ELOVL2 Promove a Progressão do Câncer ao Inibir a Apoptose Celular no Carcinoma de Células Renais
Mar 20, 2022
Abstrato. RenalO carcinoma celular (CCR) é uma malignidade geniturinária agressiva que tem sido associada a um prognóstico ruim, particularmente em pacientes com metástase, sendo seus principais subtipos CCR de células claras (ccRCC), CCP papilar (pRCC) e CCR cromófobo (chRCC). a presença de gotículas lipídicas intracelulares (LDs) é considerada uma marca registrada do ccRCC. A importância do metabolismo lipídico alterado no ccRCC tem sido amplamente reconhecida. O alongamento de ácidos graxos de cadeia muito longa (ELOVL) catalisa o alongamento de ácidos graxos (AGs), modulando a composição lipídica e é necessário para funções corporais normais. No entanto, o envolvimento das elongases no CCR permanece incerto. No presente estudo, a expressão de ELOVL2 em ccRCC foi examinada; em particular, níveis elevados de sete ELOVLisozymes foram observados em tumores primários. É importante notar que níveis elevados de expressão de ELOVL2 foram observados em ccRCC, bem como em pRCC e chRCC. Além disso, um nível mais alto de ELOVL2 foi significativamente associado ao aumento da incidência de mau prognóstico de pacientes com ccRCC e pRCC. O knockdown mediado por CRISPR/Cas9-de ELOVL2 resultou na supressão do alongamento de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa e aumento da produção de LD emrenalcélulas cancerosas. Além disso, a ablação de ELOVL2 resultou na supressão da proliferação celular através da indução de apoptose in vitro e na atenuação do crescimento tumoral in vivo. No geral, o presente estudo fornece uma nova visão sobre os mecanismos de proliferação tumoral envolvendo o metabolismo lipídico e sugere que o ELOVL2 pode ser um novo alvo atraente para a terapia do CCR.
Palavras-chave:carcinoma de células renais, gotícula lipídica, proliferação celular, rim, renal
Introdução
O carcinoma de células renais (CCR) é uma malignidade comumente encontrada e letal, representando cerca de 2% de todos os casos de câncer e mortes relacionadas em todo o mundo(1), sendo seus principais subtipos CCR de células claras (ccRCC), CCP papilar (pRCC) e cromófobo RCC (RCC). De todos os subtipos de RCC, o ccRCC é a manifestação histológica mais comum e sua patogênese é caracterizada pela ativação constitutiva de fatores induzíveis por hipóxia (HIFs) devido à perda de função no gene supressor tumoral de von Hippel-Lindau (VHL). (1). Foram desenvolvidas várias terapias direcionadas contra o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou o alvo mamífero da sinalização de rapamicina (mTOR) e inibidores de checkpoint imunológico para doença metastática. No entanto, a progressão da doença é inevitável na maioria dos pacientes (1,2).
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Uma característica marcante do ccRCC é a abundância de gotículas lipídicas intracelulares (LDs), consistindo em um núcleo lipídico neutro contendo triglicerídeos (TGs) e ésteres de colesterol (CEs) circundados por uma monocamada de fosfolipídios(3).LDs são organelas dinâmicas responsáveis pela absorção de lipídios e armazenamento e são usados para manter a homeostase, facilitar a produção de energia e proteger contra vários tipos de estresse ou para sustentar a biogênese da membrana durante o rápido crescimento de células tumorais em vários tipos de câncer (4). progressão (5,6).
Os ácidos graxos (FAs) que compreendem o principal componente dos lipídios têm sido relatados como substratos para armazenamento de energia, síntese de membranas e produção de moléculas sinalizadoras. O alongamento e a dessaturação são etapas centrais da síntese de Novo de AG de cadeia longa (LC-FAs), sendo o comprimento e o grau de insaturação determinantes da função dos AG e do destino metabólico (7). A estearoil-CoA dessaturase 1 (SCD1), um membro da família das acil graxas dessaturase, foi extensivamente estudada em ccRCC (6.8.9). Foi demonstrado que o aumento da expressão de SCD1 suporta a viabilidade, enquanto um inibidor de pequena molécula de SCD1 (A939572) demonstrou suprimir a proliferação celular em ccRCC(8.9). Além disso. Yang et al (10) demonstraram que a proteína 1 de ligação ao elemento regulador de esteróis (SREBP1) promoveu a dessaturação lipídica através da dessaturase 1 do ácido FA (FADSI) antes da ativação da sinalização de NF-xB para a promoção da proliferação celular em ccRCC. No entanto, quaisquer papéis potenciais de elongases em RCC permanecem obscuros.
