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Vinita D. Apraj1, Nancy S. Pandita2

1Departamento de Ciências Biológicas, 2Department of Chemistry, Sunandan Divatia School of Science, SVKM's NMIMS, Vile-Parle (W), Mumbai, Maharashtra, Índia

Cistanche tem um efeito anti-envelhecimento

ABSTRATO

Antecedentes: A casca de Citrus reticulata Blanco é tradicionalmente utilizada como tônica, estomacal, adstringente e carminativa. Também é útil em cuidados com a pele. Objetivo: estudar oanti-envelhecimentopotencial de extratos alcoólicos da casca de C. reticulata Blanco utilizando ensaios antioxidantes e antienzimáticos in vitro.

Materiais e Métodos: Os extratos vegetais foram obtidos por Soxhlação (CR HAE‑ Extrato Alcoólico Quente de Citrus reticulata) e maceração (CR CAE‑ Extrato Alcoólico Frio de Citrus reticulata). Foi realizada análise fitoquímica qualitativa e quantitativa. Além disso, in vitroantioxidante, anti-enzima e cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS) foram realizadas. Resultados: Os teores de fenólicos e flavonóides totais do CR HAE foram maiores do que os do CR CAE. O valor EC50 de CR HAE e CR CAE para ensaios de 1,1-Difenil-2-picrilhidrazil, ânion Superóxido e 2, 2'-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) foi 25{ {55}},33 ± 40,16 µg/ml e 254,73 ± 15,78 µg/ml, 221,27 ± 11,25 µg/ml e 354,20 ± 23,79 µg/ml e 59,16 ± 2,17 µg/ml e 59,12 ± 6,21 µg/ml, respectivamente. Os valores de capacidade de absorção de radicais de oxigênio para CR HAE e CR CAE foram de 1243 e 1063 µmoles equivalentes de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetra metilcromano-2-carboxílico/g de substância, respectivamente. As atividades anti-colagenase e anti-elastase foram avaliadas para CR HAE e CR CAE. Os valores EC50 de CR HAE e CR CAE para anti‑colagenase e anti‑elastase foram 329,33 ± 6,38 µg/ml, 466,93 ± 8,04 µg/ml e 3,22 ± 0,24 mg/ml, 5,09 ± 0,30 mg/ml, respectivamente. CR HAE exibiu atividade anti-colagenase e anti-elastase mais forte do que CR CAE. A análise GC-MS de CR HAE foi realizada porque CR HAE exibiu maiorantioxidantee potencial anti-enzimático do que o CR CAE. Conclusão: O peeling de C. reticulata pode ser utilizado emanti-rugasformulações de cuidados com a pele.

Palavras-chave: 1,1‑Difenil‑2‑picrilhidrazil, 2, 2'‑azino‑bis (ácido 3‑etilbenzotiazolina‑6‑sulfônico), anti‑rugas, elastase, cromatografia gasosa‑espectrometria de massa, capacidade de absorção de radicais de oxigênio

RESUMO

• O potencial anti-envelhecimento da pele do peeling de Citrus reticulata Blanco foi avaliado através

• Em vitroantioxidantee ensaios anti-enzimáticos

• Dois tipos de extração foram realizados e os extratos foram submetidos a análises fitoquímicas qualitativas e quantitativas. O extrato obtido por Soxhlation (CR HAE) apresentou maiores teores de fenólicos e flavonóides totais do que o extrato obtido por maceração (CR CAE)

• CR HAE demonstrou forte atividade de eliminação de radicais livres de DPPH e Superóxido, enquanto a atividade de eliminação de ABTS de ambos os extratos foi semelhante. A capacidade de absorção de radicais de oxigênio (ORAC) do CR HAE foi maior; indicando seu forte potencial antioxidante

• As atividades de inibição da enzima colagenase e elastase in vitro foram avaliadas para ambos os extratos e o CR HAE mostrou forte potencial anti‑colagenase e anti‑elastase, indicando sua capacidade anti‑envelhecimento

• A análise GC‑MS de CR HAE revelou a presença de vários compostos

incluindo principalmente polimetoxiflavonas. O CR HAE apresentou atividade antioxidante e antienzimática promissora e pode ser usado como potencialanti-rugasagente emanti-envelhecimentoformulações para cuidados com a pele.

