Aprimoramento da Biossíntese de Glicosídeos Feniletanoides em Culturas de Células de Cistanche Deserticola por Estresse Osmótico

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Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

AbstratoO efeito do estresse osmótico no crescimento celular e na biossíntese de glicosídeos feniletanoides (PeGs) foi investigado em culturas de suspensão celular deCistanche deserticolaYC Ma, uma planta medicinal do deserto cultivada na região oeste da China. Várias concentrações iniciais de sacarose afetaram significativamente o crescimento celular e a biossíntese de PeGs nas culturas em suspensão, e o maior peso seco e acúmulo de PeGs atingiu 15,9 gl–1-DW e 20,7 mg g–1-DW, respectivamente, na fase osmótica inicial estresse de 300 mOsm kg–1 onde a concentração de sacarose foi de 175,3 mM. A análise estequiométrica com diferentes combinações de sacarose e açúcar não metabólico (manitol) ou agentes osmóticos não açucarados (PEG e NaCl) revelou que o próprio estresse osmótico foi um fator importante para aumentar a biossíntese de PeGs em culturas em suspensão de células deCistanche deserticola. Os teores máximos de PeGs de 26,9 e 23,8 mg g–1-DW foram obtidos após 21 dias nas combinações de 87,6 mM de sacarose com 164,7 mM de manitol (303 mOsm kg–1) ou 20 mM de PEG, respectivamente, que foi maior do que a de culturas de células de C. deserticola cultivadas sob uma concentração inicial de sacarose de 175,3 mM após 30 dias. O acúmulo de PeGs estimulados nas culturas em suspensão de células foi correlacionado com o aumento da atividade da fenilalanina amônio liase (PAL) induzida pelo estresse osmótico.

Palavras-chave Cistanche deserticola, Planta medicinal do deserto, Glicosídeos feniletânicos, Estresse osmótico, Fenilalanina amônia-liase

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Introdução

Cistanche deserticolaYC Ma, uma preciosa erva chinesa, parasita as raízes de Haloxylon ammodendrun e cresce em áreas desérticas do oeste da China. Os glicosídeos feniletanoides (PeGs), os principais componentes bioativos isolados de C. deserticola, têm atividades marcantes na eliminação de radicais livres, aumento da imunidade, melhora da função sexual, etc. (Zong et al. 1996; Lu 1998; Wang et al. 2001). Devido à exploração e utilização descontroladas deCistanche deserticola, o recurso natural deCistanche deserticola estava à beira da exaustão. Diante desses problemas, a produção de PeGs por meio de culturas em suspensão de células de C. deserticola tem sido considerada uma alternativa promissora para solucionar a escassez deCistanche deserticolamateriais vegetais (Lu e Mei 2003; Ouyang et al. 2003; Cheng et al. 2005a).

O estresse osmótico é um fator importante que afeta o crescimento, o desenvolvimento, a morfogênese e a formação de metabólitos secundários das plantas. A produção aumentada de metabólitos secundários de culturas de tecidos in vitro sob estresse osmótico ótimo foi relatada em algumas espécies de plantas medicinais (Kim et al. 2001; Wang et al. 1999; Wu et al. 2005). A sacarose é um agente de estresse osmótico usual usado nesses casos, e também serve como fonte vital de carbono e energia. Portanto, é muito difícil separar o efeito do estresse osmótico e o papel nutricional dos açúcares como fontes de carbono. Um aumento do estresse osmótico inicial com manitol não metabólico, sorbitol e PEG também melhorou o acúmulo de paclitaxel em culturas de células de Taxus Chinensis, o acúmulo de saponina e polissacarídeo em culturas de células Panax notoginseng e o acúmulo de eleuterosídeos em culturas embriogênicas de Eleutherococcus sessiliflorus (Zhang et al. 1995; Kim et al. 2001; Shohael et al. 2006). Seus resultados indicaram que os efeitos da concentração de carboidratos e estresse osmótico foram diferentes de acordo com a espécie vegetal e metabólitos secundários.

O objetivo do presente estudo está focado nos efeitos osmóticos da sacarose, manitol, PEG e NaCl no crescimento celular e na biossíntese de PeGs emCistanche deserticolaculturas em suspensão celular. A atividade de PAL nas culturas em suspensão foi investigada sob diferentes combinações de agentes osmóticos iniciais, e o possível mecanismo de acúmulo de PeGs aprimorado pelo aumento do estresse osmótico é discutido.

