Avaliação da atividade antimelanogênica e do mecanismo da galangina in silico e in vivo
Mar 29, 2022
Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Ki Wung Chung, Hyeong Oh Jeong, Eun Kyeong Lee, Su Jeong Kim, Pusoon Chun, bHae Young Chung,*, a e Hyung Ryong Moon*, a
A pigmentação anormal devido à síntese excessiva de melanina pode resultar em problemas graves, como sardas, manchas da idade e melanoma. Os inibidores da tirosinase têm sido um alvo interessante para o tratamento da hiperpigmentação porque a tirosinase é a enzima que limita a taxa de síntese de melanina. A triagem para inibidores fortes da tirosinase levou à descoberta do flavonóidegalanina, que mostrou efeitos inibitórios notáveis sobre a tirosinase de cogumelos. O valor de IC50 da galanina (3,55±0,39 µM) foi inferior ao do ácido kójico (48,55±1,79 µM), que foi utilizado como controle positivo. Simulação de docking in silico e estudos mecanísticos demonstraram que a galanina interagiu com os sítios catalíticos da tirosinase e competiu com a tirosina. Em células de melanoma B16F10 estimuladas com hormônio estimulante de melanócitos, a galanina inibiu a atividade da tirosinase, bem como a produção de melanina. Embora altas doses degalaninaforam citotóxicos, não foram observados efeitos citotóxicos em doses baixas. Além disso, a eficácia in vivo da galanina foi avaliada em camundongos sem pêlos possuidores de melanina HRM2. Conforme medido pelo índice de clareamento da pele e coloração de melanina, a exposição repetida aos raios UVB aumentou a síntese de melanina na pele. A aplicação de galangina reduziu significativamente a melanogênese induzida pela exposição UVB. Coletivamente, nossos dados indicam quegalaninamostra forte atividade de inibição da tirosinase, o que sugere que pode ser um agente eficaz de clareamento da pele.
Palavras-chavegalanina; melanogênese; pigmentação; tirosinase
A galangina, um composto flavonóide, é encontrada em altas concentrações em Alpinia officinarum e Helichrysum) Estudos anteriores mostraram que a galangina tem várias atividades farmacológicas, protege as plantas da radiação UV, patógenos e herbívoros e exerce atividades antibacterianas e antivirais.2– 4) No entanto, também possui propriedades antioxidantes, que são atribuíveis aos seus efeitos benéficos.5) A galangina também exerce efeitos anticancerígenos através da inibição do crescimento das células cancerígenas.6,7)
A melanina é um pigmento biológico encontrado na maioria dos organismos. Na biologia da pele, a melanina é produzida pela oxidação do aminoácido tirosina. Na fisiologia normal, a melanina previne a lesão da pele através da absorção da radiação UV prejudicial.8)A melanina sintetizada nos melanócitos da pele é distribuída aos queratinócitos, onde participa principalmente na proteção contra a radiação UV prejudicial.8) No entanto, apesar de certas vantagens, o excesso de melanina também podem causar problemas estéticos e doenças de pele.9) Pigmentações anormais, como sardas, manchas senis, melasma e lentigos senis, causam sérios problemas à fisiologia normal da pele.10,11) Portanto, a modulação da melanogênese é uma importante estratégia para o tratamento da pigmentação excessiva da pele. Várias enzimas participam dos processos de melanogênese. Dentre essas várias enzimas, a tirosinase, que catalisa os processos de oxidação da L-tirosina a 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) e da L-DOPA a dopaquinona, é a mais importante.12 Esses processos mediados pela tirosinase são processos limitantes de velocidade. Sob condições anormais, a hiperativação da tirosinase foi detectada com aumento da produção total de melanina.13) Devido ao seu papel fundamental na melanogênese, a tirosinase é um alvo atraente para um agente despigmentante.14) Assim, vários inibidores de tirosinase de fontes foram desenvolvidas. Muitos inibidores de tirosinase, incluindo hidroxiquinona, ácido kójico e arbutina, foram usados anteriormente nas indústrias de medicamentos e cosméticos. Embora vários inibidores de tirosinase tenham sido desenvolvidos comercialmente, os efeitos colaterais citotóxicos tornaram-se aparentes.12) Portanto, são necessários agentes clareadores de pele eficazes e seguros.
O objetivo deste estudo foi caracterizar a galangina como um potente inibidor da tirosinase usando vários métodos experimentais. Durante a busca por inibidores de tirosinase de fontes naturais, descobrimos que a galangina reduziu significativamente a atividade da tirosinase com alta potência. Como os efeitos inibitórios da galanina na tirosinase já foram relatados, focamos nos mecanismos inibitórios e na potência em experimentos com células e animais.1) Usando vários experimentos in silico, in vitro e in vivo, nossos dados indicaram que a galangina pode ser um poderoso agente de clareamento da pele para o tratamento da pigmentação da pele.
