Efeito dos extratos de Cistanche Tubulosa na função reprodutiva masculina em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina-nicotinamida-Ⅱ

3.2. Análise In Vivo

3.2.1. Efeitos do CTE no peso corporal e na ingestão de calorias

Após 6 semanas de experimentação, o grupo diabético (HFD-DM) apresentou maior peso corporal que o grupo controle. O grupo HFD-DME4 apresentou peso corporal menor que os grupos HFD-DM e HFD-DMER (Figura 7a). A ingestão calórica do grupo controle foi significativamente menor do que nos outros grupos. Não houve diferença significativa entre a ingestão calórica dos outros cinco grupos (Figura 7b).

3.2.2. Teste oral de tolerância à glicose (OGTT) para determinar a indução bem-sucedida do diabetes

O teste oral de tolerância à glicose (TOTG) é utilizado como uma ferramenta promissora para detecção de diabetes mellitus. Níveis aumentados de glicose no sangue indicam condição diabética. Conforme mostrado na Figura 8a, o nível de glicose plasmática foi menor nos grupos CTE do que no grupo DM em 0, 30, 90 e 120 min. Além disso, a área sob a curva (AUC) da concentração de glicose plasmática mostrou que nos grupos CTE e RSG, a taxa de captação de glicose no sangue estava aumentada (Figura 8b).

3.2.3. Conteúdo total de glicose plasmática, colesterol e triglicerídeos

A glicemia plasmática de jejum foi maior no grupo DM e menor no grupo DME2 (exceto controle) do que nos demais. Não houve diferença significativa no colesterol total entre os grupos, exceto no grupo DME4. No grupo DME4, o nível de colesterol foi menor que os demais. O nível de triglicerídeos foi maior no grupo DM e menor no grupo DME4 e o conteúdo de triglicerídeos diminuiu com o aumento da concentração de CTE (Tabela 2). Os resultados mostram que o nível de glicose plasmática, colesterol e triglicerídeos foi maior no grupo DM e o nível diminuiu significativamente no tratamento com CTE.

3.2.4. Níveis plasmáticos de insulina, nível plasmático de leptina e valores de avaliação do modelo de homeostase – resistência à insulina (HOMA-IR)

Os níveis de insulina plasmática, leptina e valores de HOMA-IR são mostrados na Tabela 3. O grupo DM apresentou níveis plasmáticos de insulina e leptina plasmática mais elevados do que o grupo controle. O índice HOMA-IR também foi significativamente maior no grupo DM. Os valores plasmáticos de insulina, leptina e HOMA-IR diminuíram com o aumento da concentração de CTE. A leptina plasmática foi significativamente reduzida nos grupos CTE, mas o grupo de drogas RSG (DMR) não mostrou qualquer diferença significativa em relação ao grupo DM.

3.2.5. Efeito do CTE nos níveis plasmáticos de LH e testosterona em ratos diabéticos

Conforme mostrado na Tabela 4, as concentrações de testosterona em ratos diabéticos (DM) diminuíram significativamente, enquantoas concentrações de testosterona aumentaram significativamenteem várias doses de CTE. Além disso, os resultados mostraram uma ligeira diminuição no nível de LH no grupo DM em comparação com DMR, DME1, DME2 e DME4. A produção de LH foi maior no grupo DME4.

3.2.6. Efeito do CTE nos parâmetros espermáticos de ratos diabéticos

Os resultados experimentais mostraram que o grupo DM teve uma diminuição significativa no número e motilidade dos espermatozoides do que o grupo controle, enquanto a taxa de anormalidade espermática aumentou significativamente no grupo DM. Curiosamente, o número de espermatozoides, a motilidade espermática e a taxa de anormalidade espermática do grupo DMR melhoraram, mas a motilidade espermática não atinge um nível significativo em comparação com DME4. O DME2 apresentou melhor contagem de espermatozóides do que todos eles e a taxa de motilidade aumentou significativamente no grupo DME4. Não houve diferença significativa entre o número de espermatozoides anormais entre os grupos tratados com RSG e CTE (Tabela 5).

