Efeitos dos glicosídeos totais de Cistanche Deserticola na lesão por estresse oxidativo e apoptose celular em ratos com isquemia-reperfusão cerebral Ⅰ

Abstato

Objetivo: Explorar os efeitos e possíveis mecanismos deCistanche deserticola glicosídeos totais(GCs) sobre dano por estresse oxidativo e apoptose de células nervosas em ratos comlesão de isquemia-reperfusão(CIRI).

Métodos: O modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) foi construído em ratos modelo utilizando o método de embolização por sutura. Depois que o modelo foi estabelecido com sucesso, os ratos do grupo de drogas (GCs) receberam GCs 50 mg/(kg·d) por gavagem durante 14 dias consecutivos; os ratos do grupo de operação simulada (Sham) e do grupo modelo (Modelo) receberam o mesmo volume de solução salina normal. Administração oral. Após a administração, utilizou-se o método do escore Longa para avaliar o déficit neurológico; os ratos foram então sacrificados e foi realizada coloração com TTC para calcular a percentagem de área de enfarte cerebral; O método ELISA foi usado para detectar soromalondialdeído(MDA) conteúdo,superoxido dismutação(SOD) eGlutationa peroxidase (GSH-Px)atividade; Western blot para detectar o fator nuclear E2-fator 2 relacionado (Nrf2), heme oxigenase-1 (HO-1) e B no tecido cerebralLinfoma/leucemia celular-2 (Bcl-2), expressão de proteína X associada a Bcl-2-(Bax) e caspase-3 (Caspase-3).

Resultados: Comparado com o grupo Sham o grupo Modelo apresentou um aumento no escore de déficit neurológico aumento na porcentagem de área de infarto cerebralaumento do conteúdo de MDA, diminuição das atividades de SOD e GSH-Px e diminuição do nível de expressão da proteína Nrf 2, HO -1 e Bc l-2 Os níveis de expressão proteica de Bax e Caspase-3 aumentaram; em comparação com o grupo Modelo, o escore de déficit neurológico dos ratos no grupo GCs diminuiu, a porcentagem de área de infarto cerebral diminuiu, oO conteúdo do MDA diminuiu, A atividade de SOD e GS H-Px aumenta, Os níveis de expressão proteica de Nrf 2, HO -1 e Bcl - 2 aumentaram, e os níveis de expressão proteica de Bax e Caspase - 3 diminuíram. Conclusão: Os GCs podem efetivamente reduzir a lesão de isquemia-reperfusão cerebral, e seu mecanismo pode estar relacionado à ativação da via Nrf 2 / HO - 1, reduzindo assim os níveis de estresse oxidativo e inibindo a apoptose das células nervosas.

[Palavras-chave]Cistanche deserticola glicosídeos totais; lesão de isquemia-reperfusão cerebral; estresse oxidativo; apoptose celular

EXTRATO DE CISTANCHE ORGÂNICO NATURAL

Clique para obter mais detalhes

Serviço de apoio da Wecistanche - o maior exportador de cistanche da China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Compre para obter mais detalhes de especificações:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Isquemia-reperfusão cerebral,

CIS é uma doença extremamentealta morbidade, incapacidadeetaxas de mortalidade. As células cerebrais são extremamente sensíveis à isquemia e à hipóxia, portanto, a recanalização dos vasos sanguíneos cerebrais o mais rápido possível é a maneira mais eficaz de lidar com o acidente vascular cerebral isquêmico agudo. A trombólise intravenosa e a trombectomia mecânica são atualmente métodos amplamente utilizados, mas devido à sua relativa

Devido à janela de tempo estreita e a outros factores incontroláveis, apenas<10% of stroke patients can achieve vascular recanalization within an effective time. Reperfusão de isquemia cerebral, CIRI é um tipo de recuperação de vaso sanguíneo cerebral da estenose. Um dano patológico sobreposto que ocorre durante o fluxo sanguíneo. Atualmente, acredita-se que seu mecanismo patológico pode estar relacionado à toxicidade de aminoácidos excitatórios, sobrecarga de cálcio, liberação de fatores inflamatórios e acúmulo de radicais livres de oxigênio causados ​​por danos mitocondriais [1], levando em última análise à destruição da barreira hematoencefálica, distúrbios da microcirculação. , apoptose de células nervosas e necrose [1] 2] e uma série de reações, agravando ainda mais os déficits neurológicos.