Abreviação utilizada: ECM: Matriz extracelular, UV: Ultravioleta, ROS: Espécie de oxigênio reativo, MMP: Metaloproteinase de matriz, Chc: Clostridium histolyticum colagenase, DPPH: 2, 2-difenil- 1-picrilhidrazil, GC-MS: Cromatografia Gasosa- Massa Espectroscopia, RT: Temperatura ambiente, µg GAE/mg: Micrograma equivalente de ácido gálico/miligrama, W/V: Peso por Volume, µg QE/

mg: Micrograma equivalente de quercetina / miligrama, CR HAE: Extrato Alcoólico Quente de Citrus reticulata Blanco, CR CAE: Extrato Alcoólico Frio de Citrus reticulata Blanco, EC50: Metade da Concentração Efetiva Máxima, PMS NADH: Fenazina metossulfato nicotinamida adenina dinucleotídeo, NBT: Nitroblue tetrazolium , DMSO: Dimetilsulfóxido,APS:Amônio Persulfato, AAPH: 2,2 ‑azobis(2‑amidino‑propano) dicloridrato,TROLOX: (±) 6‑hidroxi‑2,5,7,8‑tetrametilcromano‑2‑carboxílico ácido, ORAC: Oxygen Radical Absorbance Capacity, FALGPA: N‑[3‑(2‑Furyl) acriloil)]‑Leu‑Gly‑Pro‑Ala, SANA: Succinil‑Ala‑ Ala‑Ala‑p‑nitroanilida, Rf: Retardo Fator, MSD: Detector Seletivo de Massa

INTRODUÇÃO

O papel mais importante da pele para os seres humanos é criar uma barreira entre o ambiente interno e externo do corpo. Internamente, a pele abriga e protege todo o fenômeno físico-químico necessário à vida, externamente é uma barreira contra as forças mecânicas. A pele é o maior órgão do corpo.[1] É um órgão muito sensível e pode ser facilmente danificado por infecções e doenças.

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Problemas de pele podem surgir devido a vários fatores, como poluição ambiental, exposição excessiva aos raios ultravioleta, idade do indivíduo, microorganismos nocivos, hábitos alimentares, estresse e produtos químicos. O tratamento e os cuidados com a pele são essenciais não apenas para ter uma pele saudável, mas também para o bem-estar geral da pessoa.[2]

Um dos principais problemas de pele no mundo de hoje é o envelhecimento prematuro da pele. O processo de envelhecimento da pele foi dividido em duas categorias: envelhecimento intrínseco e envelhecimento extrínseco. O envelhecimento intrínseco da pele ou envelhecimento natural é causado por alterações na elasticidade da pele ao longo do tempo. O envelhecimento extrínseco da pele resulta predominantemente da exposição à radiação solar (fotoenvelhecimento). Os radicais livres formados devido ao estresse oxidativo desempenham um papel importante no curso do envelhecimento intrínseco e extrínseco.[3] A pele é composta por três camadas principais; epiderme, derme e subcutâneo. Os principais componentes da derme são as fibras de colágeno e elastina. A redução de colágeno e elastina leva arugaformação.[4] A principal razão pela qual a pele começa a ceder e a se formarrugasé a quebra de elastina e colágeno. As enzimas colagenase e elastase são responsáveis ​​pela quebra de vários componentes da matriz extracelular (MEC), ou seja, colágeno e elastina. A elastina é uma proteína que ajuda a pele a ficar macia e firme. Quando sua pele é esticada, é a elastina que a devolve à sua posição normal. O colágeno é uma proteína fibrosa. O colágeno é especial entre as proteínas por sua grande resistência à tração proporcionando firmeza à pele.Rugasresultam de uma combinação de envelhecimento intrínseco e extrínseco, bem como devido ao aumento do nível de enzimas colagenase e elastase.[5]