Foi relatado que, em mamíferos, as reações de condensação de AG iniciais e de controle de velocidade são catalisadas por uma família de enzimas elongase referida como alongamento de AG de cadeia muito longa (ELOVL). Até o momento, foram identificados sete membros do ELOVL, que podem ser geralmente divididos naqueles específicos para AG saturados e monoinsaturados (ELOVL1, ELOVL3, ELOVL6 e ELOVL7) ou para AG poliinsaturados (PUFAs; ELOVL2, ELOVL4 e ELOVL5). Lucarelli et al (9) revelaram um acúmulo significativo de PUFAs e um aumento da expressão de ELOVL2 e ELOVL5 em ccRCC. Vale ressaltar que foi demonstrado que o ácido docosahexaenóico (DHA) sistêmico é produzido endogenamente e controla a lipogênese de novo, ao mesmo tempo em que regula o armazenamento de lipídios de maneira independente do fator de transcrição 1 de ligação ao elemento regulador de esterol (SREBPF1), devido à ablação de ELOVL2 em ratos(11). Além disso, a superexpressão de ELOVL2 demonstrou promover o acúmulo de LD com uma maior captação de FA tanto na linhagem de células pré-adipócitos 3T3-LI quanto nas células F442A(12). Estudos in vitro anteriores, com DHA, administrado exogenamente para células cancerígenas. demonstraram que o DHA exerce efeitos antitumorigênicos, anti-inflamatórios e pró-apoptóticos em células cancerígenas(13-15). No entanto, qualquer papel potencial do ELOVL2 na progressão do ccRCC através da modulação do metabolismo lipídico permanece amplamente inexplorado.
No presente estudo, os papéis de ELOVL2inccRCCprogressão foram explorados realizando o perfil transcricional de ccRCC primário e normalrimamostras, revelando que ELOVL2 está superexpresso em ccRCC e está superrepresentado entre as isoenzimas ELOVL. É importante notar que ELOVL2 também foi superexpresso em ccRCC, bem como em pRCC e RCC, sendo significativamente associado a um mau prognóstico de pacientes com CCR CCR pRCC. Além disso, foi demonstrado que a inibição de ELOVL2 afeta o metabolismo lipídico e suprime a proliferação celular através da promoção da apoptose, pelo menos em parte através da ruptura da homeostase do retículo endoplasmático (ER) emcâncer renalcélulas. Os resultados do presente estudo sugeriram que o ELOVL2 pode ser um potencial novo alvo terapêutico para o tratamento do CCR.
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Materiais e métodos
Linhagens celulares e culturas. As linhas celulares 293T (RCB2202) e OS‑RC‑2 (RCB0735) foram adquiridas do RIKEN BioResource Center, enquanto as linhas celulares 786‑O e ACHN foram adquiridas da ATCC; As células SK‑RC‑52 foram um presente gentil do DrJ.G.Old (Memorial Sloan Kettering Cancer Center). linha celular RPTEC, que é derivada de células epiteliais do ser humanorenaltúbulo proximal, foi adquirido da Lonza Group, Ltd. (CC-2553). As células ACHN, 786‑O, SK‑RC‑52 e OS‑RC‑2 foram cultivadas em meio RPMI‑1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37°C com 5% de atmosfera de CO2 umidificada. As células 293T foram cultivadas em meio Eagle modificado de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37°C com 5% de atmosfera de CO2 umidificada. As células RPTEC foram cultivadas emrenalmeio de crescimento epitelial (REGM™) Bulletkit™ (CC‑3190; Lonza Bioscience) a 37°C com uma atmosfera de CO2 umidificada a 5%.
Pacientes e amostras de ccRCC. Tecidos CCR e normais adjacentesrimtecidos de 46 pacientes que receberam nefrectomias radicais ou parciais foram obtidos no Hospital da Universidade de Tsukuba, entre 2006 e 2015, de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Tsukuba (aprovação nº H28-104). Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito antes da cirurgia. Os estágios do tumor foram atribuídos de acordo com o estadiamento TNM da Union for International Cancer Control (16). Os graus patológicos foram classificados de acordo com o sistema de classificação de Fuhrman de quatro níveis (17). Todas as características do paciente estão resumidas na Tabela SI Extração de RNA e síntese de cDNA. O RNA total foi extraído dos tecidos congelados erenalcélulas cancerosas usando o reagente TRIzol® (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Após a purificação do RNA, o RNA foi então transcrito de forma reversa em cDNA usando um kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (nº de catálogo 4368814; Thermo Fisher Scientific, Inc.), de acordo com as instruções do fabricante.
Reação em cadeia da polimerase quantitativa por transcrição reversa (RT-qPCR). Os níveis de expressão gênica foram quantificados usando uma máquina 7500 Fast Real-Time PCR com Fast SYBR-Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.). As condições de ciclagem foram as seguintes: retenção inicial a 95°C por 20 segundos, 40 ciclos a 95°C por 3 segundos e 60°C por 30 segundos, seguido por uma curva de fusão variando de 95°C por 15 segundos a 60° C por 1 minuto. Hipoxantina fosforibosiltransferase 1 (HPRT1) foi usada como controle interno. Todas as sequências de primers estão listadas na Tabela SII. Para avaliar os genes relacionados com a apoptose, os níveis de expressão relativa dos genes pró‑apoptóticos, proteína X associada a Bcl‑2 (BAX), antagonista/assassino homólogo de Bcl‑2 (BAK), forbol‑12‑miristato‑13‑ A proteína 1 induzida por acetato (PMAIP1/NOXA) e o modulador de apoptose de p53 (BBC3/PUMA) e do gene antiapoptótico BCL2 e o gene da proteína de diferenciação celular da leucemia mielóide induzida (MCL1) foram analisados. Os níveis de expressão gênica relativa foram quantificados usando o método 2‑ΔΔCq (18).