Cistanche tubolosa benefícios para a saúde:Clareamento da pele
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
Galangina, ácido kójico, tirosinase de cogumelo, L-tirosina, hormona estimulante de melanócitos (-MSH) e outros reagentes químicos foram adquiridos à Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA).
Medição do Efeito Inibitório da Tirosinase e Mecanismo Inibitório em um Sistema Livre de Células
Para avaliar a eficácia e os mecanismos inibitórios da galangina sobre a tirosinase, a tirosinase de cogumelo foi utilizada como descrito anteriormente. Resumidamente, 1000 unidades de tirosinase de cogumelo foram dissolvidas em 20 µL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicionadas a 170 µL da mistura de ensaio, que continha 1 mM de L-tirosina, 50 mM de tampão de fosfato (pH 6,5) e 10 µL de o material de teste. A mistura foi incubada à temperatura ambiente (25 graus) durante 30 min. A quantidade de dopacromo produzida foi medida espectrofotometricamente a 492 nm (OD492) em um leitor de microplacas. O IC50 foi calculado a partir de repetições do experimento em diferentes doses de galangina. Para determinar o mecanismo inibitório da galanina, foi realizado um ensaio cinético da tirosinase. Várias concentrações de L-tirosina (1, 2, 4 e 8 mM) foram usadas para o ensaio de inibição. Após o exame, cada valor foi convertido em seu recíproco de acordo com os gráficos de Lineweaver-Burk. Os resultados mostraram o gráfico de 1/V versus 1/[S]. A intersecção de cada parcela foi utilizada para determinar o mecanismo inibitório.
Simulação de encaixe
Para a simulação de docking proteína-ligante in silico, utilizamos AutoDock4.2. A ligação bem sucedida foi obtida entre a proteína e o ligando. A estrutura tridimensional (3D) da tirosinase usada na estrutura cristalina era de Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X) e um sítio de ligação pré-definido da tirosina foi usado como bolsa de encaixe.15) As simulações de encaixe foram realizadas entre tirosinase e galangina /ácido kójico. Os compostos foram preparados para simulação de docking pelas seguintes etapas: (1) estruturas 2D foram convertidas em estruturas 3D; (2) cargas foram calculadas e (3) átomos de hidrogênio foram adicionados usando o programa ChemOffice. A previsão de possíveis resíduos de ligações de hidrogênio entre os compostos e a tirosinase e a geração de farmacoforos foram computados pelo LigandScout 3.0.
Sistema de Cultura Celular
Células de melanoma murino B16F10 obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA) foram usadas pela primeira vez para avaliar os efeitos da galanina na inibição da tirosinase. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; WELGENE Inc., Coréia, LM001-05) suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino (FBS; WELGENE Inc., S101-01) e penicilina/estreptomicina (100 UI/50 µg/mL; WELGENE Inc., LS202-02) a 37 graus em uma atmosfera umidificada contendo 5 por cento de CO2 no ar. Para avaliar os efeitos da galangina na viabilidade celular, um ensaio de viabilidade celular foi realizado usando um kit comercialmente disponível (EZ-1000, Dogen Bio, Coréia). Resumidamente, as células foram cultivadas em 96-placas de poços e tratadas com diferentes concentrações de galangina. Após o tempo indicado, a absorbância foi lida em 450 nm por meio de um leitor de microplacas. Todos os experimentos celulares foram realizados pelo menos três vezes para garantir a reprodutibilidade.
Atividade da Tirosinase
A atividade da tirosinase em células B16F10 foi examinada através da medição da taxa de oxidação da L-DOPA. As células foram plaqueadas em placas de 60 π poços, incubadas na presença ou ausência de 1 µM -MSH, e então tratadas por 24 h com 5 e 10 µM de galangina. O tratamento com ácido kójico foi usado como controle positivo. As células foram lisadas em 500 µL de tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8) contendo 25 µL 1 por cento Triton X-100 e 25 µL 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil e depois congeladas a -80 graus por 30 min. Após descongelamento e mistura, os lisados celulares foram clarificados por centrifugação a 12000×g por 30 min a 4 graus. Os sobrenadantes (80 µL) foram colocados em uma placa de 96-poço, 20 µL de L-DOPA (2 mg/mL) foram adicionados e a absorbância foi lida a 492 nm a cada 10 min por 1 h a 37 graus usando um leitor de placas.