Os glicosídeos totais de Cistanche deserticola (glicosídeos de cistanche, GCs) são derivados da medicina tradicional chinesa Herba Cistanche. O principal ingrediente ativo é extraído dos caules e raízes de polegadas). Estudos anteriores mostraram que os GCs podem efetivamente inibir a peroxidação lipídica, melhorar a função mitocondrial, eliminar o excesso de radicais livres de oxigênio, inibir a liberação de citocinas inflamatórias, reduzir a citotoxicidade, agregação antiplaquetária, inibir a proliferação celular, inibir a apoptose neuronal e reduzir os níveis hormonais, tendo assim antienvelhecimento, antitumoral, antidepressão, aumentando a imunidade, melhorando doenças cardiovasculares e cerebrovasculares isquêmicas, melhorando as habilidades de aprendizagem e memória e funções cognitivas e melhorando a reprodução [3].

Estudos demonstraram que os GCs podem reduzir o dano oxidativo às células e manter a integridade da barreira hematoencefálica.

[4]; Os GCs podem efetivamente melhorar a viabilidade celular e bloquear a inflamação e a apoptose induzidas após isquemia-reperfusão [5]; Nrf 2 desempenha um papel importante nos processos antiinflamatórios e antioxidantes [6]. Com base no contexto acima, este artigo tem como objetivo estudar mais a fundo os efeitos e possíveis vias dos GCs no estresse oxidativo e na apoptose após CIRI, replicando o modelo CIRI.

1 Materiais e métodos

1. 1 GCs de medicamentos e reagentes (SN-5692, pureza 98%, Western

Anshenong Biotechnology Co., Ltd.), solução corante de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) a 2% (Beijing Solebao Technology Co., Ltd.), kit ELISA (Beijing Boosen Co., Ltd.), kit de análise quantitativa de proteína BCA (USA Cell Signaling Technology Company), anticorpo anti-camundongo de coelho Bcl-2, Bax, Caspas Anticorpos como e-3, Nrf 2, HO-1 e anticorpos secundários anti-coelho de cabra foram todos adquiridos de Empresa Proteintech dos Estados Unidos.

1. 2 instrumentos

Centrífuga (Modelo: TDL-40B, Shanghai Anheng Scientific Instrument Factory), Leitor de microplacas (Modelo: Max-M5, American Molecular Devices Company), Instrumento de eletroforese SDS-PAGE (modelo: DYY-7C, Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. Company), scanner de gel (Modelo: 4466611, US BIO-RAD Company).

1. 3 animais

Ratos Wistar machos [SCXK (Pequim) 2019-0010], classe limpa, 8 semanas de idade, peso corporal 250-280 g.

1. 3 métodos

1. 3. 1 Agrupamento e modelagem

Os ratos foram divididos em grupo sham (Sham), grupo modelo (Modelo) e grupo medicamento (GCs) usando um método de randomização simples. Havia 15 ratos em cada grupo. Eles foram criados adaptativamente por 1 semana e depois modelados. Em jejum estrito e 12 horas antes da cirurgia, o grupo Modelo e o grupo GCs utilizaram o método de embolização por sutura [7] para criar oclusão da artéria cerebral média (oclusão da artéria cerebral média). oclusão, modelo de rato MCAO), a remoção do êmbolo foi realizada após 2 horas de isquemia para alcançar a reperfusão. , registre o horário de início da reperfusão. A ferida foi suturada, a pele foi desinfetada com iodóforo e os animais foram devolvidos à gaiola e criados, sendo então perfundidos por 24 horas. A operação para os ratos do grupo Sham foi a mesma dos ratos modelo, mas nenhum tampão foi realizado. Finalmente, 10 ratos em cada grupo foram retidos para experimentos subsequentes.

1. 3. 2. Método de administração

Pegue o pó de GCs e adicione água pura para preparar uma solução de 15 mg/mL. Estudos preliminares demonstraram que a dose de 50 mg/(kg·d) é melhor que outros grupos de dose [8], portanto a dose selecionada para este experimento é a mesma de antes. Os ratos do grupo GC receberam GCs por gavagem após 24 horas de isquemia e reperfusão, e os ratos do grupo Sham e do grupo Modelo receberam um volume igual de solução salina normal por gavagem durante 14 dias.

