Efeito de Runing II no crescimento e metástase de tumor transplantado em camundongos portadores de câncer mamário e seu mecanismo

Objetivo:

Estudar o efeito de Runing II (uma preparação à base de plantas chinesa para câncer de mama) no crescimento e metástase de tumores transplantados de camundongos TA2 portadores de câncer de mama MA-891-e seu mecanismo. Métodos: O modelo de câncer mamário MA-891 cepa celular transplantada de camundongos TA2 com metástase pulmonar foi desenvolvido para observar o efeito de Runing II no crescimento e metástase do tumor transplantado. O método imuno-histoquímico e análise de imagem foram adotados para detectar os níveis de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), contagem de microvasos (MVC) e área de microvasos (MVA).

Resultados: No grupo Running II, a taxa de inibição do peso do tumor e a taxa de inibição da metástase pulmonar foram de 37,3 por cento e 65,4 por cento, respectivamente, o crescimento do tumor e a metástase pulmonar foram obviamente inibidos; E os níveis de VEGF e VEGFR, MVC e MVA diminuíram significativamente em comparação com os do grupo de controle com tumor (P<0.05). Conclusion: The Chinese herbal preparation Running II can inhibit the metastasis of tumors by inhibiting angiogenesis, and the mechanism is possibly related to the down-regulation of VEGF and VEGFR expression.

Além disso, ao mesmo tempo em que pesquisamos, descobrimos que a echinacea em Cistanche tem um efeito antitumoral. Para a aplicação de equinacosídeo em drogas antitumorais, a presente invenção primeiro adiciona MTH1, pirofosfatase inorgânica e dGTP à solução de reação (100mM pH 8,0 ácido tris-acético, 40mM NaCl, 10mM acetato de magnésio, 0,005 por cento Tween20 e 1mMDTT) No método, a enzima e o substrato foram incubados à temperatura ambiente durante 1 hora e, em seguida, 25 ul da solução de verde de malaquita foram adicionados para terminar a reação. A absorbância foi detectada em 630 nm com um leitor de microplacas BIO‑RAD iMark. Os resultados mostraram que o equinacosídeo teve um efeito inibitório significativo na atividade da enzima MTH1; Em segundo lugar, o efeito do equinacosídeo nas células tumorais no nível celular foi detectado pelo ensaio MTT, e os resultados mostraram que o equinacosídeo pode inibir significativamente o crescimento de células de câncer de cólon SW480 e células de osteossarcoma humano U2OS, e a presente invenção inibiu o crescimento de equinacosídeo A MTH1, uma enzima específica que mantém a sobrevivência nas células tumorais, leva à incorporação de nucleotídeos oxidados no DNA, causando quebras letais na fita dupla do DNA nas células cancerígenas, produzindo efeitos antitumorais. A nova aplicação médica estabelecerá as bases para o desenvolvimento de novos medicamentos antitumorais no futuro.

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Palavras-chave:

tumor mamário; angiogênese; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); Running II (uma preparação de ervas chinesas para câncer de mama)

O câncer de mama é um tumor maligno que ameaça gravemente a saúde feminina e a incidência da doença ocupa o primeiro lugar entre os tumores malignos femininos, com tendência a aumentar ano a ano. Embora seus métodos terapêuticos tenham feito alguns avanços, a taxa de sobrevida em longo prazo para o paciente com câncer de mama não foi elevada devido ao crescimento invasivo e à metástase dos tumores. A angiogênese dos tumores é uma condição básica para o crescimento, invasão e metástase dos tumores.

Portanto, a inibição da angiogênese de tumores é uma forma eficaz de prevenir a produção e desenvolvimento de tumores e prolongar a vida do paciente.1 No presente estudo, o mecanismo da droga chinesa Running II com funções de suplementar o qi e nutrir o yin, regulação de vasos de passagem e concepção, resolução de massa e desintoxicação na inibição de tumor e anti-metástase foi estudada a partir da angiogênese e seus fatores reguladores no tumor transplantado de câncer mamário MA-891 de camundongos TA2 com metástase pulmonar.