Cosméticos são usados ​​regularmente e universalmente em diferentes formas para realçar a beleza. Cosméticos para cuidados com a pele tratam a camada superficial da pele fornecendo melhor proteção contra o meio ambiente do que a pele não tratada.[6] Há uma demanda crescente por cosméticos para cuidados com a pele facial. De acordo com o monitor de dados, os gastos globais com produtos para cuidados com a pele em 2012 foram de US$ 82 bilhões, sendo que dois terços dos gastos incluíram cuidados com a pele facial. Um relatório de pesquisa e mercados espera que a receita global da indústria de produtos para cuidados com a pele ultrapasse 100 bilhões de dólares em 2018. Espera-se que o segmento de cuidados faciais continue a dominar o mercado. A crescente demanda poranti-envelhecimentoprodutos e a crescente preocupação com o uso de produtos naturais e orgânicos para cuidados com a pele são os principais fatores que impulsionam a indústria de cuidados com a pele.[7] Cosméticos por si só não são suficientes para cuidar da pele e partes do corpo; requer associação de ingredientes ativos para verificar os danos e envelhecimento da pele. Estes ativos à base de plantas que contêm ingredientes ativos são muito essenciais para manter a saúde da pele. Cosméticos com ativos fitoterápicos estão surgindo agora como uma solução apropriada para o problema atual.[8] No presente estudo, a peleanti-envelhecimentopotencial dos extratos alcoólicos da casca de Citrus reticulata Blanco foram avaliados por ensaios in vitro de antioxidantes, anti‑colagenase e anti‑elastase. C. reticulata Blanco (Rutaceae) é comumente conhecida como Narangi ou Santra (Laranja). A fruta é laxante, afrodisíaca, adstringente, tônica e alivia o vômito.[9] A casca do fruto é tradicionalmente utilizada como tônica, estomacal, adstringente, carminativa e anti-escorbútica. A casca cítrica tem sido considerada um subproduto da indústria de frutas cítricas, mas foi relatado que contém vários componentes ativos em concentração muito maior do que a polpa.[10] A casca da fruta também é útil no cuidado da pele.

MATERIAIS E MÉTODOS

Produtos químicos e reagentes

Ácido ascórbico, quercetina, cloreto férrico, carbonato de sódio (Na2CO3), nitrito de sódio (NaNO2), hidróxido de sódio (NaOH), cloreto de alumínio (AlCl3), 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), elastase pancreática suína (EC .3.4.21.36), Succinil‑Ala‑Ala‑Ala‑p‑nitroanilida (SANA), Clostridium histolyticum colagenase (ChC) (EC.3.4.23.3), N‑(3‑[2‑Furil]acriIoil)‑Leu‑ Gly-Pro-Ala (FALGPA), sal de sódio de fluoresceína, dicloridrato de 2,2-azobis (2-metil propionamidina) (AAPH) e ácido gálico foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, EUA). 2, 2 '-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) diamônio

sal (ABTS), (±) ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetra metilcromano-2-carboxílico (TROLOX) adquirido de Fluka, EUA. Nitro azul tetrazólio (NBT), metosulfato de fenazina (PMS) e nicotinamida adenina dinucleotídeo - sal dissódico reduzido (NADH) foram obtidos de SRL Pvt. Ltda., Mumbai, Índia. Amônio por sulfato (APS) foi adquirido de Rankem, Índia.

Coleta de material vegetal

Frutos de C. reticulata Blanco, Rutaceae foram obtidos em janeiro de 2013 em Mumbai (Índia). A identificação taxonômica do material vegetal foi confirmada pelo Dr. CS Latto, da Universidade de Mumbai. A autenticação foi feita no Agharkar Research Institute, Pune.

Extração de material vegetal

As frutas foram cuidadosamente lavadas em água. As cascas foram separadas dos frutos e secas à sombra. Em seguida, o material seco foi submetido à forma de pó e armazenado em recipiente hermético à temperatura ambiente. Cerca de 50 g de pó seco foram extraídos com 300 ml de metanol. Os extratos vegetais foram obtidos por Soxhlação (CR HAE‑ Extrato Alcoólico Quente de Citrus reticulata) e maceração (CR CAE‑ Extrato Alcoólico Frio de Citrus reticulata). A extração Soxhlet foi realizada a 65 graus por 10-12 h. A maceração a frio foi realizada por agitação constante; onde a mistura de pó vegetal e metanol foi mantida em agitador rotativo (REMI CIS-24 PLUS) e foi fixada a 100 rpm em RT por 72 h. Os extratos foram filtrados usando papel de filtro Whatman no. 1, e os filtrados foram então evaporados sob pressão reduzida e secos usando um evaporador rotativo (R-205, Buchi Laboratory Equipment, Flawil, Suíça) ajustado a 50 graus. Os extratos secos foram armazenados a 4 graus, em frascos rotulados, estéreis e tampados até uso posterior.