Extrato de Cistanche: inibe a expressão da tirosinase
Conteúdo de melanina
No presente estudo, o conteúdo de melanina foi utilizado como índice de melanogênese. Resumidamente, as células B16 foram plaqueadas em uma placa de 60π e incubadas na presença ou ausência de 1 µM -MSH. As células foram então incubadas por 24 h com ou sem galangina a 5 e 10 µM. O tratamento com ácido kójico foi utilizado como controle positivo. Após duas lavagens com PBS, as amostras foram dissolvidas em 500 µL de 1 NNaOH, incubadas a 60 graus por 1 h e misturadas para solubilizar a melanina. A absorbância a 405 nm foi medida usando um leitor de microplacas.
Experimentos In Vivo
A eficácia despigmentante in vivo da galangina foi avaliada em experimentos com animais. Os estudos em animais foram desenhados pelo Aging Tissue Bank, aprovados pelo Institutional Animal Care Committee da Pusan National University, e realizados de acordo com as diretrizes para experimentação animal emitidas pela Pusan National University. Camundongos HRM2 sem pelos possuidores de melanina machos de seis semanas de idade foram obtidos de Hoshino Laboratory Animals (Yoshino, Saitama, Japão) e alojados em condições controladas (23±1 graus, 55 por cento ±5 por cento de umidade, 12-h luz /ciclo escuro) com acesso livre à água e uma dieta padrão de laboratório. Após um período de aclimatação de 1 semana, os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de seis animais. Galangina (10 µM) e ácido kójico (50 µM) foram preparados em uma solução composta de propilenoglicol e etanol (3:7). A solução dissolvida (200 µL) ou veículo foi aplicado topicamente na pele dorsal do animal uma vez por dia. Os animais foram irradiados por UVB de um CROSSLINKER (BEX-800, Ultra-Lum Inc., CA, EUA) a 50 mJ/cm2 de acordo com o cronograma experimental animal. As cores dos locais da pele foram medidas usando um espectrofotômetro CR-10 (Konica Minolta Sensing, Inc., Sakai, Osaka, Japão) no qual as cores foram descritas por seus valores L*, a* e b* de acordo com o sistema de cores da Comissão Internacional de L'Eclairage. Depois que os animais foram sacrificados, as peles foram coletadas, fixadas em paraformaldeído a 4% durante a noite em temperatura ambiente e coradas para melanina usando um kit de coloração Fontana-Masson da American Master*Tech Scientific, Inc. (Lodi, CA, EUA) em acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as peles fatiadas foram coradas com uma solução de prata amoniacal por 60 minutos a 60 graus, incubadas em 0,1% de cloreto de ouro e depois em 5% de tiossulfato de sódio.
Análise estatística
O teste t de Student foi usado para analisar as diferenças entre dois grupos e a ANOVA foi usada para analisar as diferenças intergrupos. Valores de p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" analysis="" was="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 5="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">
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RESULTADOS
Simulação de encaixe in silico de galangina em tirosinase
A galangina é um fitoquímico de ocorrência natural e contém uma porção flavonóide em sua estrutura (Fig. 1). Inicialmente, foi realizada uma simulação de docking entre tirosinase de cogumelo (estrutura terciária) e compostos (galangina, ácido kójico e tirosina). O sítio de ancoragem ao qual a galangina e o ácido kójico estavam ligados foi previamente determinado como o sítio ativo da tirosinase.15) Esta simulação foi bem sucedida e uma pontuação significativa foi alcançada. A energia de ligação entre galangina e tirosinase foi de -7,67 kcal/mol, conforme determinado por análise usando Autodock4.2. A energia de ligação entre a tirosinase e o ácido kójico (o controle positivo) foi de -4,09 kcal/mol e -5,13 kcal/mol entre a tirosinase e o substrato original, a tirosina (Tabela 1). Esses resultados mostraram que a galangina se liga à tirosinase com maior afinidade do que as demais interações. Com base nos resultados da simulação de docking, buscamos as interações entre tirosinase e compostos usando o programa LigandScout. Descobrimos que a galangina interagiu com ASN-260, VAL-283, ALA-286 e PHE-292, enquanto o ácido kójico interagiu apenas com ASN-260 e MET280 ( Fig. 2, Tabela 1). Essas interações podem, portanto, ser os principais determinantes da atividade do inibidor e ter um efeito importante na pontuação de ancoragem.