Análise de Western blot. A análise de Western blot foi realizada como descrito anteriormente (19). As células foram lisadas em tampão de lise (Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, SDS 1 por cento e inibidor de protease) e sonicadas em gelo. Os lisados foram centrifugados a 1,000 xg por 20 min a 4˚C e os sobrenadantes foram coletados como amostras. A quantificação de proteínas das amostras foi realizada usando o Quick Start Bradford Protein Ensaio (cat. n.º 5000202JA; Bio‑Rad Laboratories, Inc.). As amostras foram submetidas a 10 por cento de SDS-PAGE e os produtos separados foram posteriormente transferidos para membranas de PVDF.
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As membranas foram bloqueadas com agente bloqueador ECL Prime (cat. n.º RPN418V; Cytiva) durante 60 min à temperatura ambiente. As membranas foram então incubadas durante a noite a 4˚C com os seguintes anticorpos: Enzima 1 que requer anti-serina/treonina-proteína quinase/endoribonuclease inositol (anti-IRE1 ; 1:200; #3294, Cell Signaling Technology, Inc.), IRE1 anti‑fosforilado (anti‑p‑IRE1 ; 1:200; NB100‑2323, Novus Biologicals, LCC), proteína homóloga anti‑C/EBP (anti‑CHOP; 1:200; MA1‑250, Thermo Fisher Scientific, Inc .). Anti-coelho ou anti-ratinho imunoglobulina G ligado a HRP, Ab inteiro de burro (cat. n.º NA934V, NA931VS; GE Healthcare; Cytiva) foram usados a 1:10,000 como anticorpos secundários. Os Western blots foram visualizados com ImmunoStar® Zeta (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) usando um imager Fujifilm LAS-4000 e LAS400IR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation). ‑actina foi utilizada como controlo interno (1:10.000, cat. n.º A5316; Sigma‑Aldrich).
Análise bioinformática da expressão gênica. Os dados clínicos e de sequenciamento de RNA (RNA-seq) de tumores primários coletados de pacientes com CCR no banco de dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) foram baixados do Portal de Dados Genomic Data Commons (GDC) (20). Um total de 1.005 (880 doentes e 125 controles) amostras foram examinadas, incluindo 530 doentes e 71 amostras de controle para orim renalcoorte de carcinoma de células claras (KIRC; ccRCC), 286 doentes e 31 amostras saudáveis para o colo do úterorim renalcoorte de carcinoma de células papilares (KIRP; pRCC), e 64 doentes e 23 amostras saudáveis para a coorte de cromófobo renal (KICH; chRCC). A expressão do gene ELOVL2 nas amostras de câncer geniturinário foi analisada usando o banco de dados de expressão gênica de tecidos normais e tumorais (GENT2). Os dados de expressão gênica foram baixados do repositório público de expressão gênica omnibus (GEO) da plataforma U133 Plus 2 (GPL570) (http://gent2.appex.kr/gent2/) (21).
Plasmídeos e transdução lentiviral. Pequenos RNAs hairpin (shRNAs) para ELOVL2 caracterizados em estudos anteriores (22,23) foram subclonados no vetor lentiviral pLKO.1 (plasmídeo #8453; Addgene, Inc.). As sequências de oligonucleotídeos usadas na construção do vetor shRNA estão listadas na Tabela SIII. Os lentivírus foram gerados em células 293T por cotransfecção de quatro plasmídeos em trans, incluindo o vetor lentiviral (pLKO‑shControl ou pLKO‑shELOVL2), pMDLg/pRRE (plasmídeo nº 12251; Addgene, Inc.), pRSV‑Rev (plasmídeo nº 12253 ; Addgene, Inc.) e pMD2.G (plasmídeo #12259; Addgene, Inc.) usando o reagente de transfecção Lipofectamine 2000® (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Às 48 h após a transfecção, os sobrenadantes contendo vírus foram coletados e filtrados através de um filtro de 0,45 µm para infecção. Para transduções virais, os lentivírus pLKO‑shControl ou pLKO‑shELOVL2 foram incubados com as células 786‑O, ACHN e SK‑RC‑52 durante a noite a 37°C em uma incubadora de cultura de células umidificada. As células foram selecionadas na presença de puromicina em 24 h pós-infecção. Para estabilizar os subclones, as células foram cultivadas em meio com puromicina por 1 mês a 37°C em uma incubadora de cultura de células umidificada e os pools sobreviventes foram utilizados para análises de expressão e proliferação.