MATERIAIS

Sessenta camundongos fêmeas SPF TA2, pesando (20 ± 2) g, com idade 6-8 semanas, foram adquiridos do Departamento de Animais de Laboratório, Universidade de Ciências Médicas de Tianjin. A linhagem de células MA-891 de câncer mamário do camundongo foi fornecida pelo Prof. Luo Liqin, do Laboratório Patológico, Instituto de Tumores, Academia Chinesa de Ciências Médicas.

Runing II é composto por Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae), Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Yi Yi Ren ( Semen Coicis), Yin Yang Huo (Herba Epimedii), Dang Gui (Radix Angelicae Sinensis), etc., com proporção de dose de 1,67: 1,67: 1,33: 1,33: 1,33: 1,33: 1,33: 1, que foram preparados uma decocção pelo Secção de Farmácia do Hospital Longhua, de acordo com uma técnica tradicional, e mantida a 4ć para utilização; Ciclofosfamida (CTX, 200 mg/ampola, número da filial: 981104) e tamoxifeno (TAM) foram produzidos por Shanghai Hualian Pharmaceutical Co. Ltd.; A solução salina normal foi produzida pela Shanghai Fumin Pharmaceutical Co.

Anticorpo policlonal do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (diluições de trabalho 1:25–1:50), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR, diluições de trabalho 1:30–1:50) e anticorpo policlonal FVIIIAg (diluição de trabalho 1:50 ) foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology Inc; O segundo anticorpo EnVision, anticorpo de coelho anti-VEGF de rato, anticorpo de cabra anti-coelho FVIII Ag e anticorpo de cabra anti-VEGFR de coelho e o kit EnVision foram adquiridos da Dako Co., Dinamarca; 3,3- Diaminobenzidina (DAB) foi comprada da Shanghai Huamei Bioengineering Factory.

MÉTODOS

Desenvolvimento de modelo animal

O modelo animal foi desenvolvido com inferência aos métodos de Luo e Gao, et al.2,3. Células MA-891 de câncer mamário cultivadas in vitro do camundongo em uma fase de sobrevivência logarítmica foram selecionadas e a concentração de células foi regulada como 1x107 /ml. Sob as condições assépticas, as células de câncer de mamífero foram inoculadas na parte subcutânea da axila direita do camundongo TA2 (0,2 ml/camundongo, ou seja, 2X106 células/camundongo).

Agrupamento de animais e métodos de administração

Dois dias após a inoculação, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos, 15 camundongos em cada grupo. 1) Grupo de controle portador de tumor: 0,4 ml de solução salina normal foram administrados por via intragástrica, uma vez por dia, cinco vezes por semana. 2) Grupo Runing II: Runing II foi diluído com solução salina normal e 0.4 ml desta diluição correspondendo a 48 g·kg{{10}}·d-1 que foi calculado de acordo com a tabela anexa "Tabela de conversão entre áreas de superfície corporal humana e animal" em "Metodologia de estudos sobre farmacologia de drogas chinesas"4 foi administrado por via intragástrica, uma vez ao dia, cinco vezes por semana. 3) Grupo de controle CTX: Sobre a dosagem usada por Jiang Bo,5 CTX foi diluído com solução salina normal, e 0.4 ml correspondente a 50 mg·kg-1·d-1 foi administrado por via intragástrica, uma vez em dias alternados, três vezes por semana. 4) Grupo de controle TAM: TAM foi diluído com solução salina normal e 0,4 ml correspondente a 2,7 mg·kg-1·d-1 foi administrado por via intragástrica, uma vez ao dia, cinco vezes por semana. As drogas foram dadas por 3 semanas em todos os quatro grupos.

Amostragem

No 22º dia após a administração, os camundongos foram sacrificados por deslocamento das vértebras cervicais e pesados. Em seguida, a massa tumoral e o pulmão foram retirados e pesados, respectivamente. O peso corporal real do camundongo=o peso corporal ponderado – o peso do tumor. Nódulos cinzentos na superfície pulmonar, ou seja, focos de metástase, foram contados a olho nu. A massa tumoral foi colocada em uma solução de formaldeído neutro a 10% para fixação, seguida de inclusão em parafina, corte ultrafino, esforço imuno-histoquímico Envision em duas etapas e determinação de VEGF, VEGFR, contagem de microvasos (MVC) e área de microvasos (MVA).