Análise fitoquímica preliminar de extratos

Os extratos mencionados acima foram submetidos a vários testes fitoquímicos qualitativos para identificação dos constituintes químicos presentes no material vegetal de acordo com os métodos descritos.[11]

Determinação do conteúdo fenólico total

O conteúdo fenólico total (TPC) foi determinado com o reagente Folin ‑Ciocalteu usando o método fornecido.[12] Para 0,5 ml de cada amostra, 2,5 ml de diluição 1:10 de Folin - reagente de Ciocalteau e 2 ml de Na2CO3 (7,5 por cento p/v) foram adicionados e incubados a 765 nm usando um espectrofotômetro ultravioleta-visível. Os resultados foram expressos em µg de equivalente de ácido gálico por mg de extrato (µg GAE/mg de extrato).

Determinação do conteúdo total de flavonóides

O conteúdo total de flavonóides (TFC) foi medido pelo ensaio colorimétrico AlCl3.[13]

Uma alíquota (1 ml) de extratos ou soluções padrão de quercetina (20, 40, 60, 80 e 100 µg/ml) foi adicionada a um balão volumétrico de 10 ml contendo 4 ml de água destilada. Ao frasco, foram adicionados 0,30 ml de NaNO2 a 5 por cento e após 5 min, foram adicionados 0,3 ml de AlCl3 a 10 por cento. Após 5 minutos, adicionou-se 2 ml de NaOH 1M e o volume foi completado para 10 ml com água destilada. A solução foi misturada e a absorbância foi medida em relação ao branco a 510 nm. O TFC foi expresso em µg de equivalente de quercetina por mg de extrato (µg QE/mg de extrato).

Ensaios antioxidantes

1, 1-ensaio de eliminação de radicais livres de difenil-2-picrilhidrazil

A atividade de eliminação de radicais livres foi avaliada por determinado método com algumas modificações.[14] A atividade sequestradora de radicais livres foi avaliada por um determinado método com algumas modificações. Um volume de 1 ml das diferentes concentrações (100–800 µg/ml) de amostras de teste foi misturado com 200 µl de solução de metanol DPPH (0,36 mg/ml). Após agitação, a mistura foi incubada no escuro à temperatura ambiente por 30 min, e então a absorbância foi medida a 517 nm. O ácido ascórbico foi usado como controle positivo.

Ensaio de eliminação de ânion superóxido de fenazina metosulfato-NADHsystem

A atividade de eliminação de superóxido foi avaliada por um determinado método.[15] Tampão Tris HCl (3 ml, 16 mM, pH 8.0) contendo 0,75 ml de solução de NBT (50 µM), 0,75 ml de NADH ( 78 µM) e 0,3 ml de solução de amostra de extrato (50–350 µg/ml) em metanol foram misturados. A reação foi iniciada quando 0,75 ml de solução de PMS (10 µM) foi adicionado à mistura. A mistura de reação foi incubada a 25 graus por 5 min, e a absorbância foi lida a 560 nm contra as amostras em branco correspondentes. O ácido ascórbico foi usado como padrão.

Ensaio de eliminação de radicais 2, 2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)

O ensaio é realizado de acordo com o método fornecido.[16] Os cátions radicais ABTS foram produzidos pela reação de ABTS e APS e incubação da mistura à temperatura ambiente no escuro por 16 h. Em resumo, o volume total da reação continha 10 mM de PBS pH 7,4 (controle positivo ou soluções de teste) de várias concentrações. A solução radical ABTS foi adicionada a uma concentração final de 0,219 mM. A mistura de reação foi misturada e imediatamente lida a 734 nm usando um leitor de microplacas (VERSA max, Molecular devices, EUA). Uma reação de controle foi realizada sem a amostra de teste. O ácido gálico foi usado como controle positivo.

A capacidade dos extratos de sequestrar radicais DPPH, PMS-NADH e radical livre ABTS foi calculada pela seguinte fórmula:

Atividade de eliminação de radicais ( por cento )=([Abs de controle − Abs de amostra]/Abs de controle) ×100, onde Abs é a absorbância no comprimento de onda mencionado na presença ou ausência dos extratos de teste.

