Efeitos do tratamento com ácido 2-aminoindano-2-fosfônico no acúmulo de salidroside e quatro glicosídeos feniletanóides em cultura de células em suspensão de Cistanche Deserticola

para mais informações:ali.ma@wecistanche.com

Gao Sheng Hu, e outros

Abstrato

2-Aminoindan-2-ácido fosfônico (AIP), um inibidor competitivo específico de fenilalanina amônia-liase (PAL) foi aplicado a uma cultura de células em suspensão deCistanche deserticola. Os efeitos do tratamento com AIP no crescimento celular, atividade PAL, conteúdo e rendimento de composto fenólico total, salidroside e quatroGlicosídeos feniletanoides(PheGs) são investigados. Os resultados demonstraram que os tratamentos com {{0}},5 e 2,0 lM AIP tiveram efeitos semelhantes nas medidas investigadas neste estudo. O tratamento com AIP resultou em diminuições significativas na atividade de PAL, teor de compostos fenólicos totais e(glicosídeos feniletanoides)conteúdo PheGs. A análise de regressão linear mostrou que a atividade da PAL teve um alto coeficiente de correlação com o teor de compostos fenólicos totais e os quatro(glicosídeos feniletanoides)Conteúdo de PheGs. A área total de tempo de atividade de PAL sob a curva (AUC) teve um alto coeficiente de correlação com o rendimento de compostos fenólicos totais e os rendimentos de cinco compostos testados em amostras de células não tratadas. rendimento de compostos fenólicos totais e os rendimentos de três compostos testados, echinacoside, acteoside e tubuloside A, mas não salidroside e cstanside A. A diferença pode ser causada pelas diferentes origens biossintéticas de cada um dos compostos testados. Esses resultados demonstram o importante papel do PAL na biossíntese de(glicosídeos feniletanoides)PheGs na cultura de células em suspensão deCistanche deserticola.

Palavras-chave

Cistanche deserticola, Cultura celular em suspensão,Glicosídeos feniletanoides, 2-Aminoindan-2-ácido fosfônico (AIP), atividade PAL, Biossíntese, Salidroside

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Introdução

Cistanche deserticolaYC Ma, uma erva medicinal tradicional chinesa, tem sido usada há séculos na China por seus efeitos nutritivos. É um propósito perene e uma erva medicinal parasitária pertencente ao gênero Cistanche na família Orobanchaceae. A planta cresce em áreas desérticas do oeste da China e é um parasita nas raízes de Haloxylosammodendrun.

O isolamento de constituintes químicos e estudos de elucidação estrutural deCistanche deserticolacomeçou na década de 1980 (Kobayashi et al. 1984a, b, 1985, 1986; Karasawa et al. 1986; Xiong et al. 1996). A demonstração deglicosídeos feniletanoides(PheGs) como compostos eficazes na proteção de células neuronais de danos (Sheng et al. 2002; Puet al. 2003; Geng et al. 2004; Tian e Pu. 2005) causados ​​por produtos químicos e envelhecimento, impulsionaram o aumento da demanda do mercado por alimentos saudáveis ​​comercialmente disponíveis e drogas. Devido à colheita excessiva, corrupção do habitat e parasitismo complexo, os recursos naturais daCistanche deserticolaestão à beira da extinção e, em 2003, foi listado na Convenção sobre Comércio Internacional de Espécies Ameaçadas de Fauna e Flora Selvagens (CITES).

Para resolver os problemas relacionados aos recursos limitados, culturas de células e tecidos desta planta medicinal foram realizadas na China. Esses estudos investigaram os efeitos de vários fatores, incluindo o estresse osmótico (Liu e Cheng 2008), alimentação precursora (Ouyang et al. 2005; Liu et al. 2007), a luz de comprimento de onda variável (Ouyang et al. 2003a), fungicidas (Lu e Mei 2003; Cheng et al. 2005, 2006), e eliciadores abióticos (Ouyang et al. 2003b) no crescimento celular e no acúmulo de(glicosídeos feniletanoides)FeGs. Esses estudos forneceram informações valiosas para a cultura em larga escala deCistanche deserticola.Como estes compostos são biossintetizados em Cistanchecells permanece obscuro e pouca informação genética tem sido relatada.