Materiais e métodos

Materiais vegetais e indução de calos

Sementes deCistanche deserticolaYC Ma foram coletados em áreas desérticas na província de Xinjiang, na China, e armazenados em 4C antes do uso. A identidade botânica foi confirmada por comparação com os padrões de referência do Instituto de Botânica, Academia Chinesa de Ciências, PR China. As sementes foram esterilizadas superficialmente por imersão em etanol a 70 por cento por 30 segundos, depois imersas em solução aquosa de hipoclorito de sódio a 5,4 por cento a 20 por cento em água por 20 minutos, seguido de três lavagens com água destilada estéril. Os calos foram induzidos a partir de sementes esterilizadas na superfície deCistanche deserticolaem meio MS (Murashige e Skoog 1962) suplementado com 1,0 mg l–1 de ácido naftalenoacético (NAA), 2,0 mg l–1 6-benzil adenina ({{7} }BA), 0,25 mg l–1 2, 4-ácido diclorofenoxiacético (2, 4-D), 6 gl–1 agar (PhytoTechnology LaboratoriesTM, ID do produto: A181) e 30 gl–1 de sacarose por 60 dias em uma cabine de crescimento no escuro a 25°C. As culturas de calos induzidas dos explantes de sementes foram subsequentemente subcultivadas no meio sólido acima em um intervalo de 30 dias (Cheng et al. 2005a).

Estabelecimento e manutenção de culturas de suspensão de células

As culturas de calo em suspensão (3,0 g de peso fresco) que foram filtradas através de uma tela de malha de 1,000 lm e retidas em uma tela de malha de 200 lm foram subcultivadas em um Erlenmeyer de 500-ml frasco contendo 100 ml do meio líquido acima em um agitador rotativo a 110 rpm a 25°C no escuro em um intervalo de subcultura de 18 dias. O pH do meio foi ajustado para 5,8 com NaOH 1 M ou HCl 1 M antes da autoclavagem. As culturas de calo em suspensão subcultivadas após dez vezes foram usadas como inóculo para a seguinte cultura experimental em frasco. Todos os experimentos com frascos foram realizados em frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de meio líquido com 30 gl–1 de sacarose e inoculados com 1,5 g de peso fresco de 18-culturas em suspensão de células de um dia. Esses frascos Erlenmeyer foram incubados em um agitador rotativo (110 rpm) a 25°C no escuro.

Experiência de estresse osmótico

Para investigar o efeito da concentração inicial de sacarose sobrecrescimento celular e acúmulo de PeGs,Cistanche deserticolaculturas em suspensão foram cultivadas em meio MS com 87,6,175,3 e 262,9 mM de sacarose. Para condições de estresse osmótico,Cistanche deserticolaculturas em suspensão foram incubadas em MSmeio contendo 87,6 mM de sacarose combinada com164,7 mM de manitol. Outros agentes osmóticos (PEG 4,000 eNaCl) foram adicionados no equivalente da osmolaridade desacarose 87,6 mM. As concentrações equivalentes osmóticasde agentes osmóticos foram determinados experimentalmente como PEG4,000 de 20 mM e NaCl de 50 mM, respectivamente. Frascos triplicados foram usados ​​em todos os experimentos e todos os valoresforam as médias dos frascos triplicados ± SD.

Análise

Cistanche deserticolacélulas cultivadas sob vários estresses osmóticos foram observadas pelo microscópio de luz Nikon AFX-DX (Nikon, Japão) sob ampliações de 400·. A osmolaridade do meio de cultura foi medida com um osmômetro de pressão de vapor (Fiske One-Ten Osmometer, MA, EUA). Para a determinação do peso fresco (PF), oCistanche deserticolaas células foram pressionadas suavemente em papel de filtro para remover o excesso de água e pesadas. Posteriormente, as células foram secas em estufa a 60C por 24 h e o peso seco (PD) foi registrado. A concentração de açúcar residual foi determinada usando fenol e ácido sulfúrico concentrado, usando glicose como padrão (Dubois et al. 1956).

Os PeGs foram extraídos das células secas com metanol por 15 min a 60C em banho-maria ultrassônico (KQ2200, Shanghai Cany Precision Instrument Co., Ltd, China) com frequência de 40 kHz e potência de 100 W. O filtrado foi concentrado e o resíduo dissolvido em água destilada e então passado por uma coluna de resina macro reticular (AB-8, produto químico da Universidade de Nankai, Tianjin, China). O eluato de metanol foi coletado e o teor total de PeGs foi ensaiado a 333 nm usando echinacoside como padrão (Du e Liu 1993a; Du et al. 1993b).