Para experimentos de superexpressão, as células OSRC-2 foram transfectadas com vetor vazio pCMV6 (plasmídeo #PS100001; Origene Technologies, Inc.) ou pCMV6-ELOVL2 (plasmídeo #RC209232;Origene Technologies, Inc.) a 37°C em uma cultura de células umidificada incubadora, utilizando o reagente de transfecção Lipofectamine 3000® (Thermo Fisher Scientific, Inc.), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram utilizadas para os ensaios indicados às 48 h pós-transfecção. Criação e clonagem de CRISPR/Cas9. O plasmídeo pX330‑U6‑Chimeric_BB‑CBh‑hSpCas9 (pX330) foi um presente de Feng Zhang (Addgene, Inc.; plasmídeo #42230) (24). As sequências de guia única (sg) de CRISPR para ELOVL2 foram direcionadas especificamente para o exon 2 (sgELOVL2 #1) e exon 3 (sgELOVL2 #2 e #3) de ELOVL2 usando a CRISPR Design Tool (GE Healthcare Dharmacon, Inc.;‑discovery.com/gene‑editing/crispr‑cas9/crispr‑design‑tool/), antes de clonar no pX330. A sequência de guia CRISPR para controle de guia única (sgControl) foi projetada anteriormente (25). As sequências de oligonucleotídeos dos RNAs de guia único (sgRNAs) estão listadas na Tabela SIII
As células ACHN foram então semeadas em placas de 6 poços (1,4x105 células/poço) e cotransfectadas 2 h depois com 2 µg de sgRNAs expressos em pX330 e 0,2 µg de vetor pCI-neo (Promega Corporation; cat. n.º E1841) a 37˚C numa incubadora de cultura de células humidificada, utilizando FuGENE HD (Promega Corporation; cat. n.º E2312). Às 24 h após a transfecção, 400 µg/ml de G418 foram aplicados durante 7 a 10 dias e as células foram deixadas a recuperar durante 2 ou 3 dias. Quando as células estavam se aproximando da confluência, elas foram novamente semeadas esparsamente em placas de 10 cm. Após 2 ou 3 semanas, as colônias discerníveis foram isoladas usando discos de clonagem (MilliporeSigma; cat. no. Z374431-100EA). Clones individuais foram expandidos e avaliados quanto ao status de nocaute por sequenciamento de Sanger para a área alvo.
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Ensaios de proliferação celular. A proliferação celular foi avaliada usando o ensaio MTT com um Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços e 10 µl de WST-8 foram adicionados após 72 h.OD460 foi medido após uma incubação de 1 h a 37˚C. Xenoenxerto subcutâneo. Camundongos fêmeas BALB/c nude (nu/nu) (n=12; 6-8 semanas de idade) foram adquiridos de Charles River Laboratories, Inc.. Os camundongos foram alojados sob condições específicas livres de patógenos, sob um 12- h ciclo claro/escuro, com acesso ad libitum a comida e água. Para ensaios de xenoenxerto subcutâneo, 1x107 células suspensas em 100 µl de PBS foram injetadas subcutaneamente no flanco direito usando uma agulha 24G e os volumes tumorais foram medidos uma vez por semana. O volume do tumor foi calculado pela fórmula: mm{17}} comprimento x largura x altura x 0,52 (26). Após 90 dias, todos os animais foram sacrificados e os tumores do xenoenxerto foram excisados. Os animais foram anestesiados com 2% de isoflurano antes de serem sacrificados por deslocamento cervical
Espécimes fixados em formalina e incluídos em parafina (FFPE) dos tumores xenoenxertos foram cortados em seções de 4 µm de espessura, antes da desparafinização e reidratação. Para a recuperação do antígeno, os cortes foram pré-tratados por micro-ondas por 21 minutos em tampão de ácido cítrico. Após o procedimento de recuperação do antígeno, a atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 3% de H2O2 por 25 min e as lâminas foram incubadas com anticorpo Ki‑67 (1:200; Dako; Agilent Technologies, Inc.; M7240) a 4˚C durante a noite. A reação imuno-histoquímica foi visualizada usando o anticorpo secundário Histofine Simple Stain MAX PO® (Nichirei Biosciences, Inc,; cat. nº 424151) usando diaminobenzidina como cromógeno. Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê de Experimentos com Animais da Universidade de Tsukuba e todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Regulamento de Experimentos com Animais da Universidade de Tsukuba (aprovação nº 20-370). Ensaios de apoptose. A apoptose foi avaliada usando o Caspase-Glo® 3/7 Assay System (Promega Corporation; cat. nº G8090), kit de coloração Anexina-V-FLUOS (Roche Diagnostics; cat. nº 11858777001) e JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Kit de ensaio (Cayman Chemical Company; cat. n.º 10009172), de acordo com as instruções do fabricante.
Coloração de LDs. As células foram semeadas em lamelas de vidro em placas de 60mm e cultivadas com meio contendo ácido oleico (200 µM) a 37˚C durante a noite em uma incubadora de CO 2 a 5 por cento. O meio foi então aspirado e as células foram lavadas duas vezes com PBS antes da fixação com formaldeído a 4 por cento (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) por 5 min à temperatura ambiente. As células foram então lavadas duas vezes com PBS e incubadas com 0,5 µM Lipi‑Green (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) por 30 min no escuro a 37°C. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS e as lamínulas foram montadas em lâminas de vidro usando VECTASHIELD® Antifade Mounting Medium com DAPI (Vector Laboratories, Inc.; cat. n.º H-1200). As imagens das células coradas foram adquiridas com um microscópio de fluorescência BZ‑X710 (Keyence Corporation). As células vivas foram incubadas com 0,5 µM de Lipi-Green em Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) por 30 min antes de lavar duas vezes em HBSS, ressuspensas em 1 mM EDTA/PBS (pH 8,0) com 0,5 por cento de BSA e passadas por um filtro de células . As células foram analisadas em um citômetro de fluxo Gallios (Beckman‑Coulter, Inc.) e os dados foram analisados usando o software FlowJo v10 (FlowJo LLC).
