Aprimorando a proteômica de cima para baixo do tecido cerebral com FAIMS Parte 1

Resumo

As investigações proteômicas das doenças de Alzheimer e Parkinson forneceram informações valiosas sobre doenças neurodegenerativas. Até agora, estas investigações têm sido em grande parte restritas a abordagens de baixo para cima, dificultando o grau em que se pode caracterizar o estado “intacto” de uma proteína.

A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que tem efeitos irreversíveis na memória e nas habilidades cognitivas de uma pessoa. Embora as pessoas não possam curar completamente a doença, através de tratamento e prevenção cuidadosos, a progressão da doença pode ser retardada tanto quanto possível e a saúde física e mental do paciente pode ser mantida.

A memória é um dos aspectos mais óbvios afetados pelos pacientes de Alzheimer. Muitas vezes, eles podem esquecer informações importantes, como nome, nome de entes queridos, datas importantes e assim por diante. Além disso, algum vocabulário avançado de autoaprendizagem, como conceitos abstratos e sinônimos, também pode ser esquecido. No entanto, com algum treinamento cognitivo e tratamento, os pacientes com Alzheimer ainda conseguem manter a memória em alguns aspectos.

Embora a doença de Alzheimer possa trazer efeitos negativos, devemos encará-la de forma positiva. Em primeiro lugar, ao aumentar a sensibilização e a compreensão da doença, podemos preveni-la e tratá-la melhor. Em segundo lugar, os cuidadores e familiares dos pacientes com Alzheimer também podem aprender como comunicar e interagir com eles de forma eficaz para ajudar os pacientes a manter a autodignidade e a viver felizes tanto quanto possível.

Em geral, embora a doença de Alzheimer possa causar efeitos irreversíveis na memória e nas capacidades cognitivas, devemos manter uma atitude optimista e tentar abrandar a progressão da doença através de tratamento e medidas preventivas. Ao mesmo tempo, devemos também prestar mais ajuda e apoio àqueles que cuidam de pacientes com doença de Alzheimer e criar conjuntamente uma comunidade mais calorosa e interactiva. Percebe-se que precisamos melhorar a memória. Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. O efeito do Cistanche vem dos vários ingredientes ativos que contém, incluindo ácido tânico, polissacarídeos, glicosídeos flavonóides, etc.

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A proteômica de cima para baixo (TDP) supera essa limitação; no entanto, é normalmente limitado à observação apenas das proteoformas mais abundantes de tamanho relativamente pequeno.

Portanto, técnicas de fracionamento são comumente usadas para reduzir a complexidade da amostra. Aqui, investigamos o fracionamento em fase gasosa através de espectrometria de mobilidade iônica de forma de onda assimétrica de alto campo (FAIMS) dentro do TDP.

Utilizando uma amostra de alta complexidade derivada do tecido cerebral da doença de Alzheimer (DA), descrevemos como a adição de FAIMS ao TDP pode melhorar de forma robusta a profundidade da cobertura do proteoma.

Por exemplo, a implementação de FAIMS com tensão de compensação externa (CV) variando em -50, -40 e -30 CV poderia mais que dobrar o número médio de proteoformas não redundantes, genes e cobertura de sequência de proteoma em comparação com sem FAIMS.

Descobrimos também que o FAIMS pode influenciar a transmissão de proteoformas e seus envelopes de carga com base no seu tamanho. É importante ressaltar que o FAIMS permitiu a identificação de proteoformas beta-amiloide (A) intactas, incluindo a variante A 1–42 propensa à agregação, que está fortemente ligada à DA.

Os dados brutos e os arquivos associados foram depositados no ProteomeXchange Consortium por meio do repositório de dados MassIVE com identificador de conjunto de dados PXD023607.

