Atividade estrogênica de glicosídeos de Cistanche Deserticola como adjuvante de receptores de estrogênio in vitro

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Hui Song, Wen-Lan Li, Xiang-Ming Sun, Yang Hu, Jing-Xin Ding, Yu-Bin Ji, Jing-Ya Wang

INTRODUÇÃO

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" em chinês), uma erva medicinal tradicional chinesa que foi registrada pela primeira vez em ShenNongBenCaoJing, tem sido usada para tratamentos de deficiência renal, impotência, constipação senil e deficiência de sangue há milhares de anos.[1] É distribuído principalmente nas regiões desérticas do noroeste da China, como Gansu e Xinjiang.[2] A pesquisa farmacológica moderna demonstrou que C. deserticola pode promover amplas funções medicinais, como regulação hormonal, atividade imunomoduladora, antioxidante, neuroprotetora, antiinflamatória e estrogênica.[3,4] Glicosídeos de Cistanches (GCs) foram considerados como um dos principais componentes ativos com vários efeitos biológicos.[5,6]

Receptores de estrogênio (ERs) e ER são os subtipos de ERs que podem regular as funções fisiológicas.[7] Essas proteínas podem regular a transcrição de genes-alvo ligando-se a sequências reguladoras de DNA associadas no núcleo da célula. Ambos os subtipos são acentuadamente expressos nos sistemas cardiovascular e nervoso central.[8,9] O RE existe principalmente na glândula mamária, útero, ovário, osso, órgão reprodutor masculino e próstata. O RE está presente principalmente na próstata, ovário e bexiga.[10,11] Além disso, existem alguns papéis fisiológicos comuns para os dois subtipos, como no desenvolvimento e função dos ovários e na proteção do sistema cardiovascular. [12,13] Pesquisas anteriores em nosso grupo revelaram o mecanismo do tipo estrogênico dos GCs pelo método de análise metabolômica.[14] Em um estudo contínuo, analisamos o mecanismo da atividade estrogênica de GCs em linhagens celulares MCF-7 relacionadas a ERs.

MATERIAIS E MÉTODOS

Instrumentos

A incubadora ECO‑170P‑230 era da New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., leitor de microplacas Bio‑Rad 680 e o aparelho de eletroforese era da Bio‑Rad Laboratories, Inc., o microscópio CX21 era da Olympus Co., Ltd. , o sistema de imagem em gel GIS‑2019 era da Tanon Science and Technology Co., Ltd., a placa de fundo plano era da Corning Inc., a citometria de fluxo EPICS‑XL era da Beckman‑Coulter Inc. e a reação em cadeia da polimerase em tempo real StepOnePlus (PCR) foi da Thermo Fisher Scientific.

Produtos químicos e reagentes

Os GCs foram preparados em nosso laboratório conforme o método relatado anteriormente,[14] e a pureza dos GCs foi determinada em 52 por cento (acteosídeo foi usado como marcador para determinar os GCs) por espectrofotometria ultravioleta. O estradiol (E2) foi adquirido da Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Xangai, China). Soro bovino fetal (FBS) e RPMI-1640 eram da Gibco Co., Ltd., placa de fundo plano de 96 poços era da Corning Inc., e dimetilsulfóxido (DMSO) e 3-[4,5-dimetil-2-tiazolil O brometo de ]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi adquirido da Sigma-Aldrich Corporation. O reagente TRIzol, o kit de transcrição reversa (RT) e o kit TB Green™ RT-PCR foram adquiridos da TaKaRa Co., Ltd., Dalian, China. Anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb e anticorpos ‑actina foram adquiridos de Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Todos os outros produtos químicos comuns foram adquiridos de fornecedores comerciais padrão.

Preparação de amostra

Preparação de glicosídeos de solução estoque Cistanches

O extrato de GCs foi dissolvido em DMSO para fazer uma solução estoque com a concentração de 0 0,1051 g/ml e armazenado a 4 graus. O RPMI-1640 sem vermelho de fenol foi usado para diluir a solução estoque em várias concentrações antes do uso.