Coloração do rastreador ER. As células ACHN (ACHN/sgControl, ACHN/sgELOVL2‑1 e ACHN/sgELOVL2‑2) foram semeadas em lamelas de vidro em placas de 6{{20}}-mm e cultivadas a 37˚C por 48 h em uma incubadora de CO 2 a 5 por cento. O meio foi então aspirado e as células foram lavadas duas vezes com HBSS antes da fixação com formaldeído a 4 por cento (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) por 5 min à temperatura ambiente. As células foram então lavadas duas vezes com HBSS e incubadas com 500 nM ER Tracker Red (Thermo Fisher Scientific, Inc.; cat. nº E34250) por 2 h no escuro a 37°C. Posteriormente, as células foram lavadas duas vezes com PBS e as lamínulas foram montadas em lâminas de vidro. As imagens das células coradas foram adquiridas com um microscópio de fluorescência BZ‑X710 (Keyence Corporation). As células vivas foram incubadas com 500 nM ER Tracker em HBSS por 30 min antes de lavar duas vezes em HBSS, ressuspensas em 1 mM EDTA/PBS (pH 8,0) com 0,5 por cento de BSA e passadas por um filtro de células. As células foram analisadas em um citômetro de fluxo Gallios e os dados foram analisados usando o software FlowJo v10.
Cromatografia gasosa‑espectrometria de massa (GC‑MS). A extração de lipídios totais de pellets de células foi realizada conforme descrito anteriormente (27). Foi realizada a hidrólise e derivatização dos extratos a ésteres metílicos de FA (FAMEs). Para os padrões internos de FAs conjugados, C20:4 (ω‑6), C20:5 (ω‑3), C22:5 (ω‑6), C22:5 (ω‑3) e C22 :6 (ω-3) FAMEs foram adquiridos da MilliporeSigma ou da Cayman Chemical Company. A análise de GC-MS foi realizada usando um GCMS-TQ8040 (Shimadzu Corporation) com uma coluna de GC capilar Omegawax® (MilliporeSigma; cat. n.º 24136). O gradiente de temperatura foi inicialmente aumentado de 70 a 150°C a uma taxa de 20°C por minuto e de 150 a 280°C a uma taxa de 8°C por minuto antes de diminuir de 280 a 200°C a uma taxa de 15 ˚C por min. A injeção de amostra foi realizada no modo splitless com 1,0 µl de amostra injetada. Para análise MS, a fonte de íons e a temperatura da interface foram ajustadas para 200˚ e 270˚C, respectivamente. Os dados foram adquiridos no modo de varredura completa (30-600 m/z) sob 70 eV de tensão de ionização. Os FAMEs foram identificados de acordo com o tempo de retenção e a correspondência do espectro de ionização eletrônica-MS (EI-MS) com os padrões FAME de referência. A quantidade relativa de FAMEs foi calculada comparando a área média do pico por massa de amostra. Cada amostra foi medida independentemente três vezes.
Análise estatística. Os dados são expressos como a média ± SD. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software JMP 10 (SAS Institute, Inc.), GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.) ou pacote R (versão 4.0.2; RStudio, Inc.). A significância das diferenças entre os dois grupos foi avaliada por meio do teste t de Student não pareado ou teste de Mann-Whitney. A significância das diferenças entre os três ou mais grupos foi avaliada usando ANOVA one-way com comparações post hoc usando o teste de Dunnett ou teste de Kruskal-Wallis seguido de um teste post hoc de Dunn com correção de Bonferroni. As curvas de sobrevida foram construídas pelo método de Kaplan‑Meier e a diferença entre as curvas foi avaliada pelo teste log‑rank. Os pacientes foram divididos em dois grupos, um grupo de baixa expressão ou de alta expressão, usando o ponto de corte dos valores de expressão mediana. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Resultados
ELOVL2 é altamente superexpresso em RCC. A abundância de sete isoenzimas ELOVL em tecidos normais e tumorais correspondentes foi examinada pela primeira vez na presente coorte, revelando que os níveis de expressão de ELOVL1, ELOVL2, ELOVL5 e ELOVL7 estavam elevados em tecidos ccRCC (Fig. 1A). Para validar esses resultados, a expressão do gene da isoenzima ELOVL em tecidos normais e tumorais correspondentes foi examinada usando o banco de dados TCGA (coorte KIRC). Foi confirmado que a expressão de mRNA de ELOVL2 foi mais elevada e significativamente elevada em tecidos ccRCC (Fig. 1B; P<0.0001). subsequently,="" elovl2="" mrna="" expression="" was="" investigated="" further="" among="" three="" major="" histological="" subtypes="" of="" rcc="" using="" tcga="" database="" (kirc,="" kirp="" and="" kich="" cohorts).="" this="" revealed="" that="" elovl2="" was="" overexpressed="" in="" the="" prcc="" and="" chrcc="" tissues;="" however,="" its="" expression="" in="" ccrcc="" tissues="" was="" the="" highest="" among="" the="" histological="" subtypes="" (fig.="" 1c).="" moreover,="" the="" elovl2="">
os níveis de expressão foram acentuadamente elevados nas linhagens celulares ACHN, 786-O e SK-RC-52, embora os níveis de expressão de mRNA na linhagem celular OS-RC-2 tenham sido mais baixos em comparação com os da linhagem celular RPTEC (Fig. 1D) . Posteriormente, a alteração associada ao câncer da expressão do gene ELOVL2 em vários tipos de câncer foi investigada usando o banco de dados GENT2 (Fig. 1E). Comparado com tecidos normais, a expressão de ELOVL2 foi significativamente maior emrim, câncer de próstata, pulmão e cólon, enquanto a expressão de ELOVL2 foi semelhante em câncer de bexiga ou mama. Esses resultados sugeriram que os papéis das isoenzimas ELOVL diferem de acordo com o tipo de câncer e que a superexpressão de ELOVL2 pode estar associada à carcinogênese ou progressão da doença do RCC, particularmente do ccRCC.