INTRODUÇÃO

Nas últimas duas décadas, a incidência de doenças neurodegenerativas mais do que duplicou em todo o mundo, sendo a doença de Alzheimer (DA) a forma mais prevalente.1 Duas espécies de proteínas, os peptídeos beta-amilóide (A ) e a proteína fosforilada associada aos microtúbulos tau(tau), 2–5 estão fortemente associados à DA.

Portanto, a proteomecaracterização detalhada da DA tem sido de particular importância.6,7 A espectrometria de massa tem desempenhado um papel central nessas investigações,8 predominantemente por abordagens bottom-up.9–16

No entanto, a digestão da protease necessária para análises bottom-up impede a captura do estado completo de uma proteína, que pode variar devido a alelos genéticos, splicing alternativo, processamento proteolítico e modificações pós-traducionais (referidas como "proteoformas").17– 20

Como as abordagens proteômicas descendentes (TDP) analisam proteínas em estado intacto, a probabilidade de capturar proteoformas associadas a certas patologias é maior e permite uma conexão mais forte e direta entre genótipo e fenótipo.20–22

Por exemplo, o TDP é particularmente adequado para capturar fragmentos proteolíticos endógenos derivados de proteínas como a tau, que foram associadas à patologia de Alzheimer.23–26 Várias aplicações anteriores do TDP mostraram-se muito promissoras na revelação da heterogeneidade regional do proteoma cerebral e alterações neuronais em resposta a vários estímulos. 0,27–30

No entanto, o TDP de amostras complexas normalmente requer técnicas de fracionamento off-line para reduzir a complexidade da amostra, pois o proteoma humano abrange várias ordens de magnitude em tamanho e abundância, e as proteínas geralmente não são bem resolvidas com cromatografia líquida de alta eficiência (LC) de fase reversa.31

Esse fracionamento off-line pode ser realizado com eletroforese de aprisionamento de fração líquida eluída em gel, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica ou purificação por afinidade, para citar alguns.22,32–35

Infelizmente, o fracionamento offline normalmente reduz o rendimento e o rendimento, exigindo um manuseio prolongado da amostra.36 A separação por mobilidade iônica em fase gasosa é uma alternativa atraente de fracionamento que pode ser introduzida entre as dimensões LC e MS sem exigir etapas adicionais de manuseio da amostra.

A espectrometria de mobilidade iônica de forma de onda assimétrica de alto campo (FAIMS) é particularmente adequada para esta tarefa com a recente introdução do dispositivo FAIMS Pro, cujo design modular permite a fácil incorporação da mobilidade iônica em vários instrumentos Orbitrap atuais.37

FAIMS, também conhecida como espectrometria de mobilidade diferencial, separa íons em um gás transportador com base em combinações de fatores como tamanho, carga ou formato através da introdução de uma forma de onda assimétrica com campos elétricos altos e baixos.38 Para evitar a colisão dos íons com o eletrodo, um desvio no caminho do íon é introduzido através da aplicação de uma tensão de compensação DC (CV),39 permitindo a transmissão seletiva desse íon.38

A aplicação do FAIMS à análise de proteínas intactas tem sido amplamente restrita à separação de confórmeros de proteínas individuais ou pequenas combinações de proteínas;40–45

no entanto, o FAIMS foi recentemente aplicado a análises de proteínas intactas e nativas usando análise de superfície de extração líquida.46–50 Aqui, aplicamos a análise FAIMS-TDP a uma amostra de tecido total do córtex frontal medial (MFC) de um paciente com Alzheimer.

A varredura em uma faixa de CV de -50 a -20 CV com revisão externa nos permitiu determinar como a modulação do FAIMS CV influencia as características dos íons transmitidos através da unidade cilíndrica FAIMS, e como essa relação pode ser explorada para atingir proteoformas com base no tamanho.

FAIMS-TDP mais que dobrou as identificações de proteoformas em um único CV em comparação com sem FAIMS e permitiu um interrogatório mais profundo de proteoformas relevantes para doenças neurodegenerativas, incluindo -, - e -sinucleínas, PARK7, isoformas de splice tau e várias proteoformas A intactas.