A taxa de inibição do peso do tumor

A taxa de inibição do tumor=(peso médio do tumor do grupo de controle após o tratamento - peso médio do tumor do grupo de medicação após o tratamento)/peso médio do tumor do grupo de controle após o tratamento × 100 por cento.

A taxa de inibição da metástase pulmonar

A taxa de inibição de metástase pulmonar=(número médio de nódulo de metástase pulmonar do grupo de controle - número médio de nódulo de metástase pulmonar do grupo de medicação)/número médio de nódulo de metástase pulmonar do grupo de controle x 100 por cento.

Imuno-histoquímica Envision coloração em duas etapas

Foi feito o corte de parafina de 4 μm, seguido de desparafina de rotina com xileno, desidratação em gradiente e lavagem com PBS, 5 min x 3 vezes; a seção foi imersa em 0.01 mol/L, tampão citrato pH 6,0, colocada em forno de micro-ondas de 98ºC por 10 min para reparo antigênico e resfriada naturalmente à temperatura ambiente após retirada do forno de micro-ondas; gotejamento do primeiro anticorpo (acima mencionado anticorpo e diluição do anticorpo correspondente respectivamente), 37ć, 90 min, lavagem com PBS, 5 min x 3 vezes; gotejamento do segundo anticorpo Envasion, em temperatura ambiente por 60 min, lavando com PBS, 5 min x 3 vezes; gotejamento da solução de revelação de cor DAB recém-preparada, controle da revelação de cor por 3 a 10 min sob um microscópio, contracoloração por 45 s com campeachy, enxágue com água corrente, secagem com soprador, montagem com goma neutra. A célula com citoplasma de grânulos marrom-amarelo ou preto-marrom foi considerada positiva. A seção positiva conhecida de câncer mamário foi usada como controle positivo, e aquela em que o tampão PBS substituiu o primeiro anticorpo foi usada como controle negativo.

Análise de imagem

Câmera de vídeo ACE (resolução de 930 linhas) e analisador de imagem LEICAQ500W e sistema de análise de imagem totalmente automático LEICA foram usados. Sob um microscópio x 200, 2 campos de visão em cada seção foram selecionados aleatoriamente para a determinação de VEGF ou 3 campos de visão para a determinação de VEGFR e MVA, e a porcentagem de área positiva para toda a área do campo de visão foi calculada em todos os grupos . Para determinação de MVC, 5 regiões com os vasos sanguíneos mais ricos foram selecionadas em cada seção sob um microscópio x 100, e então sob x 400 os microvasos em cada campo de visão de 5 regiões sem sobreposição foram contados e a média foi usada como um contador médio de microvasos (MVC) do tumor.

método estatístico

O software SPSS8.0 foi utilizado e o teste do qui-quadrado foi utilizado para a comparação entre as taxas, e um teste t ou ANOVA one-way foi utilizado para a comparação de médias.

RESULTADOS

Efeitos inibidores de tumor e anti-metástase de Running II no tumor transplantado de câncer mamário MA-891-camundongos TA2 com metástase pulmonar

It was shown in Table 1 that the tumor weight inhibition rate was 37.3% in the Runing II group and 86.2% in the CTX control group, both tumor inhibition rates being >30 por cento, com diferença significativa (ambos P<0.05) as compared with both tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor-inhibiting effect. And there was a significant difference (P<0.05) between the Runing II group and the CTX control group in the tumor inhibition rate, indicating that the tumor-inhibiting effect of Runing II was lower than that of CTX. The lung metastasis inhibition rate was 65.4% in the Runing II group and 43.9% in the CTX control group, with significant difference (both P<0.05) as compared with a tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor metastasis-inhibiting action. And there was a significant difference between the Runing II group and the CTX control group (P<0.05) in the lung metastasis inhibition rate, suggesting that the anti-metastasis action of Runing II is superior to that of CTX.