A viabilidade celular foi estimada pela redução de 2, 3, 5- cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) (Steponkus e Lanphear 1967). O índice de viabilidade é definido como a absorbância medida por grama de tecido fresco. A determinação da atividade PAL foi baseada no método de Koukol e Conn (1961). Uma unidade da atividade PAL (U) é definida como a quantidade de variação de absorbância de 0.01.

Resultados e discussão

Efeito da concentração inicial de sacarose no crescimento celular e biossíntese de PeGs em culturas de suspensão celular deCistanche deserticola.A resposta deCistanche deserticolaculturas de suspensão de células para concentração inicial de sacarose entre 87,6 e 262,9 mM foi testada. Como mostrado na Fig. 1, as células cresceram e acumularam PeGs rapidamente em uma baixa concentração inicial de sacarose de 87,6 mm, e o crescimento celular e a acumulação de PeGs foram suprimidos obviamente em uma alta concentração inicial de sacarose de 262,9 mM. A razão de peso fresco para peso seco diminuiu quando a concentração inicial de sacarose aumentou de 87,6 para 262,9 mM (dados não mostrados). O peso seco máximo de 15,9 gl–1 e o teor de PeGs de 20,7 mg g–1-DW foram obtidos no dia 30 com uma concentração inicial de sacarose de 175,3 mM, com osmolaridade de cerca de 300 mOsm kg–1. Sob observação microscópica, as paredes celulares foram separadas de seu citoplasma no maior estresse osmótico de 388 mOsm kg-1, onde uma concentração inicial de sacarose foi de 262,9 mM (Fig. 2), e o maior estresse osmótico pode perturbar o metabolismo das células e resultar em severa supressão do crescimento e declínio da biossíntese de PeGs. Um fenômeno semelhante também foi observado em culturas em suspensão de culturas de células em suspensão de T. Chinensis, e a concentração ideal de sacarose para a produção de paclitaxel foi de 175,3 mM (Kim et al. 2001). No entanto, uma concentração inicial de sacarose de 204,5 mM foi benéfica para o crescimento de culturas de células de E. sessiliflorus. Uma maior concentração de sacarose de 262,9 mM melhorou a biossíntese de eleuterosídeos, fenol e flavonóides nas culturas de Eleutherococcus (Shohael et al. 2006). Fica claro que a concentração inicial de sacarose é importante para o crescimento e acúmulo de metabólitos secundários das culturas de células vegetais e seu efeito está relacionado a uma linhagem celular específica.

Efeito de diferentes agentes osmóticos no crescimento celular e biossíntese de PeGs em culturas de suspensão celular de C. deserticola

Compreender o papel osmótico da sacarose metabólica e outros substratos químicos não metabólicos na biossíntese de PeGs em culturas de suspensão celular deCistanche deserticola, uma série de experimentos foram realizados usando sacarose combinada com os agentes osmóticos não metabólicos (manitol, PEG e NaCl). Nesses experimentos, 164,7 mM de manitol, 20 mM de PEG e 50 mM de NaCl foram adicionados ao meio contendo 87,6 mM de sacarose e fizeram a osmolaridade inicial em torno de 300 mOsm kg–1, que era uma condição osmótica equivalente comparável ao meio com 175,3 mM sacarose.

Conforme mostrado na Fig. 3a, b, a adição de manitol (agente osmótico de açúcar não metabólico) e PEG (agente osmótico não permeável) inibiu ligeiramente a taxa de crescimento celular, mas aumentou significativamente a biossíntese de PeGs emCistanche deserticolaculturas em suspensão celular. Os teores máximos de PeGs de 26,9 e 23,8 mg g–1-DW foram obtidos, respectivamente, no dia 21, quando as células foram cultivadas nas combinações de 87,6 mM de sacarose com 164,7 mM de manitol (303 mOsm kg–1) ou 20 mM PEG (299 mOsm kg–1). Os valores de PeGs foram superiores aos deCistanche deserticolaculturas de células cultivadas em meio líquido MS com uma concentração inicial de sacarose de 175,3 mM no dia 30. O açúcar foi consumido gradualmente ao longo do tempoCistanche deserticolacultura de células e, em seguida, o estresse osmótico induzido pelo açúcar caiu de acordo (Fig. 3c, d). O estresse osmótico do meio líquido com uma concentração inicial de sacarose de 175,3 mM caiu de 280 para 110 mOsm kg–1 quando os PeGs nas culturas de células começaram a se acumular no dia 9 e atingiram seu máximo no dia 30 (dados não mostrados). Os agentes osmóticos não metabólicos (manitol e PEG) não foram consumidos no decorrer da cultura celular, permitindo que o estresse osmótico do meio líquido fosse mantido entre 200 e 280 mOsm kg–1, pressão osmótica favorável à biossíntese de PeGs. Esses resultados mostraram que o próprio estresse osmótico desempenhou um papel importante no aprimoramento da biossíntese de PeGs noCistanche deserticolaculturas de células.

