a relevância translacional da terapêutica e informar o momento apropriado dos tratamentos existentes.

Palavras-chave:

circadiano; hipocampo; memória; plasticidade; ritmos; sináptica.

Declaração de Significância

Os ritmos circadianos regulam muitos aspectos da neurofisiologia, incluindo a cognição. No entanto, o impacto da hora do dia e do sexo na neurofisiologia do hipocampo e na memória dependente do hipocampo permanece em grande parte inexplorado.

Aqui, relatamos que a regulação circadiana da memória de localização de objetos (OLM) depende do sexo. Além disso, o exame da fisiologia do hipocampo ao longo do dia em ambos os sexos revelou: maior potencialização sináptica de longo prazo à noite, maior transmissão sináptica inibitória diurna nos neurônios piramidais CA1, efeitos de ambos os sexos e da hora do dia na transmissão sináptica excitatória no CA1. neurônios piramidais e excitabilidade noturna aprimorada dos neurônios piramidais CA1 que depende tanto da entrada sináptica quanto da posição ao longo do eixo ântero-posterior do hipocampo. Estes resultados sublinham a importância de ter em conta o sexo, a localização regional e a hora do dia no estudo da fisiologia do hipocampo.

Introdução

O hipocampo é a sede do aprendizado e da memória no cérebro e sua produção primária é gerada pelas células principais (isto é, neurônios piramidais) na área CA1. O disparo do potencial de ação por um neurônio piramidal CA1, como qualquer outro neurônio, é uma função combinada de impulso sináptico excitatório e inibitório, propriedades intrínsecas da membrana que regulam a excitabilidade e neuromoduladores (Spruston, 2008).

Uma faceta relativamente inexplorada no hipocampo é como a fisiologia do neurônio piramidal CA1 é modulada pela hora do dia. No nível celular, as variações do horário do dia na função biológica são geradas por um ciclo de feedback transcricional-traducional (Partch et al., 2014). Os relógios dos tecidos de todo o corpo são organizados hierarquicamente em um sistema que orienta o tempo dos ritmos de 24-horas na fisiologia e no comportamento, permitindo que os organismos se adaptem e antecipem eventos que ocorrem regularmente em seu ambiente (Pilorz et al., 2020; Buijs et al., 2021).

A regulação circadiana dos processos fisiológicos é vantajosa e a desregulação dos ritmos circadianos pode promover e exacerbar o início e os sintomas da doença (Logan e McClung, 2019; Colwell, 2021). Portanto, compreender a influência circadiana na fisiologia é crucial para projetar intervenções para doenças com disfunção circadiana, como doenças neurodegenerativas (Lee et al., 2021).

Além disso, a maior parte do conhecimento básico sobre os princípios fundamentais da fisiologia do hipocampo é baseada em estudos realizados em roedores noturnos, principalmente machos, durante sua fase inativa (diurna). Embora a comunidade científica tenha começado a abordar a importância do sexo como factor na investigação biomédica, a importância da hora do dia ainda é relativamente subestimada. O objetivo geral deste estudo foi começar a desvendar como o sexo e a hora do dia interagem para influenciar a variação diária na fisiologia e função do hipocampo.

O núcleo supraquiasmático (SCN) do hipotálamo é o principal orquestrador da rede circadiana endógena, e as propriedades elétricas dos neurônios do SCN variam ao longo do dia.

A regulação circadiana da excitabilidade neuronal é generalizada no cérebro dos mamíferos (Paul et al., 2020) e foi observada em uma variedade de espécies, incluindo roedores (Snider et al., 2018), Drosophila (Cao e Nitabach, 2008; Sheeba, 2008), e peixe-zebra (Elbaz et al., 2013). Embora o NSQ seja o relógio principal, existem relógios circadianos autônomos em outras regiões do cérebro, incluindo o hipocampo (Paul et al., 2020; Hartsock e Spencer, 2020). No nível molecular, as sub-regiões do hipocampo expressam ritmicamente as proteínas do relógio central, com a camada do corpo celular da área CA1 tendo a expressão mais forte de PER2 (Jilg et al., 2010). Além disso, mais de 600 genes, incluindo aqueles que codificam canais iônicos e proteínas sinápticas, exibem expressão circadiana no hipocampo (Zhang et al., 2014; Renaud et al., 2015).

No nível celular, a potenciação de longo prazo (LTP), uma forma de plasticidade na qual padrões específicos de estimulação sináptica resultam em aumento duradouro na força da transmissão sináptica, é expressa em maior magnitude à noite em comparação com o dia em camundongos noturnos (Chaudhury et al., 2005; Besing et al.,2017; Davis et al., 2020). A função cognitiva também é regulada pelo sistema circadiano (Wright et al., 2012) e a regulação circadiana do desempenho em ensaios de memória dependentes do hipocampo foi demonstrada em várias espécies (Snider et al., 2018).