Efeitos da Corrida II nas expressões de VEGF e VEGFR no tumor transplantado de camundongos TA2 portadores de MA-891-

Conforme mostrado na Tabela 2, as expressões de VEGF e VEGFR no grupo Running II e no grupo controle CTX foram significativamente menores do que no grupo controle portador de tumor (P<0.05), with a significant difference between the two. In the Running II group, the VEGF and VEGFR expressions were not significantly different from those in the CTX control group (P>00,05), a expressão de VEGF foi significativamente menor do que no grupo de controle TAM (P<0.05), and the VEGFR expression was similar to that in the TAM control group (P>0.05). In the CTX control group, the VEGF and VEGFR expression was lower than those in the TAM control group. In the TAM control group, the VEGF expressions were similar to that in the tumor-bearing control group (P>00,05), e a expressão de VEGFR foi menor do que no grupo de controle portador de tumor (P<0.05).

Efeito da Corrida II em MVA e MVC do tumor transplantado em camundongos TA2 portadores de MA-891-

Conforme mostrado na Tabela 3, os níveis de MVA e MVC no câncer transplantado nos grupos de medicação foram significativamente menores do que no grupo de controle com tumor (P<0.05); in the Running II group, the levels of MVA and MVC were significantly higher than those in the CTX control group (P<0.05), the level of MVC was lower than that in the TAM control group (P<0.05), and the MVA level was similar to that in the TAM control group (P>0.05).

DISCUSSÃO

A medicina tradicional chinesa sustenta que a gênese e o desenvolvimento do tumor resultam dos efeitos abrangentes de fatores idiopáticos e empáticos, mas com ênfase nos primeiros. Em um estudo clínico anterior, o Prof. Lu e Tang sustentaram que a deficiência de qi vital no interior e a desarmonia dos vasos de passagem e concepção são as principais causas da gênese do tumor, e a invasão interna, movimentação e disseminação de patógenos de câncer são as principais condições de crescimento e metástase de câncer mamário.6 Portanto, no tratamento, eles defendem a nutrição do qi vital e a remoção de massas. Running II é uma fórmula de ervas chinesas que é resumida através da prática clínica de muitos anos de acordo com o princípio de tratamento de fortalecer a resistência do corpo primeiro e eliminar os fatores patogênicos em segundo lugar. Na fórmula, Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), Yin Yang Huo (Herba Epimedii) são ingredientes soberanos, com efeitos de suplementar o qi e nutrir o yin, regulando vasos de passagem e concepção, o que está em conformidade com as características comumente vistas de câncer mamário, como deficiência de qi e yin e desarmonia dos vasos de via e concepção. Clinicamente, esta fórmula alcança o efeito óbvio de prolongar o tempo de sobrevida, aumentando a qualidade de vida, estabilizando o foco do tumor e prevenindo a metástase do câncer.

O presente estudo estabeleceu o modelo de câncer mamário MA-891 cepa de células tumorais transplantadas de camundongos TA2 com metástase pulmonar e observou o efeito da Corrida II no crescimento do tumor sólido e metástase pulmonar, e descobriu que havia diferenças significativas no tumor taxa de inibição e a taxa de inibição de metástase pulmonar entre o grupo Running II e o grupo com tumor, e entre o grupo Running II e o grupo de controle CTX, mostrando que Running II tem funções óbvias de inibição do crescimento tumoral e anti-metástase. Além disso, o tamoxifeno (TAM) não tem a função óbvia de inibir o crescimento do tumor e anti-metástase nos camundongos modelo, sendo semelhante ao resultado de que o câncer mamário MA-891 é uma cepa de células ER e o relatório sobre ação direta de baixa concentração da TAM no exterior.7