Preparação da solução estoque de estradiol

O extrato E2 foi dissolvido em DMSO para fazer uma solução estoque com a concentração de 0,27 mg/ml e armazenado a 4 graus. O RPMI-1640 sem vermelho de fenol foi usado para diluir a solução estoque em várias concentrações antes do uso.

Preparação de soro bovino fetal tratado com carvão dextrano

Centenas de mililitros de FBS foram misturados com 250 mg de pó de carvão ativado e 25 mg de dextrano. Após incubação por 45 minutos a 55 graus, a mistura foi centrifugada a 4 graus, 1000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi filtrado usando a membrana Millipore Express PES para obter o carvão vegetal tratado com dextrano (CDT)-FBS e armazenado a -20 graus.

Cultura de células

As linhas de células MCF-7 de câncer de mama humano foram obtidas da coleção americana de cultura tipo (ATCC). Além disso, as células foram cultivadas com meio RPMI-1640 contendo 10 por cento de FBS e 1 por cento de penicilina-estreptomicina a 37 graus sob uma atmosfera umidificada de 5 por cento de CO2. As células foram cultivadas no meio RPMI-1640 sem vermelho de fenol contendo 5 por cento de CDT-FBS 4 dias antes do ensaio MTT para que o estrogênio nas células fosse eliminado.

Análise de proliferação celular de estradiol em linhas celulares MCF-7

A proliferação celular foi medida usando o ensaio MTT para células MCF-7.[15,16] E2 foi dissolvido em meio de cultura RPMI-1640 contendo 0,1 por cento de DMSO em concentrações finais de {{27 }}.1, 1, 10, 100 e 1000 nM. As linhas celulares MCF‑7 foram cultivadas em meio RPMI‑1640 sem vermelho de fenol durante 4 dias. Após lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS) três vezes, 100 µL de meio RPMI-1640 livre de FBS foram adicionados em placas de 96 poços a 1,5 × 104 por poço e incubados a 37 graus por 24 h. Posteriormente, as células foram tratadas com várias concentrações da solução E2 por 72 h. Em seguida, 100 µL de solução de MTT (0,5 mg/mL) foram adicionados a cada poço. As células foram incubadas por 4 h. Finalmente, 150 µL de DMSO foram adicionados para dissolver os cristais de formazan. A absorbância foi medida em 570 nm por um leitor de microplacas e a taxa de proliferação (PR) foi calculada.

Análise de proliferação celular de glicosídeos de Cistanches em linhas celulares MCF-7

A proliferação celular foi medida usando o ensaio MTT para células MCF-7. Os GCs foram dissolvidos em meio de cultura RPMI-1640 contendo 0,1 por cento de DMSO em concentrações finais de 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 e 175 µg /ml. As linhagens de células MCF-7 foram cultivadas em meio RPMI-1640 sem vermelho de fenol contendo 5% de CDT-FBS por 4 dias. Após lavagem com PBS três vezes, 100 µL de meio RPMI-1640 livre de FBS foram adicionados em placas de 96 poços a 1,5 × 104 por poço e incubados a 37 graus por 24 h. Posteriormente, as células foram tratadas com várias concentrações da solução de GCs por 24, 48 e 72 h, respectivamente. Em seguida, 100 µL de solução de MTT (0,5 mg/mL) foram adicionados a cada poço. As células foram incubadas por 4 h. Finalmente, 150 µL de DMSO foram adicionados para dissolver os cristais de formazan. A absorbância foi medida em 570 nm por um leitor de microplacas e o PR foi calculado. RPMI-1640 sem vermelho de fenol e meio contendo E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) foram os grupos negativo e positivo, respectivamente.