Ensaio de capacidade de absorção de radicais de oxigênio

Este ensaio foi realizado de acordo com o método descrito.[17] Uma mistura de pré-incubação de 140 µl continha − 20 µl de solução de teste ou TROLOX de várias concentrações. tampão fosfato de sódio 75 mM, pH 7,4; 120 µl de fluoresceína de sódio (117 nM) misturado e incubado a 37 graus durante 10 min. Após a pré-incubação, 60 µl de AAPH (40 mM) foram adicionados e misturados por 15 s. A reação foi realizada por 90 min a 37 graus. As medições de fluorescência foram feitas a 485 nm de excitação e filtros de emissão de 520 nm.

Ensaios enzimáticos

Ensaio anti-colagenase

O ensaio de inibição da colagenase foi realizado pelo método descrito anteriormente,[18] que se baseia na hidrólise do FALGPA pela colagenase para produzir FA‑Leu e Gly‑Pro‑Ala. O ensaio foi realizado em tampão Tricina 50 mM (NaCl 400 mM e CaCl2 10 mM, pH 7,5). ChC foi dissolvido no tampão para uso em uma concentração inicial de 0,8 unidades/ml. O substrato sintético, FALGPA, foi dissolvido no tampão Tricina a 2 mM. Os extratos de amostra foram incubados com a enzima no tampão por 15 min antes de adicionar substrato para iniciar a reação. A mistura de reação final (volume total de 75 µl) continha 25 µl de tampão tricina 50 mM, 25 µl de extrato de teste (250–4000 µg/ml) e 25 µl de 0,1 unidades de enzima ChC. Os controles realizados com tampão Tricina 50 mM como extratos de teste foram dissolvidos em tampão Tricina (50 mM), enquanto a catequina foi usada como controle positivo. Após a adição de 50 µl de substrato FALGPA 2 mM, a atividade da colagenase foi medida imediatamente a 340 nm por 20 min usando um leitor de microplacas de 96 poços (Bio‑Tek M Quant, FLX 800).

Ensaio anti-elastase

O ensaio empregado foi baseado em métodos da literatura.[19] Este ensaio foi realizado em tampão Tris-HCL 0,2 mM (pH 8.0). A elastase pancreática suína (PE – EC 3.4.21.36) foi dissolvida para fazer uma solução estoque de 1 mg/ml em tampão {{10}},2 mM Tris-HCL. O substrato N‑Succinil‑Ala‑Ala‑Ala‑p‑nitroanilida (SANA) foi dissolvido em tampão a 0,8 mM. Os extratos de teste (0,156-10 mg/ml) foram incubados com a enzima por 20 minutos antes de adicionar substrato para iniciar a reação. A mistura de reação final (total de 250 µl) continha 50 µl de extrato de planta, 160 µl de tampão, 20 µl de enzima e 20 µl de substrato. A catequina foi usada como controle positivo. Os controles negativos foram realizados usando tampão Tris-HCL. A absorbância foi medida imediatamente a 410 nm e depois continuamente por 20 min usando um leitor de microplacas de 96 poços (Bio-Tek M Quant, FLX 800). A inibição percentual para ambos os ensaios é calculada por: Atividade de inibição enzimática ( por cento )=(1− [B/A]) ×100

Onde, A=Atividade enzimática sem amostra, B=Atividade na presença de amostra.

Análise de espectrometria de massa por cromatografia gasosa

As seguintes condições foram adotadas para análise de cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS).[20] A identificação do componente foi feita usando o cromatógrafo gasoso Agilent 7890 A acoplado ao detector seletivo de massa inerte (MSD) 5975 C com detector de eixo triplo. As amostras foram injetadas pela Agilent amostrador automático 7693 no Agilent 19091S‑433: coluna HP‑5MS (30 m × 250 µm × 0,25 µm). O hélio foi usado como gás de arraste (1 ml/min). A temperatura do injetor e do detector foi mantida em 250 graus. A temperatura da coluna foi programada a 60 graus por 3 min e depois aumentada para 160 graus por 2 min a 10 graus/min. A temperatura adicional foi aumentada até 300 graus (a 15 graus/min). Os espectros de massa foram adquiridos em uma faixa de 40 a 500 amu no modo EI. Os compostos eluídos foram identificados comparando os dados espectrais de massa com os dados padrão disponíveis na biblioteca do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia. Os principais constituintes do extrato metanólico Soxhlet da casca de C. reticulata Blanco (CR HAE) foram identificados por análise GC‑MS.