3.2.7. Efeito do CTE na morfologia dos túbulos seminíferos em ratos diabéticos

A Figura 9 mostra a coloração H&E da seção testicular. A seta preta indica a célula de Leydig e a seta branca indica a célula de Sertoli. Tanto a célula de Leydig quanto a célula de Sertoli no grupo DM apresentaram atrofia significativa e foi observada uma cavidade no lúmen. A estrutura das células de Leydig e Sertoli foi restaurada nos grupos tratados com CTE e RSG. A espessura do túbulo seminífero foi maior nos grupos CTE e GSR do que no grupo DM.

3.2.8. Efeito do CTE nos MRNAs KiSS1, GPR54, SOCS-3 e SIRT1 no hipotálamo de ratos diabéticos

A expressão de KiSS1 (Figura 10a), GPR54 (Figura 10b), SOCS-3 (Figura 10d) e SIRT1 (Figura 10c) foi mostrada na Figura 10. A expressão de mRNA de KiSS1 e receptor GPR54 em ratos diabéticos foi significativamente menor do que no grupo controle. Os níveis de expressão de mRNA KiSS1 e GPR 54 em DMR, DME1, DME2 e DME4 foram significativamente aumentados. Em particular, a expressão do mRNA do GPR54 foi significativamente aumentada no DME4 e foi quase semelhante ao grupo controle.

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Este experimento explorou ainda mais a quantidade de mRNAs SOCS-3 e SIRT1 no hipotálamo de ratos. A expressão do mRNA SOCS-3 em ratos diabéticos aumentou significativamente, indicando que a impedância da leptina era mais grave. Os grupos DMR, DME1, DME2 e DME4 apresentaram melhorias significativas quando comparados ao grupo diabético. A expressão de mRNA da SIRT1 no grupo DM diminuiu significativamente e aumentou significativamente nos grupos DME1 e DME4.

3.2.9. Efeito do CTE nas enzimas antioxidantes no plasma e testículos de ratos diabéticos

A Tabela 6 mostra que a atividade plasmática de SOD, a atividade de GPx e a atividade de catalase de ratos diabéticos diminuíram significativamente e as atividades aumentaram nos grupos tratados com CTE e RSG. Além disso, o DME4 apresentou melhorias significativas na atividade GPx do que outros. Os resultados mostraram que as atividades da SOD e da catalase nos ratos diabéticos diminuíram significativamente após seis semanas. A atividade de SOD e catalase do grupo DMR não atinge um nível significativo. Os grupos tratados com CTE apresentaram melhorias significativas na atividade da SOD e da catalase. O aumento das atividades de catalase e SOD nos grupos CTE também foi observado nos testículos (Tabela 7). A maior atividade de SOD e catalase foi observada nos grupos DME1 e DME2 respectivamente.

3.2.10. Efeitos do CTE no estresse oxidativo e na inflamação no plasma e testículos de ratos diabéticos

A produção de óxido nítrico (NO) no plasma (Figura 11a) e nos testículos (Figura 11b) foi mostrada na Figura 11. A produção de NO no grupo DM foi significativamente aumentada tanto nos testículos quanto no plasma em comparação ao grupo controle. Uma redução gradual da produção de NO foi observada nos grupos DME1, DME2 e DME4 (no plasma). O grupo DMR também apresentou redução significativa na produção de NO. No caso dos testículos, houve uma ligeira redução na produção de NO nos grupos CTE, enquanto o grupo DMR não reduziu significativamente a produção de NO.

Conforme mostrado nas Figuras 12 e 13, os níveis de TNF- e IL-6 aumentaram significativamente em ratos diabéticos (tanto no plasma quanto nos testículos), indicando que a inflamação é mais grave. No plasma, o nível de TNF- é semelhante nos grupos tratados com CTE e RSG (Figura 12a). Os grupos CTE (especialmente DME2) reduziram significativamente o nível de TNF- nos testículos (Figura 12b). O nível de IL-6 foi significativamente reduzido no plasma dos grupos CTE e RSG (Figura 13a). Nos testículos, houve tendência de redução do nível de IL-6, mas não atingiu nível significativo (Figura 13b).