Em conjunto, este trabalho descreve como maiores identificações de proteoformas e proteomecobertura podem ser alcançadas de forma reprodutível através do fracionamento em fase gasosa com FAIMS em TDP.

MÉTODOS

Preparação de Amostras

A amostra do MFC foi recebida do Rush University Alzheimer's Disease Center. Os participantes eram idosos da clínica que se inscreveram com queixas de memória e/ordemência de 1992 a 2005.

Eles foram avaliados na Rush Memory Clinic para possível demência e concordaram com a doação de cérebros como parte do núcleo clínico do Rush Alzheimer'sDisease Core Center. O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Rush University Medical Center.

Após a morte, o parente mais próximo deu consentimento para uma autópsia. A categoria diagnóstica cognitiva geral do paciente foi demência de Alzheimer sem outras causas de comprometimento cognitivo,51 enquanto o intervalo post-mortem foi de 230 minutos.

Todas as etapas de manuseio da amostra foram realizadas com precauções BSL{{0}}. 33 mg de tecido MFC armazenado a -80 graus foram transferidos para tubos LoBind Eppendorf de 1,5 mL (Eppendorf, Cat # 022431081) com a adição de 0,5 mL de tampão de homogeneização consistindo de ureia 8 M, bicarbonato de amônio 10 mM (ABC) e 10 mM tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) em pH7,5.

A homogeneização foi obtida por meio de interrupção física, aplicando um pilão de pelotas motorizado portátil por 30 s (BioVortexer com SpiralPestle; Biospec 1083 e 1017), antes da adição de 0,5 mL de tampão de homogeneização em temperatura ambiente.

A amostra foi então incubada a 37 graus por 60 min a 1200 rpm usando um ThermoMixer para permitir a extração e desnaturação de proteínas celulares. A peletização do material insolúvel em ureia foi realizada com centrifugação a 18,{5}}g por 20 min a 22 graus, e o sobrenadante resultante foi então adicionado a 3 mL de tampão de lavagem (WB; ureia 8 M, ABC 10 mM, pH 7 .5) dentro de um filtro de peso molecular de corte (MWCO) de 4 mL e 100 kDa para remover espécies de MW grandes.

Após 1 h de centrifugação a 22 graus e 5000g, o volume do retentado foi de 200 μL e o volume do filtrado foi de 3,8 mL. 3,8 mL do filtrado foram transferidos para um filtro MWCO de 3 kDa para remover contaminantes de moléculas pequenas e peptídeos de baixo PM.

O filtro MWCO de 3 kDa foi centrifugado a 22 graus e 7300g por 1 h, dando um volume de retentado de 200 μL. 200 μL de retentado do filtro MWCO de 100 kDa foram lavados mais uma vez diluindo-o para 4 mL com WB e filtrando-o novamente através do mesmo filtro.

Este fluxo foi adicionado ao mesmo filtro MWCO de 3 kDa mencionado acima e concentrado mais uma vez.

Os 200 μL finais de retentado da lavagem do filtro MWCO de 3 kDa foram transferidos para um tubo LoBindEppendorf de 1,5 mL. Para acidificar a amostra, foram adicionados 10 μL de ácido fórmico (AF) a 10%, resultando em concentração de FA de 0,5% na amostra final.

A amostra foi centrifugada a 18,{1}}g por 15 min para remover o material precipitado antes de medir a concentração de proteína usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA).

Os padrões de albumina sérica bovina foram preparados em 8 M de ureia, 10 mM de ABC e 00,5% de FA para contabilizar quaisquer contribuições potenciais de tampão para o ensaio de BCA. A concentração de proteína pelo ensaio BCA foi determinada em 1,1 mg/mL, correspondendo ao rendimento final de 00,22 mg de proteína total recuperada na amostra de ∼200 μL. diluído para 0,5 mg/mL com WB contendo 0,5% de FA e armazenado a -80 graus até a análise por LC-MS.