O tumor é uma doença vaso-dependente típica, e seu crescimento, infiltração e metástase dependem da angiogênese. Ao mesmo tempo, a neovascularização fornece novamente um canal de metástase para as células tumorais, criando condições favoráveis ​​para o crescimento, metástase e difusão do tumor. 8, 9 O VEGF é um fator pró-angiogênico com ação mais forte, única e específica nas células endoteliais vasculares, e muitas células tumorais podem secretar VEGF, que aumenta a permeabilidade vascular e atua diretamente nas células endoteliais vasculares por meio da ligação ao receptor VEGF, estimulando sua divisão e proliferação, induzindo a angiogênese do tumor e influenciando o número de microvasos, para promover o crescimento e a metástase do tumor.10,11 A maioria das células tumorais tem alta expressão de VEGF, enquanto nos tecidos normais, apenas um pequeno número de órgãos, como o rim, ovário, etc., têm maior expressão de VEGF. Portanto, alguns estudiosos sustentam que o VEGF pode ser usado como marcador de metabolismo tumoral e metástase12 e parte alvo mais ideal para bloquear a neoangiogênese em tumores,13 e interferir em fatores reguladores vasculares de tumores e seu elo atuante, regulando a expressão de fatores de angiogênese e a inibição da angiogênese possivelmente controla o crescimento e a metástase do tumor.

Os resultados no presente estudo indicam que o Runing II pode regular negativamente as expressões de VEGF e VEGFR para possivelmente bloquear a condução do sinal de migração induzida por VEGF e proliferação de células endoteliais e inibir ainda mais a angiogênese em tumores, exercendo, portanto, efeitos antineoplásicos e anti-metástases .

Estudos anteriores mostraram que, no curso do crescimento de tumores malignos, o crescimento rápido demais do tecido inevitavelmente induziu grave anóxia do tecido local, e a anóxia poderia estimular a síntese de VEGF mRNA e retardar a degradação do VEGF mRNA para induzir a gênese de um grande número de novos vasos capilares locais.14,15 Na observação de células de coloração positiva imunohistoquímica, os autores encontraram expressão óbvia de VEGF no citoplasma de células tumorais necróticas moribundas, ao contrário, menos ou nenhuma expressão de VEGF em células tumorais com proliferação ativa , que pode estar relacionado a um maior nível de fator indutor de anóxia nas células tumorais, de acordo com o relato de Talks KL, et al.16 Running II contém Dang Gui (ᔧᔦ Radix Angelicae Sinensis), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Sheng Yi Yi Ren (Sêmen Coicis), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae), etc., que funcionam ativando a circulação sanguínea, resolvendo o catarro e removendo turvação. Eles inibem a síntese e a secreção de VEGF possivelmente através da melhoria da microcirculação local do tumor, aumentando o suprimento de oxigênio para as células tumorais, inibindo assim o crescimento do tumor para realizar anti-metástase.

REFERÊNCIAS

1.Folkman J. Angiogênese e câncer de mama. J Clin Oncol 1994; 12: 441-443.

2. Pesquisa de Folkman J. Angiogênese: do laboratório à clínica. Fórum (Gênova) 1999; 9: 59-62.

3. Potgens AJ. A expressão do fator de permeabilidade vascular influencia a angiogênese tumoral em linhagens de melanoma humano xenoenxertadas em camundongos nus. Am J Pathol 1995; 5: 775-782.

4. Sauter ER, Nesbit M, Watson JC, et al. O fator de crescimento endotelial vascular é um mercado de invasão tumoral e metástase em carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoço. Clin Cancer Res 1999; 5: 775-782.

5. Warren RS, Yuan H, Matli MR, et al. Regulação pelo fator de crescimento endotelial vascular por hipóxia. J Biol Chem 1996; 271: 2746-2753.

6. Levy AP, Levy NS, Goldberg MA. Regulação pós-transcricional do fator de crescimento endotelial vascular por hipóxia. J Biol Chem 1996; 271: 2746-2753.

7.Talks KL, Turley H, Gatter KC, et al. A expressão e distribuição dos fatores induzíveis por hipóxia HIF-1 alfa e HIF-2 alfa em tecidos humanos normais, cânceres e macrófagos associados a tumores. Am J Pathol 2000; 157: 411-421.

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