3.2.1.1. Efeitos da CTE no estresse oxidativo e na inflamação em espermatozóides de ratos diabéticos induzidos por dieta rica em gordura

A Figura 14 mostra o conteúdo de ânion superóxido no esperma de rato. Os resultados mostraram que a produção de ânion superóxido no esperma de ratos diabéticos aumentou significativamente e não houve melhora significativa no grupo DMR. Os grupos DME1 e DME4 apresentaram produção significativamente reduzida de ânion superóxido.

3.2.12. Efeitos do CTE na peroxidação lipídica em espermatozóides de ratos diabéticos induzidos por dieta rica em gordura

Estudos demonstraram que a peroxidação lipídica foi aumentada em pacientes com diabetes tipo 1 e tipo 2 [19]. O nível de malondialdeído (MDA) no plasma, esperma e testículos é mostrado na Tabela 8. O nível de MDA no plasma, testículos e esperma do grupo DM foi significativamente maior e o tratamento com CTE e RSG reduziu a produção de MDA. Uma redução significativa foi observada nos grupos DME4 e DMEI no plasma. Este estudo descobriu que ratos diabéticos não apenas aumentaram o grau de peroxidação lipídica no plasma, mas também aumentaram nos testículos e nos espermatozoides. Melhora significativa foi observada em várias doses de CTE.

4. Discussão

O diabetes é uma doença crônica associada a um alto nível de açúcar no sangue. O desequilíbrio entre os níveis de antioxidantes e ROS levará à condição chamada estresse oxidativo. Superóxido, radical hidroxila, peróxido de hidrogênio, óxido nítrico e oxigênio singlete são alguns dos exemplos de ROS que contribuirão para condições de diabetes por meio do estresse oxidativo [20].Cistanche tubulosaé uma planta do deserto que contém componentes ativos comopolissacarídeos, oligossacarídeos, glicosídeos feniletanóides (equinacósido, verbascósido), ácido palmítico, ácido linoléico, iridóides, alditois e lignanas. Esta planta é capaz de produzir efeitos antiinflamatórios, neuroprotetores, antibacterianos, antivirais, antioxidantes, antitumorais e imunomoduladores [21]. Estudos de literatura mostram que os glicosídeos feniletanóides de Cistanche tubulosa são a principal razão para a atividade antioxidante [22]. O resveratrol (RES) e a rosiglitazona (RSG) foram considerados controle positivo para estudos in vitro e in vivo, respectivamente. O RSG é um poderoso sensibilizador de insulina e tem afinidade com a isoforma do receptor ativado por proliferador de peroxissoma (PPARc). Controla a hiperglicemia em pacientes diabéticos [23]. O RES possui atividade antioxidante natural e atua como vasodilatador, regulando o metabolismo das lipoproteínas, inibindo a agregação plaquetária e prevenindo o câncer [24,25]. Nossa investigação indicou que a ECH apresenta melhor atividade de eliminação de radicais que a CTE e a RES (Figura 1). Entende-se também que a ECH não causa nenhuma toxicidade significativa às células LC-540 e TM3 Leydig (Figura 2).

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AGEs foram usados ​​para induzir condições de estresse em células de Leydig. A produção de AGEs, inflamação, estresse oxidativo e diabetes estão interligados. A condição hiperglicêmica do diabetes promove lesão celular através da produção de AGEs e estresse oxidativo. Os AGEs induzem toxicidade celular, o que promove ainda mais o recrutamento de células imunológicas e a morte celular. Um nível elevado de AGEs promove a expressão de dois tipos de receptores chamados RAGE e AGER1 [26]. O gotejamento e subsequente transferência de um elétron da cadeia respiratória mitocondrial para o oxigênio molecular durante o estresse oxidativo resulta na formação de um ânion superóxido. Nossos resultados mostram que a produção de ânion superóxido induzida por AGEs foi aumentada no grupo controle e melhorias adicionais foram observadas tanto com os tratamentos ECH quanto com RES. De acordo com nosso estudo, entendeu-se que a produção de superóxido (Figura 3) e H2O2 (Figura 4) induzida pelos AGEs estava diminuída na presença de ECH e RES.

O NF-κB é conhecido como o importante mediador da inflamação associada ao diabetes [27]. A expressão de NF-κB leva à disfunção celular e morte celular. A ativação do NF-κB pelo estresse oxidativo estimula a resposta pró-inflamatória, a regulação positiva da endotelina e a apoptose [28]. A expressão de RAGE e NF-κB foi aumentada nos grupos estimulados por AGE e a redução subsequente foi observada nas células tratadas com ECH e RES (Figura 5).