No entanto, nossa compreensão de como o sexo afeta a regulação circadiana da cognição é limitada. Além disso, faltam evidências no nível celular, incluindo uma compreensão detalhada de como a hora do dia e o sexo regulam o impulso sináptico e as propriedades da membrana das células piramidais CA1. Aqui, procuramos determinar como o sexo e a hora do dia modulam o circuito do hipocampo: desde o nível comportamental até a fisiologia neuronal individual.

Descobrimos que a regulação circadiana da memória dependente do hipocampo depende do sexo, enquanto as diferenças dia-noite na LTP do hipocampo não o são. Descobrimos também que a transmissão sináptica e a excitabilidade neuronal variam em função da hora do dia e descobrimos que algumas dessas mudanças dependem do sexo.

Materiais e métodos

Animais

Todos os procedimentos com animais seguiram o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos, e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade do Alabama em Birmingham. Todos os experimentos usaram camundongos C57BL/6J de 6- a 12- semanas de idade, de ambos os sexos, obtidos dos Laboratórios Jackson (http://jaxmice.jax.org/strain/013636.html) ou da colônia C57BL/6J em a Universidade do Alabama em Birmingham.

Os ratos foram mantidos num ciclo claro/escuro de 12/12 horas com acesso ad libitum a alimentos (LabDiet Rodent 5001 da Purina) e água. Os ratos foram alojados em gaiolas do mesmo sexo de quatro ratos para experimentos comportamentais. Para todas as outras experiências, os ratos foram alojados em grupos em gaiolas do mesmo sexo de dois a sete ratos por gaiola.

Memória de localização de objetos (OLM)

A tarefa de memória de localização de objetos (OLM) (Snider et al., 2016) foi conduzida sob luz vermelha fraca de 10 lux. Foram utilizadas quatro coortes de camundongos, sendo cada coorte composta por oito machos e oito fêmeas. Dentro de cada coorte, os ratos foram designados para passar por habituação, treinamento e testes durante o dia ou durante a noite. Nas coortes 1 e 3, os machos foram testados durante o dia e as fêmeas à noite. Nas coortes 2 e 4, as fêmeas foram testadas durante o dia e os machos à noite.

Os ratos foram conduzidos a um ciclo claro/escuro (LD) de 12/12 horas e, em seguida, habituados à arena por 2 dias no horário Zeitgeber (ZT) quatro ou ZT 16 (onde ZT 12 se refere às luzes apagadas), durante o dia e noite, respectivamente (dias 1–2; Fig.1A, B). Após o dia 2, os camundongos foram liberados na escuridão constante (DD) e novamente habituados à arena no tempo circadiano projetado (CT) 4 ou 16 (dias 3-4, onde CT 12 se refere ao tempo projetado de apagamento das luzes do ciclo LD anterior; Figura 1A, B). Os camundongos foram autorizados a se aclimatar à sala de comportamento por 20 minutos todos os dias, imediatamente antes da habituação ou treinamento/teste.

A habituação consistiu em 5 minutos de manuseio seguido de 5 minutos de exploração da arena com presença de pistas visuais. As dicas visuais consistiam em listras verticais em uma parede e um grande X vermelho em outra parede. As arenas tinham 35,5 x 25,4 cm e paredes de 20,3 cm de altura. O treinamento e o teste do OLM ocorreram em DD, 24 horas após o último dia de habituação no CT quatro ou CT 16 projetado. Os objetos foram feitos com blocos de construção PRETEX (item nº 8030-100) e tinham três posições possíveis dentro da arena, todas pelo menos 8,9 cm de distância das paredes.

Durante o treinamento, cada rato foi autorizado a explorar uma arena com dois objetos por 5 min. Posteriormente, o camundongo retornou à sua gaiola por 30 min, durante os quais um dos objetos da exploração original foi movido para uma nova posição (o novo local) enquanto outro permaneceu em sua posição original (o local familiar; Fig. 1C). Um período de recordação de 30-minutos foi escolhido com base em métodos publicados anteriormente (Snider et al., 2016) e para evitar interferência na memória devido à privação de sono ou ao aprimoramento da memória de um período de sono noturno.