A adição de NaCl foi relatada para melhorar a biossíntese de alcalóides indólicos e saponinas, respectivamente, em culturas de células de Catharanthus roseus e Panax ginseng (Smith et al. 1987; Wu et al. 2005), mas o tratamento com NaCl suprimiu o crescimento celular de T. Chinensis enquanto não mostra diferença na biossíntese de palitaxel (Kim et al. 2001). Portanto, uma investigação detalhada é necessária para cada caso. A adição de um equivalente osmótico de NaCl 50 mM suprimiu o crescimento celular e a biossíntese de PeGs. Este resultado pode ser devido à natureza permeável do NaCl que não é benéfica para as culturas de células desta espécie de planta do deserto que pode tolerar muito bem o estresse hídrico.

Fig. 3 Efeito das combinações de sacarose e outros agentes osmóticos não metabólicos no crescimento celular (a), acúmulo de PeGs (b), consumo de açúcar (c) e mudança de estresse osmótico (d) no curso da célula de C. deserticola cultura. Os valores são médias de frascos triplicados ± SD

Efeito de diferentes agentes osmóticos na viabilidade celular e atividade PAL em culturas de suspensão celular de Cistanche deserticola

Em nossos estudos anteriores (Cheng et al. 2005b, 2006), a adição de elicitores estimulou dramaticamente a biossíntese de PeGs emCistanche deserticolaculturas de células, e a estimulação foi correlacionada com o aumento da atividade de PAL, a primeira enzima chave na biossíntese de PeGs (Hahlbrock e Grisebach 1979). Conforme mostrado na Fig. 4, a adição de manitol não metabólico 164,7 mM ou PEG 20 mM em meio líquido MS contendo sacarose 87,6 mM diminuiu ligeiramente a viabilidade celular, mas aumentou significativamente a atividade PAL que foi maior do que a induzida por uma concentração inicial de sacarose de 175,3 mM. O aumento do acúmulo de PeGs emCistanche deserticolaculturas em suspensão celular foi relacionada ao aumento da atividade da PAL estimulada pelo próprio estresse osmótico. Uma concentração inicial de sacarose de 175,3 mM em meio líquido MS causou uma diminuição na viabilidade celular em 15 dias e inibiu a atividade de PAL em 21 dias. Após um período de consumo de açúcar pela crescenteCistanche deserticolaculturas celulares, tanto a viabilidade celular quanto a atividade PAL das células cultivadas aumentaram e atingiram seus máximos no dia 24 e no dia 30, respectivamente. A atividade aumentada de PAL por estresse osmótico também foi observada para melhorar a biossíntese de saponina em culturas de células de P. ginseng e acúmulo de alcalóides em células cultivadas de C. roseus (Godoy-Hernandez et al. 2000; Wu et al. 2005). No entanto, a adição de NaCl permeável em meio líquido MS contendo 87,6 mM de sacarose diminuiu a viabilidade celular e inibiu a atividade de PAL durante todo o período de cultivo. Como resultado, o crescimento celular e a biossíntese de PeGs foram obviamente suprimidos.

Fig. 4 Variação da viabilidade celular (a) e atividade PAL (b) em culturas de células de C. deserticola sob diferentes estresses osmóticos no curso deCistanche deserticolacultura de células. Os valores são médias de frascos triplicados ± SD

Cistanche deserticolaé uma espécie de deserto e a investigação de uma espécie de deserto em culturas de células in vitro apresentou novos desafios e oportunidades para entender a fisiologia das plantas e as adaptações ecológicas. Neste estudo, desenvolvemos um sistema com potencial para estudar uma via de biossíntese de transdução de sinal mediada por estresse osmótico, e o sistema forneceu a base para a produção em larga escala de PeGs usando oCistanche deserticolaculturas de células através de uma nova estratégia regulada por estresse osmótico.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio financeiro do Programa de Pesquisa em Inovação da Academia Chinesa de Ciências.

De: 'Aprimoramento da biossíntese de glicosídeos feniletanoides em culturas de células de Cistanche deserticola por estresse osmótico' por Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

---Plant Cell Rep (2008) 27:357–362 DOI 10,1007/s00299-007-0443-3

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