Análise de proliferação celular de glicosídeos de Cistanches com fulvestranto em linhagens celulares MCF-7

A proliferação celular foi medida usando o ensaio MTT para células MCF-7. Os GCs foram dissolvidos em meio de cultura RPMI-1640 contendo 0,1 por cento de DMSO em concentrações finais de 1,75, 17,5 e 175 µg/ml. As linhagens de células MCF-7 foram cultivadas em meio RPMI-1640 sem vermelho de fenol contendo 5% de CDT-FBS por 4 dias. Após lavagem com PBS três vezes, 100 µL de meio RPMI-1640 livre de FBS foram adicionados em placas de 96 poços a 1,5 × 104 por poço e incubados a 37 graus por 24 h. Posteriormente, as células foram tratadas com várias concentrações da solução de GCs e incubadas com fulvestrant (6,06 × 10−5 µg/ml) por 48 h. Em seguida, 100 µL de solução de MTT (0,5 mg/mL) foram adicionados a cada poço. As células foram incubadas por 4 h. Finalmente, 150 µL de DMSO foram adicionados para dissolver os cristais de formazan. A absorbância foi medida em 570 nm por um leitor de microplacas e o PR foi calculado. RPMI-1640 sem vermelho de fenol e meio contendo E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) foram os grupos negativo e positivo, respectivamente.

Ensaio do ciclo celular

Os GCs foram dissolvidos em meio de cultura RPMI-1640 contendo 0,1 por cento de DMSO em concentrações finais de 1,75, 17,5 e 175 µg/ml. As linhas de células MCF‑7 foram cultivadas em meio RPMI‑1640 sem vermelho de fenol contendo 5% de CDT‑FBS por 4 dias. Após a lavagem com PBS três vezes, 1 mL de meio RPMI-1640 livre de FBS foi adicionado em placas de 6 poços a 2,5 × 105 por poço e incubado a 37 graus por 24 h. Posteriormente, as células foram tratadas com várias concentrações da solução de GCs e incubadas com fulvestrant (6,06 × 10−5 µg/ml) por 48 h. Posteriormente, as células foram coletadas e lavadas com PBS três vezes, centrifugadas a 4 graus, 1000 rpm por 10 min, e fixadas com etanol a 70 por cento a -20 graus, durante a noite. Após a lavagem com PBS duas vezes, as células foram coradas com solução de PI (50 mg/mL) contendo 1 mg/mL de RNase A e 0,1 por cento de Triton X-100 por 30 min no escuro a 4 graus. O ciclo celular foi detectado usando citometria de fluxo e o índice de proliferação (PI) foi calculado como se segue. RPMI-1640 sem vermelho de fenol e meio contendo E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) foram os grupos negativo e positivo, respectivamente. PI=(S mais G2 M)/(G0 /G1 mais S mais G2 M) × 100 por cento

Isolamento de RNA e análise quantitativa em tempo real da reação em cadeia da polimerase

Para medir o nível de mRNA, foi utilizado um ensaio RT-quantitative PCR (qPCR). O RNA celular total foi extraído com reagente TRIzol. Para qPCR, o RNA foi reverso transcrito para cDNA de 4 µg de RNA total usando um kit RT. As análises de RT‑PCR foram realizadas usando o Kit TB Green™ RT‑PCR. Todos os protocolos foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. O par de primers usado para amplificação do ER foi 5'‑GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG‑3' (frente) e 5'‑TGGCTGGACACATATAGTCGTT‑3' (reverso); o par de primers usado para amplificação de ER foi 5'‑AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG‑3' (frente) e 5'‑CCTGGGTCGCTGTGACCAGA‑3' (reverso). As condições de PCR para ER e ER foram 94 graus por 3 minutos seguidos por 37 e 40 ciclos, respectivamente, de 94 graus por 30 segundos, 58 graus por 2 minutos e 72 graus por 2 minutos. O par de primers usado para amplificação de GAPDH foi 5'‑GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT‑3' (frente) e 5'‑GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG‑3' (reverso). As condições de PCR para GAPDH foram de 94 graus por 3 minutos seguidos por 30 ciclos de 94 graus por 30 segundos, 58 graus por 2 minutos e 72 graus por 2 minutos. Toda vez que o experimento de RT‑qPCR foi repetido mais de duas vezes. Para isso, o GAPDH foi utilizado como controle interno. A expressão gênica relativa de ER/ER dos transfectantes em relação às células controle foi calculada: 2−(∆∆Ct).