1. 3. 3 Pontuação de déficit neurológico

O método de pontuação Longa [7] foi usado para pontuar 24 horas após a cirurgia, e ratos modelo com pontuações de 1 a 3 foram retidos para experimentos subsequentes. Pontuação após a última dose. 0 pontos: Nenhum

Sintomas neurológicos; 1 ponto: leve déficit neurológico, o membro torácico contralateral flexiona e eleva quando a cauda é levantada e o ombro aduz; 2 pontos: déficit neurológico moderado, o membro torácico contralateral flexiona e eleva quando a cauda é levantada, adução do ombro, girando em círculos para o lado oposto da lesão ao caminhar; 3 pontos: déficit neurológico grave, inclinando-se para o lado oposto da lesão ao caminhar; 4 pontos: atividades inconscientes e autônomas.

1. 3. 4 Determinação da porcentagem de área de infarto cerebral

Após a última administração, 4 ratos de cada grupo foram selecionados aleatoriamente, profundamente anestesiados, decapitados e seus cérebros foram removidos rapidamente.

Congele rapidamente o tecido cerebral em uma geladeira de -20 graus por 20 minutos. Depois que o tecido cerebral estiver relativamente fixo, retire-o. A partir da intersecção do pólo anterior do cérebro até o quiasma óptico e da testa ao occipital, corte o cérebro do rato ao longo do plano coronal. Corte em 5 fatias de cérebro com espessura de 2 mm, mergulhe-as em solução TTC a 2%, coloque-as em banho-maria a 37 graus para tingir por 15 minutos, vire-as e tinga-as por mais 15 minutos. Por fim, as fatias cerebrais foram imersas em solução de paraformaldeído a 4% e fixadas por 12 horas antes de serem fotografadas. O tecido cerebral normal foi mostrado em vermelho e o tecido cerebral infartado foi mostrado em branco. Use software de imagens para analisar e calcular a taxa de infarto de cada fatia cerebral. Taxa de infarto=área de infarto/área total da fatia cerebral × 100%.

1. 3. 5 Detecção de indicadores relacionados ao estresse oxidativo

Anestesie o rato, tome 4 mL de sangue da aorta abdominal, aliquote-o em tubos EP limpos e coloque-o em uma geladeira de 4 graus por 0. Centrifugar a 3 500 r/min durante 5 h a 4 graus durante 15 min, retirar o sobrenadante e, finalmente, reter o soro de 3 ratos em cada grupo. O teor de malondialdeído (MDA) e superóxido dismutase (superóxido dismutase) foi determinado de acordo com o método operacional do kit ELISA. e dismutase,

SOD), atividade da glutationa peroxidase (glutationa peroxidase, GSH-Px).

1. 3. 6 Detecção de Western Blot

O estresse oxidativo e as proteínas relacionadas à apoptose foram medidos para medir a expressão das proteínas Nrf 2, HO -1, Bcl -2, Bax e Caspase -3 no tecido cerebral. Três ratos foram selecionados de cada grupo, e uma quantidade apropriada de córtex cerebral da área doente foi retirada, solução de lise foi adicionada e a concentração de proteína foi calculada após a extração da proteína. Após eletroforese em gel de proteína, transferência para membrana, bloqueio com solução bloqueadora por 2 h, enxágue e depois incubado com anticorpo primário a 4 graus durante a noite, no dia seguinte, o TBST foi removido, enxaguado e o anticorpo secundário foi adicionado para incubação por 2 h. Coloque a banda alvo no analisador de imagem para analisar o valor de cinza. Calcule o valor relativo de cinza da faixa, valor relativo de cinza da faixa=valor de cinza da faixa de destino/valor de cinza da faixa de referência interna.

1.4 Métodos de análise estatística

Aplicativo de dados SPSS 25. 0 software para análise de dados, e os gráficos estatísticos deste artigo foram desenhados com o software GraphPad Prism 8. Os resultados dos dados consistentes com a distribuição normal são expressos como média ± desvio padrão. A análise de variância de um fator foi usada para comparações entre múltiplas amostras, e o LSD-t foi usado para comparações entre duas amostras independentes. Teste, com P < 0. 05 indica que a diferença é estatisticamente significativa.