Foi demonstrado em experimentos de alimentação de precursores marcados com isótopos (Ellis 1983; Saimaru e Orihara 2010) que o grupo cafeoil de acteosídeo foi derivado de L-fenilalanina, enquanto o 3, 4-diidroxilfenil etanol foi derivado de L-tirosina. Uma hipotética via biossintética de(glicosídeos feniletanoides)PheGs emCistanche deserticolafoi proposto (Fig. 1 suplementar) com base no conhecimento atual de vias biossintéticas relacionadas. A enzima PAL catalisou o primeiro passo da fenilalanina para o grupo cafeoil. A PAL foi indiretamente comprovada como uma importante enzima na biossíntese de(glicosídeos feniletanoides)PheGs por pesquisa de tratamento elicitor emCistanche deserticola(Lu e Mei 2003; Cheng et al. 2005, 2006;Ouyang et al. 2003b), em que o total(glicosídeos feniletanoides)O acúmulo de PheGs foi melhorado juntamente com o aumento da atividade de PAL. O tratamento com elicitor não apenas melhorará o nível de expressão de PAL, mas também melhorará os níveis de outras enzimas envolvidas na via de biossíntese de metabólitos secundários. Devido às dificuldades no estabelecimento do sistema de transformação deCistanche deserticola, evidência direta de superexpressão de PAL em(glicosídeos feniletanoides)O acúmulo de PheG não foi relatado. Em outras plantas produtoras(glicosídeos feniletanoides)PheGs, como plantas do gênero Echinacea, o experimento também não foi realizado. Aqui relatamos os efeitos do tratamento com o inibidor específico de PAL 2-aminoindano-2-ácido fosfônico no crescimento celular, compostos fenólicos totais, atividade de PAL e acúmulo de(glicosídeos feniletanoides)PheGs em cultura celular em suspensão deCistanche deserticola, em um esforço para avaliar o papel funcional do PAL na biossíntese de PheGs. Estudar a via biossintética de(glicosídeos feniletanoides)PheGs em nível molecular, clonamos e caracterizamos o gene CdPAL1 do calo deCistanche deserticola(Hu et al. 2010). Estamos tentando estabelecer o sistema de transformação de plantas de Echinacea mediado por Agrobacterium rhizogenes e introduzir o gene na raiz pilosa de Echinacea para estudar os efeitos diretos da superexpressão desse gene no acúmulo de PheGs. Além disso, também clonamos vários genes envolvidos na via biossintética de PheGs deCistanche deserticolacalos usando triagem de biblioteca de cDNA e RACE PCR, como tirosinase, álcool cinamílico desidrogenase, tirosina descarboxilase, cinamato-3-hidroxilase, cumarato-4-hidroxilase; UDP-glucosiltransferase e hidroxilcinamil transferase. Faremos mais experimentos incluindo caracterização molecular, análise de expressão, linhas de superexpressão da raiz Echinaceahairy para elucidar a via biossintética do PheGson em nível molecular.

Materiais e métodos

Cultura de células em suspensão de C. deserticola

Uma cultura de células em suspensão deCistanche deserticolafoi mantido em meio líquido B5 (Gamborg et al. 1968) suplementado com 30 g sacarose-l-1, 0,5 mg 6-BA-l-1 , e 2,0 mgNAA l-1 a 25 ± 1 grau com agitação (180 rpm). O período de luz foi de 16 (L)/8 (D) e a cultura de células em suspensão foi subcultivada a cada 28 dias. Durante a subcultura, a cultura celular em suspensão foi primeiramente filtrada em bancada limpa com pano Mira autoclavado e, em seguida, o pellet celular fresco foi pesado e inoculado em novo meio na concentração de 2 g FW-50 ml-1.