Análise estatística

Os valores de EC50 foram expressos como média ± desvio padrão, a análise estatística foi realizada por análise de variância unidirecional seguida do teste de comparação múltipla de Tukey (P < 0,05)="" onde,="" todas="" as="" amostras,="" ou="" seja,="" extratos="" de="" teste="" e="" padrão="" positivo="" foram="" comparados="" entre="" si.="" todos="" os="" cálculos="" foram="" realizados="" no="" graphpad="" prism="" (versão="" 5.0,="" graphpad="" software,="">

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Análise fitoquímica preliminar de extratos

A análise fitoquímica preliminar de extratos metanólicos de C. reticulata Blanco indica a presença de carboidratos, aminoácidos, flavonóides, taninos e derivados fenólicos, esteróides, etc., [Tabela 1].

Tabela 1: Análise fitoquímica preliminar dos extratos metanólicos da casca de Citrus reticulata Blanco

FeCl3: Cloreto férrico; CR HAE: Extrato Alcoólico Quente de Citrus reticulata Blanco; CR CAE: Extrato Alcoólico Frio de Citrus reticulata Blanco

Determinação do conteúdo fenólico total

Os fenólicos, particularmente os polifenóis, exibem uma ampla variedade de atividades biológicas benéficas em mamíferos, incluindo antiviral, antibacteriana, imunoestimulante, antialérgica, anti-hipertensiva, anti-isquêmica, anti-arrítmica, anti-trombótica, hipocolesterolêmica, anti-lipoperoxidante , ações hepatoprotetoras, antiinflamatórias e anticancerígenas.[21,22] Vários estudos mostraram que os flavonóides atuam como sequestradores de ânions superóxido, oxigênio singlete, radicais hidroxila e radicais peroxil lipídicos.[23,24] TPC e TFC foram determinados para ambos os extratos usando curvas padrão [Figura 1]. CR HAE apresentou maior teor fenólico, ou seja, 187,93 ± 4,69 µg GAE/mg extrato do que CR CAE, ou seja, 58,66 ± 2,40 µg GAE/mg extrato. TFCs para CR HAE e CR CAE foram quase semelhantes, ou seja, 171,72 ± 4,13 µg QE/mg extrato e 169,88 ± 9,79 µg QE/mg extrato, respectivamente.

Determinação do conteúdo total de flavonóides

A atividade antioxidante não deve ser concluída com base em um únicoantioxidantemodelo de teste. Na prática, vários procedimentos de teste in vitro são realizados para avaliarantioxidanteatividades com as amostras de interesse.[25] No presente estudo, avaliamos aantioxidantepotencial de CR HAE e CR CAE por váriosantioxidanteensaios incluindo ensaio de eliminação de radicais livres DPPH, ensaio de eliminação de aniões superóxido, ensaio de eliminação de radicais ABTS e ensaio de capacidade de absorção de radicais de oxigénio (ORAC).

Ensaios antioxidantes

1, 1-ensaio de eliminação de radicais livres de difenil-2-picrilhidrazil

O ensaio de eliminação de radicais livres de DPPH é um dos ensaios mais comumente usados ​​para testar a atividade de eliminação de radicais preliminares de extratos de plantas. oantioxidanteA atividade de extratos de plantas contendo componentes de polifenóis é devido à sua capacidade de doar átomos de hidrogênio ou elétrons e eliminar os radicais livres.[26] Assim, a cor púrpura do DPPH será reduzida a , ‑difenil‑ ‑picrilhidrazina (amarelo). Os resultados indicam que CR HAE e CR CAE mostraram até 85 por cento de eliminação de radicais livres DPPH [Figura 2]. O ácido ascórbico foi usado como controle positivo e mostrou atividade de eliminação de até 92 por cento . CR HAE exibiu um pouco maiorantioxidanteatividade do que CR CAE. Os valores de EC50 (µg/ml) foram expressos na Tabela 2.