Na fase de teste, cada rato foi colocado de volta na arena com os objetos de localização novos e familiares e foi autorizado a explorar por 5 min. Toda a habituação, treinamento e testes foram registrados a 30 FPS (Câmera ELP Modelo:ELP-USBFHD05MT-KL36IR). A exploração foi rastreada usando um modelo de computador feito via DeepLabCut. A interação do objeto foi então analisada usando scripts MATLAB (MathWorks) personalizados desenvolvidos por Mary Phillips (https://github.com/PhillipsML/DLC-NovelObject#dlc-novel object). Para análise de dados, vários critérios de exclusão foram aplicados: ratos que exibiram uma preferência lateral clara, ratos que passaram a maior parte do tempo explorando objetos para tentar escapar da arena e ratos com alta preferência por um objeto em detrimento de outro durante o treinamento foram excluídos. O índice de discriminação foi calculado como: (tempo gasto explorando a localização de um objeto novo, tempo gasto explorando a localização de um objeto familiar)/(tempo gasto explorando a localização de um objeto novo 1 tempo gasto explorando a localização de um objeto familiar).

Eletrofisiologia

Preparação de fatias

Os ratos foram mortos com deslocamento cervical e decapitação rápida em ZT {{0}}–1 ou ZT 11–12 para experimentos diurnos e noturnos, respectivamente. Tanto o sexo quanto a hora do dia foram intercalados. Para experimentos de campo extracelular, os cérebros foram removidos e fatias coronais de 350- mm foram preparadas usando um vibratome VT1200 S (Leica Biosystems) em uma solução gelada contendo o seguinte (em mM): 85 NaCl, 2,5 KCl, 4 MgSO4 *7H2O , 0,5 CaCl2 * 2H2O, 1,25 NaH2PO4, 75Sacarose, 25 NaHCO3, 25 Glicose saturada em 95% O2 e 5% CO2. As fatias foram deixadas em repouso por pelo menos 1 h em uma solução de recuperação de LCR artificial padrão (ACSF) contendo o seguinte (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 MgSO4 * 7H2O, 2,5 CaCl2 * 2H2O, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, e 11 glicose borbulhada com 95% O2/5% CO2.

Para experimentos de patch-clamp de células inteiras, os cérebros foram removidos e fatias coronais de 300-mm de espessura foram preparadas usando um vibratome VT1200 S (LeicaBiosystems) em uma solução gelada contendo o seguinte(em mM) : 110 cloreto de colina, 25 glicose, 7 MgCl2, 2,5 KCl, 1,25 Na2PO4, 0,5 CaCl2, 1,3 Na-ascorbato, 3 Na-piruvato e 25 NaHCO3, borbulhado com 95% O2/5% CO2.
As fatias foram deixadas em repouso por pelo menos 1 h em temperatura ambiente em uma solução de recuperação contendo o seguinte (em mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 Na2PO4, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHCO3 e 25 glicose, borbulhadas com 95% de O2/ 5% CO2. Para experiências que medem eventos sinápticos inibitórios, adicionou-se ácido cinurênico 2 mM à solução de recuperação.

Gravações de campo

Os dados foram obtidos de ZT 1–6 ou ZT 12–18 para registros diurnos e noturnos, respectivamente. Fatias coronais do hipocampo foram colocadas em uma câmara de submersão e continuamente perfundidas com ACSF padrão a 3-5 ml/min e 26-28 graus. Os axônios colaterais de Schaffer foram estimulados usando um eletrodo estimulador bipolar colocado no estrato radial da área CA3. Os EPSPs de campo (fEPSPs) foram obtidos com um eletrodo de registro colocado no estrato radial da área CA1, dentro de 200–300 mm do eletrodo estimulador.

A inclinação inicial dos fEPSPs (inclinação do fEPSP) foi medida na região linear imediatamente após o voleio de fibra e precedendo o pico do fEPSP. Os dados foram adquiridos e analisados ​​usando pCLAMP10/11 (Molecular Devices). Os dados foram registrados usando um amplificador Kerr Scientific S2 (Kerr Tissue RecordingSystem, Kerr Scientific Instruments). Os sinais foram digitalizados a 10 kHz (Digidata 1550B).

Curvas de entrada-saída (E/S) foram geradas medindo a inclinação de fEPSPs do estrato radiatum CA1 em resposta a uma série de intensidades de estimulação crescentes (0,2–200 mA , D 10 mA) nas garantias Schaffer. Os fEPSPs de linha de base foram obtidos fornecendo uma estimulação de 0,1-Hz para provocar fEPSPs de aproximadamente 0,20 mV/ms por 20 min.

Experimentos de potenciação de longo prazo (LTP) foram conduzidos obtendo e mantendo uma resposta estável de fEPSP por 20 min, e então a LTP foi induzida pela administração de uma estimulação de alta frequência (HFS; 100 Hz; 0,5 duração; entregue 2 com intervalo de 15-s). Este protocolo de estimulação mais fraco foi escolhido para evitar mascarar a diferença entre dia e noite na magnitude da LTP (Besing et al., 2017; Davis et al., 2020). Após HFS, as inclinações do fEPSP foram registradas por 40 minutos.

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