Investigação de crescimento

O crescimento celular foi medido principalmente pelo peso fresco da célula (PF) e peso seco (PD). As culturas de células foram amostradas no 2º, 4º, 8º, 12º, 17º, 22º e 28º dias e filtradas com filtração a vácuo usando pano Mira até que não houvesse mais queda de líquido do funil. O sedimento celular foi pesado e registrado como FW. Metade das células frescas coletadas foram armazenadas a -78 C para um ensaio de atividade e a outra metade foi seca a 60 C por 24 h até que um peso constante fosse observado. As células secas foram resfriadas em dessecador até a temperatura ambiente e então pesadas. Este peso foi multiplicado por dois e registrado como DW. As amostras de células secas foram moídas em um pó fino (peneira de 80 mesh até 100 por cento), colocadas em tubos marrons, lacradas e armazenadas a -20 grau para experimentos futuros.

Extração e determinação do teor de compostos fenólicos totais

Trinta miligramas de pó celular seco de cada amostra foram extraídos usando 400 l de metanol a 80 por cento a 37 C por 1 h com uma velocidade de agitação de 200 rpm seguida de centrifugação. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e os detritos foram extraídos mais duas vezes usando o mesmo procedimento. O sobrenadante foi combinado, filtrado e utilizado para a determinação do teor de compostos fenólicos totais e análise por HPLC (Hu 2007).

Os teores de compostos fenólicos totais foram analisados ​​pelo método de Folin-Ciocalteu modificado (Singletonet al. 1999). O reagente Folin-Ciocalteu foi diluído com 1 volume de água destilada. O extrato obtido foi diluído dez vezes e 10 ll do extrato foram utilizados em cada ensaio de conteúdo. Dez microlitros de cada extrato diluído foram adicionados a 200 ll de solução de carbonato de sódio a 2 por cento recém-preparada. A mistura foi vigorosamente misturada e seguida de breve centrifugação. A mistura foi incubada em RT por 5 min e posteriormente misturada com 10 ll de reagente de Folin diluído. A mistura final foi vigorosamente misturada e incubada em RT por 30 min. A DO750 foi medida em espectrofotômetro UV/Vis e registrada para o cálculo dos compostos fenólicos totais. A solução seriada de ácido clorogênico foi utilizada como composto padrão e uma curva padrão entre a quantidade de ácido clorogênico e a DO750 foi elaborada para calcular o teor representativo de compostos fenólicos totais como ácido clorogênico. Usando o conteúdo de compostos fenólicos totais e os dados de crescimento das amostras, calculamos o rendimento do composto fenólico total em cada amostra e expressamos quantos miligramas do composto fenólico total são produzidos em uma ninhada (mg L-1).

Tratamento AIP

A solução estoque de AIP foi preparada usando água destilada para atingir uma concentração final de 4 mM. Um volume adequado de solução estoque foi adicionado a 50 ml do meio para obter concentrações finais de 0,5 e 2,0 lM. Os meios foram autoclavados e inoculados com células recém-colhidas. Frascos triplicados foram inoculados com células coletadas do mesmo frasco e foram utilizados em todos os grupos para minimizar o erro sistemático.

Análise de HPLC

Os extratos obtidos em 'Extração e determinação do conteúdo de compostos fenólicos totais' foram filtrados através de um filtro de 0,5 lm antes da análise por HPLC. A análise por HPLC foi realizada usando um HPLC Hitachi (bomba L-2130, detector L-2420UV/Vis e amostrador automático L-2200) com coluna C18 (150 9 4,6 mm, 5 lm, Waters), fase móvel (eluição gradiente MeOH/H2O) e um comprimento de onda de detecção de 330 e 220 nm para detecção de(glicosídeos feniletanoides)PheGs e salidroside, respectivamente. Dez microlitros de cada diluição de composto padrão e extrato de amostra foram injetados na coluna. As determinações de conteúdo de echinacoside, acteside, cistanoside A, tubuloside A e salidroside foram realizadas usando a curva padrão para cada composto de referência. Salidroside e echinacoside foram adquiridos do National Institute for o Controle de Produtos Farmacêuticos e Biológicos (Pequim, China) e o Dr. Nobuhisa Ezaki da Yomeishu Seizo Company forneceram os outros compostos de referência. A pureza de todos os compostos padrão é superior a 95%. As informações estruturais para os cinco compostos testados estão listadas na Tabela 1.