Testosteronaé um esteróide anabolizante e primáriohormônio sexual masculinosintetizado a partir do colesterol. O processo começa com a clivagem oxidativa da cadeia lateral do colesterol pelo gene de clivagem da cadeia lateral do colesterol (CYP11A). Este gene está localizado na membrana mitocondrial e converte o colesterol em pregnenolona. Em seguida, o gene CYP17A1 do retículo endoplasmático remove dois átomos de carbono extras e produz vários esteróides C19. Além disso, a pregnenolona é oxidada para formar androstenediona/progesterona pela hidroxiesteróide desidrogenase (3- -HSD). Finalmente, a testosterona é produzida pela redução do grupo ceto na 17ª posição do carbono da androstenediona pela 17-beta-hidroxiesteróide desidrogenase (17- -HSD). As células de Leydig estão envolvidas na maior produção de testosterona. A transferência de colesterol para a membrana mitocondrial interna requer a ação da proteína reguladora aguda esteroidogênica (StAR). Os estudos atuais mostram que a expressão de StAR, CYP11A1, CYP17A1 e HSD17 3 diminuiu nas células tratadas com AGE (controle) e houve um aumento tremendo nas células tratadas com ECH e RES (Figura 6) . Assim, os resultados mostram que a produção dea testosterona foi aumentada nos grupos tratados com ECH e RES. 

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Durante uma condição diabética, o transporte de glicose para os órgãos é limitado e, como resultado, os níveis de glicose aumentam [29]. Portanto, a condição hiperglicêmica é um dos marcadores importantes para a detecção do diabetes. Nossos estudos mostram que o nível de glicose plasmática foi aumentado nos grupos diabéticos e a AUC do grupo DM foi significativamente maior do que os outros grupos (Figura 8). Juntamente com a glicose plasmática, o conteúdo total de colesterol e triglicerídeos aumentou significativamente no grupo DM (Tabela 2). A aterosclerose é facilitada por um nível aumentado de colesterol e triglicerídeos [30]. No entanto, o nível de colesterol e triglicerídeos diminuiu nos grupos tratados com CTE e RSG. O conteúdo de triglicerídeos do grupo DME4 atingiu valores quase semelhantes aos do grupo controle.

A insulina é um hormônio produzido pelas células do pâncreas e funcionalizado para controlar os níveis de açúcar no sangue no corpo, enquanto a leptina é um hormônio produzido pelos adipócitos que são capazes de regular a ingestão de alimentos e a utilização de energia. Estudos indicaram que a leptina está envolvida na fisiopatologia da obesidade e há uma interação positiva entre leptina e insulina [31]. Nossos estudos mostram que os níveis plasmáticos de inulina e leptina foram maiores no grupo DM e o nível de insulina diminuiu com o aumento na concentração de CTE. O grupo RSG não apresenta diferença significativa em relação ao grupo DM. A resistência à insulina e a função celular foram avaliadas pelo método HOMA-IR. O valor do HOMA-IR aumentou no grupo DM e foi significativamente diferente dos demais grupos (Tabela 3).

O DM afeta a função reprodutiva através da alternância hormonal no eixo HPG e estudos revelaram que a expressão da insulina nos testículos também é afetada pelo diabetes. É caracterizada por vacuolização das células de Sertoli, aumento da fragmentação do DNA, comprometimento da espermatogênese e aumento da depleção de células germinativas. O estresse oxidativo também contribui para anormalidades na função reprodutiva [32]. O processo de formação dos espermatozoides no órgão reprodutor masculino (testículos) é denominado espermatogênese. O testículo é composto de túbulos fortemente enrolados, chamados túbulos seminíferos. As células de Sertoli são vistas nas paredes do túbulo seminífero e fornecem nutrição aos espermatozoides imaturos. A investigação dos parâmetros espermáticos indicou que o número de espermatozoides e a motilidade diminuíram e as anormalidades aumentaram no grupo DM (Tabela 5). Um efeito oposto foi observado nos grupos tratados com CTE e RSG. Tanto as células de Leydig quanto as células de Sertoli no grupo DM apresentaram atrofia significativa e a cavidade foi visualizada no lúmen. A espessura do túbulo seminífero também diminuiu no grupo DM. Um resultado melhorado foi observado nos grupos tratados com CTE e RSG (Figura 9). Além disso, os níveis de LH e testosterona diminuíram no grupo DM e os níveis aumentaram nos grupos tratados com CTE (Tabela 4). Nos homens, a baixa testosterona sérica e a menor frequência de pulso de LH foram frequentemente associadas à obesidade e diabetes mellitus tipo 2 [33].