Determinação de Efeitos e Mecanismos Anti-melanógenos na Tirosinase de Cogumelo
Com base nos resultados in silico e em outros resultados relatados anteriormente, avaliamos os efeitos e mecanismos antimelanogênicos usando tirosinase de cogumelo. Quando testado com a tirosinase de cogumelo em sistema livre de células, a eficácia inibitória da galangina foi mais forte do que a do ácido kójico (Fig. 3A). Além disso, a atividade da tirosinase reduziu de forma dependente da dose da galangina (Fig. 3B). Os valores de IC50 de galangina e ácido kójico foram calculados e são apresentados na Tabela 2. O baixo valor de IC50 de galangina (3,55±0,39 µM) indicou que a potência foi significativamente maior que a de kójico ácido (48,55±1,79 µM). O mecanismo inibitório da galangina foi ainda avaliado usando gráficos recíprocos de Lineweaver-Burk. Várias concentrações de L-tirosina (1, 2, 4 e 8 mM) e galangina (0, 7,5 e 15 µM) foram usadas para o ensaio de inibição. As mudanças dependentes do tempo na absorbância foram medidas e os resultados de dupla recíproca foram plotados (Fig. 3C). Os resultados indicaram que o gráfico de 1/V versus 1/[S] produziu três linhas diferentes com diferentes inclinações, que se cruzaram no mesmo eixo vertical. À medida que a concentração do composto aumentava, o valor de Km aumentava, mas os valores de Vmax permaneceram os mesmos, sugerindo que a galangina era um inibidor competitivo da ligação à tirosinase. Esses dados concordaram com os resultados in silico de que a galangina se ligou e inibiu o sítio ativo da tirosinase.
Fig. 1. As Estruturas de Galangina, Ácido Kójico e Tirosina
Avaliando a atividade despigmentante da galangina em células de melanoma murino B16F10
Em seguida, a atividade despigmentante da galangina foi avaliada usando células de melanoma murino B16F10. Primeiro, os efeitos citotóxicos da galangina em células de melanoma murino B16F10 foram testados. Conforme mostrado na Fig. 4A, a galangina diminuiu significativamente a viabilidade celular em doses acima de 25 µM. Portanto, para evitar citotoxicidade, usamos galangina 5 µM e 10 µM nos experimentos para avaliar os efeitos antimelanógenos. As células B16F10 foram tratadas com galangina na presença de 1 µM de -MSH. A síntese total de melanina causada pelo tratamento com -MSH foi visível a olho nu e mostrou que a galangina inibiu potentemente a síntese de melanina desencadeada por -MSH (Fig. 4B). O tratamento com MSH aumentou significativamente a atividade da tirosinase e o conteúdo de melanina das células B16F10 (Figs. 4C, D). O tratamento com galangina inibiu a melanogênese celular, que foi aumentada por -MSH de maneira dose-dependente (Figs. 4C, D). Coletivamente, esses resultados indicaram que a galangina pode ser um potente agente para a supressão da melanogênese através da inibição da tirosinase.
Tabela 1. Pontuações de Ancoragem e os Principais Resíduos Interativos de Compostos
Efeitos da galangina na pigmentação da pele in vivo
Os efeitos inibitórios da galangina foram posteriormente examinados em camundongos sem pêlos possuidores de melanina que foram tratados conforme descrito pelo cronograma na Fig. 5A. As cores dos locais da pele foram medidas com precisão usando um espectrofotômetro. A exposição UVB de camundongos levou a uma diminuição no valor L*, que era representativo da pigmentação (Fig. 5B). As diminuições induzidas por UVB no valor de L* foram significativamente bloqueadas nos animais tratados com galanina em comparação com os animais de controle tratados com veículo, o que demonstrou a potente eficácia despigmentante da galanina (Fig. 5B). O valor ΔL* também indicou a potência da galangina durante os períodos experimentais (Fig. 5C). Além disso, as cores da pele detectadas a olho nu no dia 14 também indicaram a potência antimelanogênica da galangina (Fig. 5D). A coloração de Fontana–Mas son, que destaca a melanina, verificou os efeitos da galangina. As amostras de pele de animais irradiados com UVB demonstraram aumento de manchas de melanina (Fig. 5E). De acordo com os dados numéricos da espectrofotometria, os animais tratados com galanina mostraram uma diminuição nas manchas de melanina coradas em comparação com os animais controle irradiados com UVB (Fig. 5E). Coletivamente, esses dados sugeriram quegalaninafoi um agente angiogênico de tempo eficaz no modelo de melanogênese in vivo induzida por UVB.
