Eficácia do tratamento combinado de extratos de Laminaria Japonica e Cistanche Tubulosa no crescimento capilar

Kyungha Shin1#, Tae-Su Kim2#, Jangbeen Kyung1, Dajeong Kim1, Dongsun Park1, Ehn-Kyoung Choi1, Sung-Pyo Lee2, Woong-Suk Yang2, Myung-Hwa Kang3, Yun-Bae Kim1*

1Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Nacional de Chungbuk, Cheongju, Coréia

2Misuba RTech Co., Ltd., Asan, Coréia

3Departamento de Ciência dos Alimentos e Nutrição, Hoseo University, Asan, Coréia

Como a queda de cabelo no couro cabeludo aumentou recentemente, mesmo em jovens, afetando seriamente a qualidade de vida dos indivíduos, os efeitos estimulantes do crescimento capilar do extrato de Laminaria japonica (LJE) eCistanche tubulosaextrato (CTE) foram investigados. Após a confirmação da fase anágena dos folículos sob shaving, camundongos machos C57BL/6 foram aplicados dermicamente com Minoxidil 3% ou administrados oralmente com as combinações de LJE e CTE por 21 dias. O minoxidil promoveu o recrescimento capilar e aumentou as atividades da -glutamil transpeptidase (-GTP) e da fosfatase alcalina (ALP). Além disso, o Minoxidil aumentou os níveis de fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). A co-administração de LJE e CTE a 54 mg/kg de LJE mais 162 mg/kg de CTE exerceu efeitos sinérgicos promotores no crescimento do cabelo, comparáveis ​​a 3% de Minoxidil. LJE melhorou preferencialmente a atividade de ALP, enquanto CTE aumentou as atividades de -GTP e ALP, bem como as expressões de EGF e VEGF. O modelo de inflamação da bolsa de ar in vivo, exsudação vascular induzida por carragenina e concentrações aumentadas de óxido nítrico e prostaglandina E2 nos exsudatos foram suprimidos sinergicamente pela coadministração de LJE e CTE. Além disso, a infiltração de células inflamatórias foi substancialmente inibida pelo tratamento combinado. Os resultados sugerem que o tratamento oral combinado com LJE e CTE em doses e proporções adequadas previne a queda de cabelo e melhora a alopecia, que pode ser em parte mediada por suas atividades anti-inflamatórias.

Palavras-chave:Crescimento do cabelo, inflamação, Laminaria japonica,Cistanche tubulosa,tratamento combinado

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Recentemente, a queda de cabelo no couro cabeludo vem aumentando mesmo em jovens, afetando seriamente a qualidade de vida do indivíduo. Embora a calvície não seja um dos problemas de saúde, ela pode causar um profundo estresse social psicologicamente desconfortável. Portanto, é de grande interesse desenvolver novos materiais preventivos e/ou terapêuticos para queda e crescimento capilar. Apesar do mercado bilionário, existem alguns produtos atualmente eficazes disponíveis [1]. Os folículos capilares remodelam-se durante os períodos de ciclo de crescimento (anágeno), regressão (catágeno), repouso (telógeno) e queda (exógeno) [2]. Durante a catágena,

muitas das células foliculares sofrem morte celular programada (apoptose) [3], reduzindo o tamanho do folículo à medida que os folículos entram no telógeno. A ativação de células-tronco epiteliais raramente cicladas localizadas na região do bojo dos folículos torna a regeneração folicular no início da próxima fase anágena [4]. A progênie de células-tronco forma uma nova matriz folicular durante a fase anágena inicial, e a haste do cabelo e a bainha radicular interna são derivadas dessas células da matriz relativamente indiferenciadas [5]. É bem conhecido que o tamanho do folículo piloso e a duração da fase anágena determinam o tamanho (diâmetro) e o comprimento da haste capilar, respectivamente. Este crescimento cíclico do cabelo é regulado por diversos fatores de crescimento.