Ensaio de atividade PAL

A proteína bruta foi extraída de amostras armazenadas a {{0}} grau. Uma amostra de 0,1 g foi moída em um pó fino com nitrogênio líquido e 600 ll de tampão de extração de proteína foram adicionados ao tubo contendo o pó celular seguido de vigorosa agitação para 5 minutos às 4grau. A mistura foi centrifugada a 13,000 rpm a 4 graus por 10 min. O sobrenadante foi definido como um extrato de proteína bruta. Dez microlitros do extrato de proteína bruta foram adicionados a um tampão Tris-HCl (pH 8,5) contendo 10 ll de fenilalanina 5 mM em gelo. A mistura foi incubada a 55graupor 20 min e extinta pela adição de 50 ll de HCl 2 M. As alterações de OD270 foram registradas para calcular a produção de ácido cinâmico com base na curva padrão de ácido trans-cinâmico. A área total de atividade PAL-tempo sob a curva (AUC) foi calculada com base nos dados de crescimento celular e nos dados do ensaio de atividade PAL.

Análise estatística

Toda a análise estatística foi realizada usando o software Microsoft Excel incluindo erro padrão e análise de regressão linear

Resultados e discussão

Efeitos do tratamento com AIP no crescimento celular deCistanche deserticolacultura de células em suspensão

Conforme mostrado na Fig. 1, o tratamento com AIP em ambas as concentrações não teve efeitos de inibição no crescimento celular, conforme indicado por FW e DW.

Efeitos do tratamento AIP na atividade PAL

Conforme mostrado na Fig. 2, o tratamento de AIP em ambas as concentrações não resultou em uma diminuição na atividade de PAL no 2º dia, mas a atividade de PAL diminuiu significativamente nos dias 4 até o 28º. Nesses dias, a atividade de PAL das células tratadas com 0.5 lMAIP foi de 80,3, 73,2, 82,7, 68,5, 62,3 e 42,4 por cento das células não tratadas e sob 2 lM de AIP.

Efeitos do tratamento com AIP no acúmulo de compostos fenólicos totais

A Figura 3a mostrou que o tratamento com AIP em ambas as concentrações afetou marcadamente a biossíntese de compostos fenólicos totais. Semelhante à atividade da PAL, o teor de compostos fenólicos totais não diminuiu no 2º dia, mas começou a diminuir no 4º dia. Os efeitos inibitórios da AIP em 0.5 e 2 lM sobre os teores de compostos fenólicos totais foram muito semelhantes. A taxa de inibição de conteúdo variou de 91,1 a 50,1 por cento e de 89,9 a 41,5 por cento das células não tratadas em 0,5 e 2 lM de células tratadas com AIP, respectivamente. Com base na determinação do teor de compostos fenólicos totais e dados de crescimento celular, os rendimentos de compostos fenólicos totais foram calculados conforme mostrado na Fig. 3b. Mudanças significativas no rendimento de compostos fenólicos totais em diferentes estágios de crescimento foram evidentes em células tratadas com 0,5 e 2,0 lM de AIP em comparação com células não tratadas. Como mostrado nas Figs. 2 e 3, a inibição da atividade de PAL e a diminuição dos compostos fenólicos totais e rendimentos tiveram tendências semelhantes.

Uma análise de regressão linear entre a atividade de PAL e compostos fenólicos totais foi realizada e os resultados sugeriram que nas células tratadas com AIP, a atividade de PAL estava intimamente relacionada ao conteúdo de compostos fenólicos totais (Fig. 4a). O rendimento de compostos fenólicos totais na amostra em cada passo de tempo é o resultado da acumulação; portanto, uma análise de regressão linear foi conduzida entre AUC de tempo de atividade de PAL total e rendimento de composto fenólico total. A Figura 2 mostra que a atividade PAL foi diferente em cada ponto de tempo; assim, para calcular a AUC de tempo de atividade de PAL total, assumimos aqui que a atividade de PAL entre dois pontos de tempo mudou linearmente. Conforme mostrado na Fig. 4b, a AUC se correlacionou bem com o rendimento de compostos fenólicos totais e exibiu coeficientes de correlação (R2) de 0,9788, {{10}},8157 e 0 0,6981 para as células não tratadas,00,5 lM AIP e 2,0 lM AIP tratadas, respectivamente.Cistanche deserticolacultura de células em suspensão.