Fig. 2. Os resultados da simulação de encaixe in Silico entre a tirosinase e os compostos candidatos
DISCUSSÃO
Foi relatado anteriormente que a galangina exerce vários efeitos biológicos, incluindo citoproteção. Embora a atividade anti-tirosinase da galangina tenha sido previamente estudada, os mecanismos e a eficácia precisa em sistemas de cultura de células não foram completamente descritos.1,16) Portanto, nosso objetivo foi explorar a potência e os mecanismos inibitórios da galangina. A eficácia inibitória da galangina foi inicialmente avaliada usando simulação de docking in silico. As simulações de docking revelaram que a ligação da galangina ao sítio ativo da tirosinase foi mais estável do que a do substrato original (tirosina) ou ácido kójico (controle positivo). A eficácia e os mecanismos inibitórios também foram confirmados usando tirosinase de cogumelo. Finalmente, a eficácia inibitória da galangina contra a melanogênese foi avaliada em células de melanoma murino B16F10 estimuladas com -MSH. Em resumo, o presente estudo identificou a galanina como um agente potente.
A simulação computacional de encaixe foi estabelecida como uma ferramenta poderosa para rastrear e avaliar novos agentes farmacológicos.17) Os resultados da simulação de encaixe fornecem não apenas os sítios de ligação, mas também a afinidade de ligação entre o composto e a enzima, o que fornece informações iniciais sem a necessidade de testes físicos. experimentos.18) Embora as previsões nem sempre sejam precisas e requeiram mais experimentos, a simulação de encaixe reduz os materiais e recursos necessários e também pode apoiar os dados experimentais biológicos. Nossa simulação computacional de encaixe indicou que a galangina pode se ligar mais fortemente à tirosinase do que a tirosina ou o ácido kójico. Além disso, o número de resíduos de interação entre galangina e tirosinase foi maior em comparação com tirosina ou ácido kójico. Os dados iniciais de docking foram ainda verificados usando um ensaio da enzima tirosinase, que mostrou que a IC50 da galangina era menor do que o ácido kójico; assim, os efeitos inibitórios da galangina sobre a tirosinase foram mais potentes do que o ácido kójico.
O mecanismo inibitório da galangina na tirosinase foi ainda examinado usando tirosinase de cogumelo. Como os dados de simulação de docking sugeriram que a galangina se liga ao mesmo sítio ativo ao qual a tirosinase se liga, foi antecipado que a galangina pode ser um inibidor competitivo da tirosinase. Os resultados experimentais revelaram que a galangina inibiu competitivamente a tirosinase de se ligar ao seu substrato original, a tirosina, o que confirmou os resultados da simulação de encaixe. Coletivamente, os resultados demonstraram a confiabilidade da simulação computacional docking e seu potencial para a triagem de inibidores.
A eficácia da galangina também foi avaliada em células de melanoma murino B16F10. A galangina mostrou efeitos citotóxicos significativos em células B16F10 quando administrada em alta dose. Isso foi consistente com relatos anteriores da atividade anticancerígena da galangina em várias linhagens de células cancerígenas.19,20) Por causa dos efeitos citotóxicos, os experimentos para verificar os efeitos anti melanogênicos das células exigiram uma seleção cuidadosa das condições. No entanto, o valor de IC50 da galangina foi muito baixo quando testado em um sistema livre de células que não apresentou efeitos citotóxicos. De fato, a eficácia da galangina na inibição da melanogênese foi aceitável em baixas doses que não exerceram citotoxicidade. Baixas doses de galangina reduziram efetivamente o conteúdo de melanina, bem como a atividade da tirosinase, no sistema de cultura de células. Juntamente com o sistema sem células,galaninamostrou ter um forte efeito inibitório sobre a tirosinase no sistema de cultura de células.
Finalmente, o efeito antimelanogênico da galangina foi avaliado usando um camundongo HRM2 sem pêlos. O modelo de camundongo HRM2 sem pêlo forneceu uma base útil para experimentos de melanogênese in vivo, pois o camundongo pode produzir melanina, especialmente sob estresses ambientais.21,22) Neste modelo de camundongo, a galangina mostrou um efeito antimelanogênico significativo na síntese de melanina induzida por UVB. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a mostrar a eficácia antimelanogenica da galangina usando um modelo de melanogênese in vivo. É importante estabelecer a eficácia in vivo porque muitos outros inibidores da melanogênese falharam em agir in vivo devido à sua incapacidade de atravessar o estrato córneo da pele. Resumindo,galaninafoi identificado como um potente agente angiogênico animal in vivo. Concluímos que o inibidor de tirosinase galangina ofereceu um novo candidato a medicamento para o tratamento de distúrbios de hiperpigmentação.
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