Minoxidil, finasterida e propecia estão comercialmente disponíveis para retardar a perda de cabelo e facilitar o crescimento do cabelo. O minoxidil como vasodilatador exerceu um efeito colateral para facilitar o crescimento do cabelo [6], o que pode ser devido às suas atividades de fornecimento de nutrientes e abertura de canais de potássio [7,8]. Minoxidil é eficaz para alopecia androgênica, entre outros tratamentos de calvície, embora sua eficácia desapareça meses após a interrupção do tratamento. Em comparação, a finasterida e a propecia, terapêuticas da hiperplasia prostática benigna e do câncer de próstata, foram registradas em muitos países para alopecia androgenética (calvície de padrão masculino). Finasterida e propecia são antiandrogênicos sintéticos, inibindo a 5- redutase tipo II, uma enzima que converte a testosterona em diidrotestosterona (DHT) nas células da papila na parte inferior dos folículos pilosos [9]. Laminaria japonica, Undaria pinnatifida e Cladosiphon okamuranus, amplamente distribuídos em muitos países, têm sido utilizados como terapêutica na medicina oriental por um longo período. Em estudos anteriores, o fucoidan, um complexo polissacarídeo de sulfato, havia sido extraído e identificado das algas marinhas e confirmado possuir atividades antioxidantes, anticoagulantes, anticancerígenas e anti-inflamatórias [10,11]. Depois disso, os efeitos benéficos do fucoidan em doenças inflamatórias, isquemia, disfunção imune e tumores foram demonstrados [12,13]. Por outro lado,Extrato de Cistanche tubulosa(CTE) também tem sido amplamente utilizado para medicamentos tradicionais na China. CTE melhora o fluxo sanguíneo, diminuindo os níveis de colesterol no sangue [14]. Recentemente, foi relatado que a CTE diminuiu a produção de fator de necrose tumoral- (TNF-) e interleucina-4 (IL-4), que são os principais fatores para a produção de óxido nítrico (NO) na via inflamatória [15]. Também demonstramos que o fucoidan do extrato de Laminaria japonica (LJE) e CTE atenuaram sinergicamente a inflamação in vitro e in vivo [16]. Notavelmente, foi demonstrado que havia uma estreita associação de inflamação da pele (especialmente da glândula lacrimal) com alopecia [17]. Assim, os aspectos anti-inflamatórios do tratamento da alopecia estão surgindo [18]. Com base nas atividades de melhoria no fluxo sanguíneo e na inflamação, investigamos a eficácia da combinação de LJE e CTE no crescimento do cabelo e mecanismo(s) subjacente(s), em comparação com 3% de Minoxidil (Hyundai Pharmaceutical, Seul, Coréia), um conhecido potenciador de crescimento.

CistancheExtrair anti-queda de cabelo

Materiais e Métodos

Materiais

LJE e CTE foram obtidos de Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Coréia). O pó seco de Laminaria japonica foi extraído em água purificada a 60oC por 24 horas, filtrado através de uma membrana de 0,45 µm, desinfetado e seco por pulverização. Cistanche tubulosa foi extraída em etanol a 80%, desinfetada, concentrada e seca. LJE e CTE foram mantidos a 4oC, misturados (1:3) e dissolvidos em água purificada antes do uso e administrados por via oral em um volume de 5 mL/kg.

Animais

Camundongos machos C57BL/6 para estudo de crescimento capilar e camundongos ICR machos para estudo de inflamação foram adquiridos da Daehan Biolink (Eumseong, Coréia) e alojados em uma sala com condições ambientais constantes (23±2ºC; 45-65 por cento de umidade relativa ; 12-horas ciclo claro-escuro; 150-300 lux brilho). A ração granulada e a água purificada estavam disponíveis ad libitum. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Chungbuk National University (CBNU), Coréia, e conduzidos de acordo com os Procedimentos Operacionais Padrão (SOP) do Centro de Pesquisa em Animais de Laboratório, CBNU.

Tratamento para o crescimento do cabelo

Após a confirmação da fase anágena pela observação da cor da pele homogênea rosada na pele do dorso de camundongos C57BL/6 (6 semanas de idade, n=8/grupo) após o corte na fase telógena, o cabelo foi raspado [1 ,19,20]. A partir do dia seguinte, camundongos sem arranhões visíveis foram selecionados e tratados oralmente com LJE (18 ou 54 mg/kg), CTE (54 ou 162 mg/kg), ou sua mistura (18 mais 54 ou 54 mais 162 mg/kg) uma vez por dia durante 21 dias. Baixas doses de LJE (18 mg/kg) e CTE (54 mg/kg) foram de doses humanas estimadas de 100 mg/corpo (70 kg) e 300 mg/corpo após tradução da área de superfície do peso corporal (Km{{23} } para humano/Km=3 para mouse), respectivamente. Altas doses de LJE e CTE foram estabelecidas em 3 vezes, isoladamente ou em combinação, para avaliar os efeitos sinérgicos máximos [16]. Minoxidil (3 por cento, 0,2 mL) foi aplicado topicamente uma vez ao dia na pele raspada no mesmo esquema do tratamento com LJE/CTE.

Observação grosseira do crescimento do cabelo

Em dias com intervalos de 3-dias após o barbear e durante o tratamento, os camundongos foram levemente anestesiados com éter dietílico e as fotos foram tiradas em suas costas. A proporção de crescimento do cabelo (área rebrotada/área raspada) nas fotografias foi analisada usando um sistema computadorizado de análise de imagem (Imageinside, Daejeon, Coréia).