A superexpressão de ELOVL2 está associada à progressão do CCR. A associação entre a expressão gênica de ELOVL2 e os estágios tumor-nódulo-metástase (TNM) na coorte KIRC foi examinada, a fim de esclarecer o significado clínico de ELOVL2 no ccRCC. A expressão de ELOVL2 foi maior na doença localmente avançada e metastática, embora sua expressão não estivesse associada ao status de metástase linfonodal (Fig. 2A‑C). Coletivamente, a expressão de ELOVL2 foi aumentada de acordo com o estágio clínico (Fig. 2D). Posteriormente, foi avaliada a associação entre a expressão de ELOVL2 e o prognóstico de pacientes com CCR, a fim de elucidar o impacto clínico do CCRcc. De acordo com a análise de Kaplan‑Meier, foi revelado que a alta expressão de ELOVL2 foi significativamente associada a um mau prognóstico na presente coorte (P=0.0015, Fig. 2E). Para validar esses resultados, a associação entre a expressão de ELOVL2 e o prognóstico de pacientes com ccRCC foi examinada mais a fundo na coorte KIRC e foi demonstrado que, da mesma forma, a alta expressão de ELOVL2 foi significativamente associada a um prognóstico ruim (P<0,01, fig.="" 2f).="" moreover,="" a="" high="" expression="" of="" elovl2="" was="" significantly="" associated="" with="" a="" poor="" prognosis="" of="" patients="" with="" prcc=""><0.0001, fig.="" 2g).="" however,="" this="" was="" not="" observed="" in="" patients="" with="" chrcc="" (fig.="" 2h).="" in="" total,="" the="" aforementioned="" results="" indicated="" that="" elovl2="" may="" mediate="" ccrcc="" and="" prcc="" disease="" progression,="" at="" least="">
ELOVL2 promove a proliferação de células cancerosas renais. Para avaliar a função de ELOVL2 na proliferação de células RCC, foi realizado o knockdown de shRNA de ELOVL2 em células 786‑O, ACHN e SK‑RC‑52. Os efeitos de cada shRNA foram avaliados usando RT‑qPCR e uma diminuição significativa na expressão de ELOVL2 foi confirmada (Fig. 3A). Ensaios de MTT foram então realizados para examinar os efeitos do knockdown de ELOVL2 na proliferação celular. Observou-se que o knockdown de ELOVL2 inibiu a proliferação de todas as células em comparação com as células transfectadas com shRNA controle (Fig. 3B).
Em contraste, a superexpressão de ELOVL2 foi induzida nas células OS-RC‑2, uma linhagem celular com menor expressão basal de ELOVL2. A eficácia da transfecção foi avaliada usando RT‑qPCR e a expressão significativamente aumentada de ELOVL2 foi confirmada (Fig. 3C). Ensaios de MTT revelaram que a proliferação de células com superexpressão de ELOVL2 foi significativamente promovida, em comparação com o grupo controle (Fig. 3D), indicando que ELOVL2 pode ser um promotor da proliferação derenalcélulas cancerosas.
A ablação com ELOVL2 suprime o crescimento tumoral in vivo, a síntese de PUFAs e a produção de LDs emrenalcélulas cancerosas. Para esclarecer melhor os papéis do ELOVL2 na progressão do CCR, foi estabelecida uma linhagem de células ACHN ELOVL2-knockout, usando um sistema CRISPR/Cas9 (sgELOVL2-1 e sgELOVL2-2) (Fig. S1). In vitro, a proliferação celular foi significativamente diminuída pela ablação de ELVOVL2 nas células ACHN (Fig. S1). Mais importante, a ablação mediada por CRISPR/Cas9 de ELOVL2 suprimiu o crescimento tumoral quando as células foram implantadas subcutaneamente em camundongos (Fig. 4A). Os volumes máximos dos tumores de xenoenxerto subcutâneo no ACHN/controle e ACHN/sgELOVL2‑2 no dia do sacrifício foram 241 e 109 mm3, respectivamente. Vale ressaltar que todos os tumores de xenoenxerto no grupo ACHN/sgELOVL2-1 regrediram espontaneamente 14 dias após o transplante e não foram detectados no momento da extirpação. O índice Ki-67 também foi examinado nos tumores de xenoenxerto transfectados com controle ou sgELOVL2 e observou-se que as células ACHN/sgELOVL2-2 exibiram um índice Ki-67 significativamente menor do que as células ACHN/controle (Fig. 4B e C) . Estes resultados apoiaram ainda mais a possibilidade de que ELOVL2 aumenta o crescimento tumoral in vivo. Como ELOVL2 está localizado no cromossomo 6p24.2 e codifica uma proteína transmembrana do retículo endoplasmático que controla o alongamento de PUFAs C20–C24 (7), os níveis totais de FA foram então avaliados nas células ACHN/sgControl e ACHN/sgELOVL2 usando análise GC-MS (Fig. S2). A alteração dos níveis de LC‑PUFA é demonstrada na Fig. 4D. ELOVL2 é uma enzima essencial na produção endógena de ácido docosahexaenóico (DHA, C22:6 n‑3) (28,29) e, como esperado, os níveis de DHA foram significativamente diminuídos pela ablação de ELOVL2 norenalcélulas cancerosas. Além disso, o
as quantidades de outras espécies de LC‑PUFAs, incluindo ácido araquidônico (AA, C20:4 n‑6), ácido eicosapentaenóico (EPA) e ácido docosapentaenóico (DPA), também diminuíram significativamente. Por outro lado, a produção de DPA não foi consistentemente alterada nas células ACHN/sgELOVL2. A quantidade de DPA nas células ACHN foi muito baixa e não foi detectada em várias amostras (Fig. S2). Uma vez que estudos anteriores demonstraram que ELOVL2 promove o acúmulo de LDs através da produção de DHA (11,12), o armazenamento de LDs foi ainda avaliado usando coloração de lipídios neutros. É importante notar que a abundância de LDs nas células ACHN/sgELOVL2 foi significativamente diminuída em comparação com as células ACHN/sgControl (Fig. 4E-4G), sugerindo que a alteração do metabolismo lipídico pela superexpressão de ELOVL2 pode afetar a proliferação de células RCC.