Efeitos do tratamento com AIP no acúmulo de salidroside e quatro(glicosídeos feniletanoides)PheGs

Estudar os efeitos detalhados da AIP na biossíntese e acumulação de(glicosídeos feniletanoides)PheGs, extratos de diferentes amostras foram aplicados a HPLC e o cromatograma representativo de cada amostra é mostrado na Fig. 5. A fórmula padrão de cinco compostos testados e seus tempos de retenção estão listados na Tabela 2. Como a Fig. 5a mostrou, salidroside e os outros quatro PheGs são linhas de base separadas sob nossa condição analítica. Podemos ver na Fig. 5b-d, que o teor de salidroside não mudou significativamente e, na Fig. 5f, g, que a área dos picos detectados em 330 nm diminuiu significativamente e continuamente em 0,5 e 2 lM tratados com AIP extratos de células em comparação com células não tratadas (Fig. 5e).

As alterações de teor e rendimento de cada composto testado são demonstradas na Fig. 6 e Tabela 3. De acordo com nossos resultados, echinacoside e cistanoside A são os dois compostos principais e seus teores são cerca de dez vezes maiores do que os outros três compostos. No entanto, houve diferenças significativas no teor de cada composto em resposta ao tratamento AIP. No caso do equinacosídeo, o teor em células não tratadas começou a aumentar continuamente do 8º dia ao 28º dia (Fig. 5a), o que foi bem diferente do padrão do cistanosídeo A, que atingiu seu maior teor no 8º dia e diminuiu levemente continuamente até o 28º dia. Nas células tratadas com AIP, o teor dos dois compostos diminuiu significativamente no mesmo padrão. O conteúdo de acteosídeo e tubulosídeo A foi muito menor do que o equinacosídeo, enquanto a tendência de mudança foi semelhante ao equinacosídeo. Há também uma diminuição dramática no rendimento de cada composto testado para as células tratadas com 0.5 e 2 lM com AIP em comparação com as células não tratadas. De acordo com a Fig. 6 e a Tabela 3, o rendimento de echinacoside, cistanoside, acteside, tubuloside A e salidroside caiu para aproximadamente 10, 10, 34, 36 e 25 por cento das células não tratadas, respectivamente, no 28º dia em células tratadas com AIP em ambos concentrações.

Análise de regressão linear entre atividade PAL e(glicosídeos feniletanoides)Acúmulo de PheGs

Para determinar como a atividade de PAL e o conteúdo de cada composto testado foram correlacionados em cada grupo, foi realizada uma análise de regressão linear (Fig. 7). O conteúdo de salidroside em todos os grupos teve o menor coeficiente de correlação (R2), variando de 0 0,1651 na célula não tratada a 0 0,4753 nas células 2,0 lM tratadas com AIP . Com exceção do salidroside, os outros compostos testados apresentaram coeficientes de correlação muito mais elevados e seu R2 está listado na Fig. 7. Nossos resultados demonstraram que a atividade PAL está altamente correlacionada com o conteúdo de echinacoside, acteside, cistanoside A e tubuloside A em todos os grupos.

Também realizamos uma análise de regressão linear entre a AUC do tempo de atividade de PAL total e o rendimento de cada composto testado nas amostras coletadas (Fig. 8). A análise de regressão indicou que o rendimento de cada composto se correlacionou com a AUC de forma diferente. Nas células não tratadas, todos os cinco compostos têm altos coeficientes de correlação com a AUC do tempo de atividade da PAL total. No entanto, nas células tratadas com AIP, apenas echinacoside, acteoside e tubuloside A mantiveram altos coeficientes de correlação e os outros dois compostos, cistanoside A e salidroside tiveram coeficientes de correlação muito baixos com AUC total de atividade PAL-tempo. Esses resultados sugeriram que a atividade da PAL teve efeitos muito diferentes no acúmulo desses compostos. De acordo com a Tabela 1, os compostos equinacósido, acteósido e tubulósido A apresentam um grupo cafeoílo e um grupo 3, 4-dihidroxilfeniletanol; o cistanósido A tem um grupo feruloílo e um grupo 3-metoxi, 4-hidroxilfeniletanol; andsalidroside tem um grupo hidroxilfenil etanol. A razão pela qual esses compostos têm diferentes coeficientes de correlação com a atividade total de PAL-tempo AUC em células tratadas com AIP pode estar relacionada às suas diferentes origens biossintéticas.