Western blotting

A expressão de proteínas ER e ER foi detectada por análise de Western blot como o método relatado com pequenas modificações. Resumidamente, as células MCF-7 foram cultivadas em placas de 6 poços a 2,5 × 105 células por poço e tratadas com GCs na concentração final de 1,75, 17,5 e 175 µg/ml por 48 h, respectivamente. Após a incubação, os extratos de células inteiras foram preparados usando tampão RIPA contendo 1 mM de PMSF. As proteínas nos extratos de células inteiras foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio a 12% e depois transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno. A membrana foi bloqueada com 5 por cento (p/v) de leite desnatado dissolvido em tampão TBST e incubado com anticorpos primários e secundários por sua vez. Anticorpos ligados foram observados.

Análise estatística

Os resultados foram expressos como médias e desvios padrão, e a significância estatística foi realizada usando o teste t de Student com o software SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was="" considered="" statistically="">

RESULTADOS

Após 24 h de tratamento com E2, a proliferação de células MCF-7 foi obviamente aumentada [Figura 1a]. 10 nM de solução E2 poderia estimular o crescimento das células obviamente (123,89 por cento). No entanto, com o aumento da concentração de E2, a capacidade de proliferação celular enfraqueceu. Assim, 10 nM foi a concentração óptima de E2 nesta experiência.

O grupo GCs nas concentrações de 1,75, 17,5 e 175 µg/mg pode aumentar a proliferação das linhagens celulares MCF-7 de maneira dependente do tempo e da dosagem e exibiu uma diferença significativa com o grupo negativo [Figura 1b]. Comparado a um grupo negativo, o grupo E2 apresentou proliferação óbvia (120,06 por cento).

O grupo de medicação combinada (CMG) (fulvestrant com E2 ou GCs) no meio CDT‑FBS foi incubado com células MCF‑4. Após 72 h de incubação, CMG pode levar à inclinação de PR em comparação com o grupo de medicação individual (IMG) (P < 0="" 0,01)="" [figura="">

A análise de citometria de fluxo mostrou que os GCs podem aumentar ligeiramente o valor de PI, sugerindo que os GCs podem avançar células da fase G{0}}/G1 para as fases S e G2/M [Figura 2 e Tabela 1] e promover o DNA celular síntese. O resultado indicando que o mecanismo de GCs em MCF-7 foi semelhante ao de E2. Em CMG (fulvestrant com GCs), o valor de PI do PI da célula foi ligeiramente inferior ao do IMG (P <>

A análise de RT-PCR indicou que as expressões de ER e mRNA de ER foram aumentadas em comparação com o grupo controle (P < 0,01) de maneira dose-dependente após serem tratadas por diferentes concentrações de GCs por 48 h [Figura 3a eb].

Resultado de Western blot indicando que após o tratamento com várias concentrações de GCs por 48 h, os teores de ER e proteínas ER em MCF-7 aumentam com os GCs aumentados de maneira dose-dependente [Figura 3c-e]

CONCLUSÃO

Nesta pesquisa, o efeito dos GCs na proliferação e no ciclo celular de MCF-7 foi testado pelo método de MTT e citometria de fluxo, respectivamente. Os GCs podem aumentar a proliferação de células MCF-7 na concentração de 1,75, 17,5 e 175 µg/ml após incubação por 72 h. No entanto, o aumento tende a diminuir quando CCs e fulvestranto foram usados ​​juntos. Os GCs podem aumentar o valor de PI das células MCF-7, diminuir a célula da fase G1 e aumentar a célula das fases S e G2.

Fulvestrant é um antagonista específico do ER, que bloqueia a localização nuclear do ER ao prejudicar a dimerização do receptor e o transporte nuclear dependente de energia.[17] Nesta pesquisa, uma conclusão confirmou que o fulvestranto pode enfraquecer a proliferação de GCs em células MCF-7, e pode afetar a transformação do ciclo celular. Assim, este estudo indicou a atividade estrogênica dos GCs, e também, o RE é o alvo dos GCs. No experimento de RT-PCR e western blot, as expressões de mRNA e proteína de ER e ER nas células MCF-7 aumentaram com o aumento da concentração de GCs. Assim, os GCs podem desempenhar um papel na atividade estrogênica de acordo com o mRNA regulado positivamente e proteínas de RE e RE.