A ablação de ELOVL2 induz a apoptose derenalcélulas cancerosas. Estudos anteriores revelaram que a produção de LDs intracelulares promove apoptose em microambientes tumorais estressantes (4). Portanto, no presente estudo, a apoptose foi avaliada em células ACHN/sgControl ou ACHN/sgELOVL2 e uma atividade significativamente elevada de caspase 3/7 foi detectada nas células ACHN/sgELOVL2 (Fig. 5A). Da mesma forma, foi identificado um número maior de células ACHN/sgELOVL2 apoptóticas em comparação com células ACHN/sgControl, conforme evidenciado pela coloração com Anexina V/PI (Fig. 5B). Dependendo do estresse celular, a apoptose intrínseca (30) leva à perda do potencial de membrana mitocondrial; assim, o presente estudo avaliou ainda mais o potencial elétrico transmembranar mitocondrial de células ACHN/sgControl ou ACHN/sgELOVL2 usando JC-1 fluorescente. A razão agregado/monômero foi significativamente diminuída nas células ACHN/sgELOVL2 (Fig. 5C), indicando a promoção da polarização transmembrana mitocondrial e a ativação da via apoptótica intrínseca por ablação de ELOVL2. Mais precisamente, os níveis de expressão do gene pró-apoptótico (BAX, BAK, PUMA e NOXA) aumentaram significativamente, enquanto os níveis de expressão do gene antiapoptótico (BCL2 e MCL1) diminuíram significativamente devido à ablação de ELOVL2 (Fig. 5D). Esses resultados indicaram que ELOVL2 contribui para a sobrevivência celular através da inibição da apoptose de células cancerosas renais
A degradação da capacidade de armazenamento de lipídios na forma LD pode levar ao colapso da homeostase do RE, desencadeando a resposta proteica desdobrada (UPR) e apoptose celular (4,5). Portanto, a fim de apoiar a hipótese do envolvimento da expressão de ELOVL2 na homeostase do ER, a coloração do rastreador de ER foi realizada em células ACHN/sgControl ou ACHN/sgELOVL2. Imagens de ER subsequentes (Fig. 5E) e quantificação usando citometria de fluxo (Fig. 5F e G) indicaram expansão de ER nas células ACHN/sgELOVL2, devido ao estresse de ER. Além disso, a ablação de ELOVL2 promoveu a fosforilação de IRE1 , um ativador de sensores UPR (Fig. 5H), enquanto a expressão deCHOP, que desempenha um papel principal na apoptose induzida por estresse do RE, foi regulado positivamente pela ablação de ELOVL2 (Fig. 5H). Coletivamente, esses resultados demonstraram que o metabolismo lipídico mediado por ELOVL2 suprime a apoptose celular emrenalcélulas cancerosas e sugeriram que a interrupção da homeostase do RE pode ser um mecanismo potencial de indução.
Discussão
O presente estudo demonstrou que ELVOL2 pode alterar o metabolismo lipídico e promover o crescimento tumoral através da inibição da apoptose de células cancerígenas renais. Além disso, observou-se que a expressão de ELOVL2 em tecidos de CCR estava elevada e que
a maior expressão de ELOVL2 foi significativamente associada a um pior prognóstico de pacientes com CCR. Existem estudos limitados disponíveis sobre os papéis do ELOVL2 na progressão do câncer (22,31,32) e seus resultados são controversos. Simple et al (22) demonstraram que ELOVL2 promoveu a síntese de LC‑PUFA, auxiliando na sinalização eficiente de EGFR e na proliferação de células-tronco de glioblastoma. Em contraste, Kang et al (31) relataram que a ablação de ELOVL2 pode promover a migração celular e a formação de colônias de células de câncer de mama e revelaram que uma expressão diminuída de ELOVL2 estava associada a um pior prognóstico de pacientes com câncer de mama. Além disso, Ding et al (32) relataram que ELOVL2 suprime a proliferação de células de neuroblastoma e foi associado a taxas de sobrevivência favoráveis. De acordo com os resultados conflitantes relatados em estudos anteriores, foi demonstrada uma função multifuncional para ELOVL2 na progressão do câncer, que varia claramente de acordo com o tipo de câncer.