Conforme mostrado na Fig. 5, após o tratamento com AIP, a maioria dos picos diminuiu de forma contínua e significativa e cinco foram identificados neste estudo. Entre esses compostos testados, apenas o salidroside não apresentou o grupo cafeoil. Antes deste estudo, pensava-se que o conteúdo de importantes intermediários antes da integração do grupo cafeoil, como o salidroside, estaria aumentado devido à inibição da atividade da PAL, mas não encontramos picos significativamente aumentados nas células tratadas com AIP. Esse resultado pode ocorrer porque o(glicosídeos feniletanoides)PheGs são metabólitos secundários em C. deseriticola e a produção desses(glicosídeos feniletanoides)PheGs é regulado pelo estresse ambiental das células. Em nossos experimentos, as células tratadas com AIP não são tratadas com elicitores ou outros estresses, de modo que a produção de PheGs e seus intermediários não são biossintetizados ativamente em células tratadas com AIP. Também foi relatado que (Chapple et al. 1986) a atividade da tirosina decarboxilase de plantas (TYRDC) pode ser fortemente inibida por La-aminooxi-b-fenilpropionato, outro inibidor competitivo específico de PAL. TYRDC é uma enzima chave na produção de salidroside a partir de tirosina. No entanto, de acordo com nossos resultados, o conteúdo de salidroside não foi significativamente afetado pelo tratamento com AIP, o que sugere que a atividade de TYRDC não foi fortemente afetada. É necessário um ensaio de atividade específica usando uma proteína purificada de TYRDC ou proteína recombinante para determinar os efeitos da AIP em sua atividade.

Conclusões

Nossos resultados demonstraram que o tratamento com AIP em {{0}},5 e 2,0 lM não teve efeitos marcantes no crescimento celular, mas resultou em inibição significativa da atividade de PAL, biossíntese e acúmulo de compostos fenólicos totais e testados(glicosídeos feniletanoides)Cultura de células em suspensão de FeGsina deCistanche deserticola. A análise de regressão linear indicou que a atividade da PAL teve altos coeficientes de correlação com o teor de compostos fenólicos totais e(glicosídeos feniletanoides)Teor de PheGs, exceto salidroside em todos os grupos celulares. Os rendimentos de compostos fenólicos totais e os cinco compostos testados apresentaram altos coeficientes de correlação com a AUC total de atividade de PAL em células não tratadas. Em relação às células tratadas com AIP, apenas echinacoside, acteoside e tubuloside A mantiveram altos coeficientes de correlação com a AUC de tempo de atividade de PAL total. Diferentes origens biossintéticas podem ser responsáveis ​​por essa diferença. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a enzima PAL desempenhou um papel importante no controle da biossíntese e acúmulo de(glicosídeos feniletanoides)PheGs na cultura de células em suspensão deCistanche deserticola.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo fundo de pesquisa da Universidade Dong-A. Gostaríamos de agradecer ao professor Jerry Zon, que trabalha no Instituto de Química Orgânica, Bioquímica e Biotecnologia, da Universidade de Tecnologia de Wrocław, na Polônia, por nos fornecer o AIP. Também gostaríamos de mostrar nosso apreço ao Dr. Nobuhisa Ezaki da Yomeishu Seizo Company no Japão por nos fornecer os compostos padrão cistanoside A, acteoside e tubuloside A para nossos experimentos.

De: 'Efeitos do tratamento com ácido 2-aminoindan-2-fosfônico no acúmulo de salidroside e quatro glicosídeos feniletanoides em cultura de células em suspensão de Cistanche deserticola' porGao Sheng Hu, e outros

---Plant Cell Rep (2011) 30:665–674 DOI 10,1007/s00299-010-0997-3

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