Ensaio de eliminação do ânion superóxido do sistema fenazina metossulfato-NADH Embora o ânion superóxido seja um oxidante fraco, ele acaba produzindo

Tabela 2: Valor EC de extratos metanólicos de Citrus reticulata Blanco Peel para ensaios de DPPH, superóxido, ABTS, anti‑colagenase e anti‑elastase

radicais hidroxila poderosos e perigosos, bem como oxigênio singlete, os quais contribuem para o estresse oxidativo.[27] Os radicais superóxido gerados a partir do oxigênio dissolvido pelo acoplamento PMS-NADH e podem ser medidos por sua capacidade de reduzir o NBT. A diminuição da absorbância em 560 nm com o extrato da planta indica sua capacidade de extinguir os radicais superóxido na mistura de reação. CR HAE mostrou forte atividade de eliminação de superóxido do que CR CAE [Figura 3]. O ácido ascórbico foi usado como controle positivo e seqüestra o ânion superóxido em até 52%. Os valores de EC50 (µg/ml) foram calculados e expressos na Tabela 2. CR HAE foi mais eficaz (P < 0,05)="" do="" que="" cr="" cae,="" pois="" mostrou="" menor="" valor="" de="" ec50="" (µg/ml)="" e="">antioxidanteatividade.

Ensaio de eliminação de radicais 2, 2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)

O ensaio ABTS é baseado na eliminação de luz por radicais ABTS. Umantioxidantecom a capacidade de doar um átomo de hidrogênio extingue o radical livre estável, um processo que está associado a uma mudança na absorção, que pode ser seguida espectrofotometricamente.[28] A atividade ABTS foi quantificada em termos de porcentagem de inibição do cátion radical livre ABTS porantioxidantesem cada amostra. Os valores ABTS de CR HAE, CR CAE e ácido gálico foram apresentados na Tabela 2. CR HAE e CR CAE mostraram atividade sequestradora de radicais ABTS de maneira dependente da concentração e observados até 59 por cento. O ácido gálico mostrou até 79 por cento da capacidade de eliminação de ABTS [Figura 4]. Os valores de EC50 (µg/ml) obtidos para CR HAE e CR CAE não indicaram diferença significativa (P < 0,05)="" e="" sugeriram="" que="" ambos="" os="" extratos="" têm="" potencial="" de="" eliminação="" de="" abts="" quase="">

Ensaio de capacidade de absorção de radicais de oxigênio

O ensaio ORAC é considerado um ensaio biologicamente mais relevante do que outros métodos de mediçãoantioxidantepotência porque mede as reações de transferência de átomos de hidrogênio e simula in vivoantioxidanteação.[29] Ele também mede quão bem os componentes solúveis em água e lipossolúveis de uma substância natural protegem um alvo padronizado da oxidação por nitrito de peroxila, radicais hidroxila, ânion superóxido e

oxigênio singlete, e gera uma pontuação baseada na comparação com umantioxidante[30] No presente estudo, medimos os valores ORAC para CR HAE e CR CAE e expressos em termos de TROLOX (mmols TROLOX Equivalente/g de substância) [Figura 5]. CR HAE apresentou valor ORAC mais alto (1243 mmoles TROLOX Equivalente/g de substância) do que CR CAE (1063 µmoles TROLOX Equivalente/g de substância) [Tabela 2].

Ensaios enzimáticos

Ensaio anti-colagenase

As metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma família de enzimas proteolíticas que degradam vários componentes da MEC. A colagenase é um dos membros da família MMP e é responsável pela degradação do colágeno. A colagenase da bactéria C. histolyticum (ChC) (C 3.4.24.3) é uma das poucas proteinases capazes de degradar a região helicoidal tripla do colágeno nativo em condições fisiológicas e in vitro utilizando peptídeos sintéticos como substratos. O efeito protetor de extratos vegetais contra a enzima colagenase pode ser estudado usando ChC e substrato sintético FALGPA.[31] No presente estudo, a atividade de inibição da colagenase foi avaliada para CR HAE e CR CAE. A catequina foi usada como controle positivo. Os resultados demonstraram que o extrato CR HAE foi mais eficaz na inibição da enzima colagenase do que CR CAE e mostrou inibição de até 76 por cento [Figura 6]. A eficácia foi medida em termos de valor EC50 (µg/ml) e expressa na Tabela 2.