Exame microscópico dos folículos pilosos

Nos dias 14 e 21, os camundongos foram sacrificados por anestesia profunda com éter dietílico e suas peles dorsais foram removidas [1]. A pele dorsal foi cortada em duas partes. Secções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (5 µm de diâmetro) de uma parte foram coradas com hematoxilina-eosina para examinar o número de folículos pilosos e os achados histológicos. A outra parte do tecido foi congelada em nitrogênio líquido para ensaio enzimático e imunoensaio.

Ensaio de atividade enzimática

O tecido da pele foi homogeneizado em 4 volumes de tampão fosfato (pH 7,4). O homogenato foi centrifugado a 3,000 rpm por 20 min, e o sobrenadante foi usado para o ensaio das atividades de -glutamil transpeptidase (-GTP) e fosfatase alcalina (ALP) usando p-nitrofenol fosfato (PNPP)-DEAV como substrato [1,21].

Quantificação de fatores de crescimento

O fator de crescimento epidérmico (EGF) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foram quantificados usando kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) (R&D Systems, Minneapolis, EUA) de acordo com as instruções do fabricante [1,22].

Tratamento para inflamação

Camundongos ICR (7 semanas de idade, n=8/grupo) foram tratados oralmente com LJE (18 ou 54 mg/kg), CTE (54 ou 162 mg/kg), ou sua mistura (18 mais 54 ou 54 mais 162 mg/kg) uma vez ao dia por 7 dias [16]. No 1º dia de tratamento com LJE e CTE, os camundongos foram injetados subcutaneamente com 10 mL de ar estéril na parte de trás para formar uma bolsa [16,23,24]. Após 2 e 5 dias, a bolsa foi reinjetada com 5 mL de ar. Uma hora após o tratamento final com LJE e CTE, 1 mL de carragenina (1 por cento em solução salina; Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) ou seu veículo (solução salina) foi injetado na bolsa.

Análise dos exsudatos

A bolsa de ar foi lavada com 1 mL de solução salina fria 6 horas após a injeção de carragenina, e o volume líquido

de fluido de lavagem foi registrado [16]. Os números totais de células inflamatórias incluindo neutrófilos, monócitos e linfócitos foram determinados usando um contador de colter. As concentrações de NO e prostaglandina E2 (PGE2) foram determinadas pelo reagente de Griess (Sigma-Aldrich) e

imunoensaio enzimático (EIA) usando um kit Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, EUA), respectivamente [16].

Cistancheextrair anti-envelhecimento e anti-queda de cabelo

Análise estatística

Os dados são apresentados como média±erro padrão. A significância estatística foi determinada pela análise de variância de uma via, seguida pelo teste posthoc de comparação múltipla de Tukey. Valores P<0.05 were="" considered="" to="" be="" statistically="">

Resultados

A aplicação de Minoxidil (3 por cento), um material de referência, facilitou marcadamente o crescimento do cabelo de camundongos C57BL/6, exibindo uma cobertura quase total (92,4 por cento) da área raspada (Figuras 1, 2B) em comparação com os 29,2 por cento no normal crescimento (Figuras 1, 2A) no dia 21. Embora menos eficaz do que a aplicação de Minoxidil, o tratamento oral de LJE também facilitou o crescimento do cabelo, levando a 33,5 e 69,1 por cento de cobertura em 18 e 54 mg/kg, respectivamente (Figuras 1, 2C, 2D). O CTE também foi eficaz em aumentar o crescimento do cabelo, atingindo 73,6 e 80,4 por cento

cobertura em 54 e 162 mg/kg, respectivamente (Figuras 1, 2E, 2F). Notavelmente, a terapia combinada com altas doses de LJE (54 mg/kg) e CTE (162 mg/kg) aumentou notavelmente o crescimento do cabelo a partir do dia 12, comparável ao efeito do Minoxidil (Figuras 1, 2H), embora baixas doses de LJE (18 mg/kg) e CTE (54 mg/kg) exercem efeito sinérgico apenas na fase inicial (Figuras 1, 2G).

Comparado aos folículos capilares normais (Figura 3A), a aplicação de Minoxidil melhorou a integridade dos folículos capilares, mostrando folículos maiores e hastes capilares mais espessas (Figura 3B). Tais efeitos também foram encontrados nas peles de camundongos tratados com LJE e/ou CTE (Figuras 3C-3H). Especialmente, a eficácia de fortalecimento do folículo piloso do tratamento combinado de LJE e CTE foi comparável à do Minoxidil.

A aplicação de minoxidil aumentou a atividade de -GTP que induz os folículos capilares à fase anágena em 90-120 por cento

nos dias 14 e 21, em relação ao nível da pele normal (Figura 4). LJE (54 mg/kg) também aumentou a atividade enzimática, embora tenha havido grandes variações. CTE exerceu efeitos semelhantes, aumentando significativamente a atividade de -GTP no dia 14. Curiosamente, o tratamento combinado de LJE e CTE aumentou ainda mais a atividade da enzima mais do que quando os extratos foram usados ​​sozinhos.