Um metabolismo lipídico alterado afeta muito a progressão do câncer, um efeito observado nos resultados do presente estudo, estando de acordo com pesquisas que descrevem o papel do ELOVL2 como um controlador primário do processo de alongamento de LC-PUFAs e uma enzima crítica na biossíntese de DHA ( 7). No presente estudo, foi demonstrado que LC-PUFAs endógenos,
incluindo AA e DHA, foram diminuídos devido à ablação de ELOVL2 em células cancerosas renais. Em relação a isso, foi relatado anteriormente que a inibição da via AA por inibidores de lipoxigenase (LOX) induz a apoptose e reduz a viabilidade derenalcélulas cancerosas in vitro (33,34). Embora os resultados da superexpressão de ELOVL2 do presente estudo estejam de acordo com esses achados mecanicistas, foi relatado anteriormente, no entanto, que a administração de DHA pode inibir a proliferação e invasão de células cancerígenas renais in vitro (35,36). No entanto, os LC‑PUFAs são conhecidos por terem efeitos distintos e contrastantes na progressão do câncer. Portanto, a alteração de um equilíbrio delicado entre uma variedade de LC‑PUFAs, devido à inibição de ELOVL2, pode estar associada aos diferentes fenótipos observados em vários tipos de câncer. Estudos anteriores demonstraram que os LDs são aumentados através da produção endógena de DHA por ELOVL2 em camundongos (11,12). Da mesma forma, foi revelado que a ablação de ELOVL2 pode suprimir a produção de DHA e LDs em células cancerosas renais, sugerindo que a superexpressão de ELOVL2 pode promover a produção de LD através da produção endógena de DHA no CCR. As células cancerosas são frequentemente encontradas em condições ambientais mais adversas (macro e micro), incluindo hipóxia e privação de nutrientes, mas ainda assim crescem rapidamente sob estressores tão severos. As funções dos LDs em condições de estresse celular, como a manutenção da energia e homeostase redox, a regulação da autofagia, a manutenção da homeostase do RE e a proteção contra a lipotoxicidade, foram demonstradas (4).
Ackerman et al (6) revelaram que os LDs previnem o acúmulo de lipídios tóxicos e saturados durante a hipóxia pelo tamponamento da saturação lipídica celular através da troca de ácidos graxos insaturados residentes em TG no ccRCC. A lipotoxicidade celular devido a ácidos graxos saturados (SFA), incluindo palmitato (C16:0), pode causar apoptose, levando à morte de células cancerígenas (37,38). Recentemente, ELOVL2 foi designado como uma enzima pró‑sobrevivência crítica, auxiliando na prevenção da apoptose celular induzida por glicolipotoxicidade (39). É importante notar que a partição lipídica modificada pelo eixo ELOVL2/DHA resulta em uma utilização não tóxica do palmitato SFA, favorecendo seu transporte nas mitocôndrias para oxidação de FA (FAO) por meio de um mecanismo dependente de CPT1. Além disso, Balaban et al demonstraram que células de câncer de próstata C4-2B e células de câncer de mama MCF-7 são protegidas da apoptose induzida por palmitato pela FAO mitocondrial (37,38). Durante a lipotoxicidade induzida por palmitato, os níveis celulares de proteínas anti-apoptóticas, incluindo BCL-2 ou MCL-1, foram relatados como diminuídos (40,41), enquanto os níveis de proteínas pró-apoptóticas, incluindo PUMA ou NOXA, foram relatados ser aumentado (42,43). Foi revelado no presente estudo que a ablação com ELOVL2 pode promoverrenalapoptose de células cancerosas através da alteração de genes pró e antiapoptóticos de maneira semelhante. Esses achados sugerem que o ELOVL2 pode proteger as células contra a apoptose induzida pela lipotoxicidade para promover o crescimento tumoral no CCR.
Além disso, foi demonstrado que a ablação de ELOVL2 em CCR pode promover estresse de ER e regulação positiva de CHOP, regulando BCL-2 e MCL-1, enquanto regula BAK e BAX, através de uma via mitocôndria-dependente (44). De fato, os resultados do presente estudo demonstraram que os genes pró e antiapoptóticos foram alterados de forma semelhante pela ablação de ELOVL2. Em consonância com os achados do estudo de Qui et al (5), que relataram que LDs dependentes de HIF2/PLIN2 promovem resistência contra estresse de RE e sobrevivência celular em ccRCC, esses achados coletivos apoiam o estresse de RE promovendo apoptose celular por ELOVL2 ablação emrenalcélulas cancerosas, diminuindo LDs e removendo o tampão celular contra lipídios tóxicos.
Em conclusão, o presente estudo demonstrou pela primeira vez, até onde sabemos, que o ELOVL2 promove o crescimento tumoral pela inibição da apoptose através do alongamento de PUFAs, pelo menos parcialmente mantendo a homeostase do RE emrenalcélulas cancerosas. Em conjunto, foi sugerido que os LDs induzidos por ELOVL2 podem contribuir para a progressão do câncer devido a múltiplos efeitos protetores contra o estresse celular no CCR. Além disso, foi sugerido que o ELOVL2 pode ser um potencial alvo terapêutico atraente para pacientes com CCR.