Ensaio anti-elastase

A elastase é a única enzima capaz de degradar a elastina. A inibição da enzima elastase pode reter a elasticidade e flexibilidade da pele.[32] Em termos deanti-envelhecimento, encontrar inibidores de enzimas elastase pode ser útil

para evitar a perda de elasticidade da pele e, portanto, a flacidez da pele. No ensaio anti‑elastase, a elastase pancreática suína foi ensaiada espectrofotometricamente usando [N‑Succ‑(Ala) 3‑p‑nitroanilida] como substrato, e a quantidade de p‑nitroanilina foi determinada medindo a absorbância a 41{{ 6}} nm. Os efeitos inibitórios de CR HAE e CR CAE na atividade da elastase foram investigados. A catequina foi usada como controle positivo. CR HAE mostrou forte atividade de inibição de elastase percentual em comparação com CR CAE e até 80 por cento de inibição foi observada [Figura 7]. Os valores de EC50 (mg/ml) foram expressos na Tabela 2 e observou-se que CR HAE foi mais potente que CR CAE (P < 0,05).="" o="" valor="" de="" ec50="" obtido="" para="" a="" catequina="" foi="" muito="" menor,="" indicando="" sua="" forte="" atividade="" anti-elastase="" e="" seu="" papel="" como="">anti-envelhecimentocomponente. Kim et al., 2004 mostraram que a catequina e o galato de epigalocatequina isolados do chá verde (Camellia sinensis) eram potentes inibidores anti‑elastase.

Análise de espectrometria de massa por cromatografia gasosa

CR AEH apresentou maiorantioxidantee habilidades anti-envelhecimento em comparação com CR CAE; portanto, a análise GC-MS do CR HAE foi realizada para entender os constituintes presentes nele. Um total de 20 compostos diferentes foram identificados e apresentados na Tabela 3. O cromatograma mostrou 20 picos no tempo de retenção variando de 2,95min a 44,45min [Figura 8]. O maior pico em 44,11 min com 44,37 por cento de área foi identificado como ácido butilfosfônico, pentil 4-(2-fenilprop-2-il) fenil éster. Zab et al., 2012[33] relataram oantioxidantee atividade anti-tumoral do ácido butilfosfônico, pentil 4-(2-fenilprop-2-il) fenil éster presente no extrato etanólico de C.reticulata. dihidro) ou 4-Chromanona (21,43 por cento de área) que é um tipo de

flavanona. Di Majo et al., 2005[34] isolaram as flavanonas de frutas cítricas e mostraram estrutura-dependenteantioxidanteatividade. Outros compostos 3', 4', 5, 7, 8-Pentametoxiflavona e 4', 5, 7, 8-Tetrametoxiflavona são tipos de polimetoxiflavona (PMF). PMF exibe um amplo espectro de atividades biológicas. Recentemente, Ho et al., 2012[35] isolaram e identificaram PMFs hidroxilados de cascas de frutas cítricas e investigaram suas atividades biológicas, incluindo propriedades anti-inflamatórias e quimiopreventivas do câncer. Outros compostos identificados incluem D-Limoneno (1,46 por cento de área), 4H-pirano-4-ona, 2, 3-di-hidro-3, 5-di-hidroxi-6-metil (1,46 por cento de área), 2-Metoxi-4-vinilfenol ( 1,67 por cento de área) e ácido n-hexadecanóico (2,51 por cento de área) e pode estar relacionado com aanti-envelhecimentopotencial da casca de C. reticulata Blanco. As estruturas de todos os compostos identificados foram apresentadas na Figura 9.

CONCLUSÃO

Extratos de C. reticulata Blanco foram avaliados contra o envelhecimento da pele por meio de testes in vitroantioxidante, ensaios anti-colagenase e anti-elastase. O estudo mostrou que o extrato metanólico (Soxhlation) apresentouantioxidantee atividade anti-enzimática e pode ser usado como um potenteanti-rugasagente emanti-envelhecimentoformulações de cuidados com a pele.

Reconhecimento

Os autores agradecem ao Underwriters Lab (UL), Bangalore, Índia, pela GC-MS Analysis and Natural Remedies, Bangalore, Índia, pela ORAC Analysis.

Apoio financeiro e patrocínio

Nada.

Conflitos de interesse

Não há conflitos de interesse.