A atividade da ALP, um marcador de crescimento ósseo e angiogênese, aumentou significativamente na pele nos dias 14 e 21 após a aplicação tópica de Minoxidil (Figura 5). LJE e CTE também aumentaram a atividade da ALP após administração oral de maneira dose-dependente. Notavelmente, a atividade da enzima foi sinergicamente aumentada pelo tratamento combinado com LJE e CTE.

Na análise do EGF, um conhecido fator de crescimento capilar, a aplicação de Minoxidil melhorou o nível de EGF

3,5 vezes o controle normal nos dias 14 e 21 (Figura 6). O LJE (18 mg/kg) aumentou o EGF apenas no dia 21, enquanto o CTE (162 mg/kg) aumentou bastante sua produção nos dias 14 e 21. É interessante notar que o tratamento combinado de LJE e CTE mesmo no doses baixas exibiram efeitos sinérgicos marcantes.

O tratamento com minoxidil também aumentou o nível de VEGF em 50-80 por cento acima do valor de controle (Figura 7). Embora o LJE tenha sido ineficaz, o CTE exerceu notáveis ​​efeitos de aumento. Além disso, a terapia combinada de LJE e CTE apresentou uma atividade sinérgica na fase inicial no dia 14.

A injeção de carragenina na bolsa de ar de camundongo ICR aumentou o volume de exsudato dentro da bolsa 6 vezes o nível de controle (Tabela 1). Essa exsudação aumentada foi significativamente atenuada pelo tratamento com LJE (18 e 54 mg/kg) ou CTE (54 e 162 mg/kg). Notavelmente, o tratamento combinado com LJE e CTE diminuiu ainda mais

o volume de exsudato, em comparação com os efeitos individuais. O número de células inflamatórias foi drasticamente aumentado pela injeção de carragenina: 34,6, 4,2 e 24,9 vezes os níveis de controle para neutrófilos, monócitos e linfócitos, respectivamente (Tabela 1). No entanto, LJE e CTE reduziram significativamente as células inflamatórias de maneira dose-dependente, em que LJE foi um pouco superior ao CTE. Espera-se que os efeitos sinérgicos na infiltração de células inflamatórias sejam alcançados pela co-administração de LJE e CTE.

Em paralelo com a infiltração de células inflamatórias na bolsa, os conteúdos de NO e PGE2 na bolsa também aumentaram drasticamente após a injeção de carragenina (Tabela 1). Em comparação com o efeito leve do LJE,

CTE reduziu acentuadamente a concentração de NO. O tratamento combinado de LJE e CTE diminuiu ainda mais o nível de NO de maneira dose-dependente. De maneira semelhante, o aumento do nível de PGE2 foi sinergicamente

suprimida pela terapia combinada de LJE e CTE (Tabela 1).

Cistancheextrair melhoraimunidadee previne a queda de cabelo

Discussão

A cabeça humana tem uma média de 100,000 folículos capilares.

Durante a vida, cada folículo cresce e cai cerca de 20 vezes, mostrando uma perda diária de cabelo de 100 fios [25]. A perda de cabelo, incluindo alopecia e calvície, é uma condição angustiante para homens e mulheres, especialmente na sociedade moderna. Portanto, é de grande importância o desenvolvimento de novas terapias que previnam a queda de cabelo e melhorem o tratamento capilar; ou seja, a exsudação vascular e a infiltração de células inflamatórias foram suprimidas sinergicamente. Na análise quantitativa, os principais mediadores inflamatórios NO e PGE2 foram substancialmente controlados após a coadministração oral de LJE e CTE. Curiosamente, uma vez que o LJE apresentou atividade anti-inflamatória superior à do fucoidano semi-purificado [16], supõe-se que possa haver um ingrediente ativo adicional, além do fucoidano, no LJE.

Tomados em conjunto, os resultados indicam que o tratamento oral combinado com LJE e CTE melhora a perda de cabelo através da regulação dos fatores de crescimento e atividades enzimáticas relacionadas e em parte através do potencial anti-inflamatório. Portanto, sugere-se que uma combinação incluindo LJE e CTE em doses e proporções clínicas apropriadas pode ser uma receita candidata para pacientes com perda de cabelo.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Leading Industry Development for Economic Region of the Chungcheong Leading Industry Office, Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) e Ministério da Economia do Conhecimento (MKE), e em parte pelo High Value-Added Food Technology Development Program , Ministério da Agricultura, Alimentação e Assuntos Rurais (MAFRA; subvenção número 113034-3).

Conflito de interesses Os autores declaram que não há conflito de interesse financeiro para publicação destes resultados.

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