Devemos observar que experimentos iniciais (dados não publicados) usando um coquetel tradicional inibidor de protease/fosfatase dentro de nosso tampão de homogeneização levaram a resultados enganosos de BCAassay e LC-MS devido à retenção de vários componentes do coquetel pelo filtro 3KMWCO.

Além disso, muitos dos inibidores de fosfatase e protease comumente utilizados são quimicamente incompatíveis com agentes redutores como o TCEP. Considerando estas incompatibilidades, e que seria de esperar que as condições fortemente desnaturantes de ureia 8 M com TCEP 10 mM inactivassem a maioria das proteases, acreditámos que a degradação proteolítica ainda seria minimizada sob estas condições.

Análises LC-MS/MS e configurações FAIMS

As amostras foram analisadas usando um sistema Waters NanoACQUITY UPLC com fases móveis consistindo de {{0}},2% FA em H2O (fase móvel A) e 0,2% FA em ACN (fase móvel B).

Tanto a pré-coluna de captura (100 μm de diâmetro interno, 5 cm de comprimento) quanto a coluna analítica (75 μm de diâmetro interno, 50 cm de comprimento) foram pastas embaladas com o material de empacotamento C2 (5 e 3 μm para armadilha/analítica, respectivamente, 300 Å, Tecnologia de Métodos de Separação) . As amostras foram carregadas em um loop de 5 μL, correspondendo a 2,5 μg da quantidade de material carregado, e injetadas na coluna de captura com um fluxo isocrático de 5% b a 3 μL/min durante 20 min.

A separação foi realizada com gradiente b de 5 a 50% durante 180 min a 300 nL/min. Para análise de proteínas MS/MS, o sistema NanoACQUITY foi acoplado a um espectrômetro de massas Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid equipado com a interface FAIMS Pro.

Os parâmetros da fonte incluem uma tensão de eletropulverização de 2,2 kV, uma temperatura capilar de transferência de 275 graus e uma amplitude de radiofrequência do funil de íons de 60%. O FAIMS foi definido para resolução padrão sem fluxo de gás de arraste suplementar controlado pelo usuário e uma tensão de dispersão de -5 kV (equivalente a um campo de dispersão de -33,3 kV/cm),50 enquanto o CV variou dependendo do experimento (referido como "reforço externo ").

O Fusion Lumos foi configurado para o modo de aplicação "proteína intacta", que reduz a pressão de célula N2 de dissociação C-trap de alta energia (HCD) para 2 mTorr, e os dados foram coletados como um perfil completo. Os dados MS1 e MS2 foram adquiridos em uma resolução de 120k e 60k, microvarreduras de 3 e 2, em uma faixa de 500–2,000 m/z e 400–2,000 m/z, e com Alvos AGC de 5 × 106 e 5 × 105, respectivamente.

MS1 e MS2 também foram adquiridos com tempo máximo de injeção de 400 ms. As configurações dependentes de dados incluíram uma seleção dos 6 íons mais intensos, exclusão de íons abaixo do estado de carga5+, a inclusão de estados de carga indeterminados e exclusão dinâmica após uma observação por 30 s.

Os íons selecionados para MS2 foram isolados em uma janela de ± 1,5 m/z e fragmentados através de dissociação induzida por colisão (CID) com uma energia de colisão de 35%. Utilizamos CID em vez de HCD devido à menor dependência da energia de colisão normalizada para obter espectros interpretáveis ​​de fragmentação de proteínas, priorizando assim a amplitude de nossas observações de proteoformas em relação à cobertura de sequência.52

Os conjuntos de dados para cada CV FAIMS foram coletados em triplicata. Todos os arquivos brutos foram depositados no repositório de dados MassIVE e podem ser acessados ​​​​através do acesso MSV000086696 ou com PXD023607 no ProteomeXchange.

For more information:1950477648nn@gmail.com