As Kisspeptinas codificadas pelo gene KiSS1 são conhecidas como potentes estimuladores do eixo HPG e qualquer mutação no gene da Kisspeptina levará a baixos níveis de esteróides sexuais e gonadotrofinas. Estudos mostram que em ratos diabéticos induzidos por STZ, os níveis de mRNA do Kiss1 diminuíram [33]. O início e a manutenção da infertilidade em mamíferos estão ligados ao receptor 54 acoplado à proteína G (GPR54). A mutação no GPR 54 é caracterizada pela ausência de maturação sexual e baixos níveis de hormônios gonadotrópicos (LH e FSH). Citocinas pró-inflamatórias, como IL -6 e TNF, regulam positivamente a expressão do supressor da sinalização de citocinas 3 (SOCS3) implicado na resistência à insulina mediada por inflamação no fígado e nos adipócitos [34]. SIRT 1 é um gene associado à regulação de diversas doenças do envelhecimento. Este gene é expresso de forma proeminente nas células do pâncreas e regula a secreção de insulina e previne a apoptose. Estudos atuais indicaram que a expressão de KiSS1, GPR54 e SIRT1 diminuiu no grupo DM, mas a expressão aumentou nos grupos tratados com CTE (Figura 10). Um aumento nas expressões SOCS-3 no grupo DM indica o quadro inflamatório. A primeira ligação molecular identificada entre obesidade e inflamação foi o TNF-. Conseqüentemente, um nível aumentado de TNF- é um indicador de inflamação. A diminuição do nível de citocinas pró-inflamatórias, como TNF e IL-6, foi observada nos grupos tratados com CTE (Figuras 12 e 13).

O desequilíbrio entre ROS e antioxidantes leva à condição diabética. Superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPX) são conhecidos como os principais antioxidantes responsáveis ​​por manter o nível ideal de ROS [35]. A partir dos resultados, constatou-se que a atividade dos antioxidantes foi significativamente menor no grupo DM. Os grupos tratados com CT mostraram melhorias na produção de antioxidantes. O grupo tratado com RSG não apresentou melhorias significativas na atividade antioxidante (Tabelas 6 e 7).

O óxido nítrico (NO) é conhecido como uma importante ERO que contribui para a inflamação. Nossos estudos apontam que o nível de NO diminuiu nos grupos tratados com CTE (Figura 11). Os resultados mostraram que o conteúdo de ânion superóxido no esperma de ratos diabéticos aumentou significativamente e não houve melhora significativa após a administração de RSG. A produção de superóxido foi reduzida nos grupos CTE.

A determinação do MDA é muito útil para avaliar a peroxidação lipídica. A peroxidação lipídica é o processo de oxidação dos lipídios e, finalmente, resulta em danos celulares. O MDA é produzido como resultado da peroxidação lipídica de ácidos graxos poliinsaturados. Estudos mostram que o nível de MDA está correlacionado com a idade e o nível de glicose no sangue em jejum [36]. O presente estudo indicou que o CTE melhora a peroxidação lipídica no plasma, testículos e esperma (Tabela 8).

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5. Conclusões

O estresse oxidativo durante condições diabéticas perturba o sistema reprodutor masculino através do comprometimento dos espermatozoides e da disfunção gonadal. Cistanche tubulosa é uma planta desértica amplamente aceita na medicina chinesa devido aos seus efeitos farmacológicos.Equinacósido (ECH)é o principal constituinte do CTE responsável por suas atividades antioxidante e antiinflamatória. Nossos resultados in vitro indicaram que a ECH restaurou a via de síntese de testosterona e reduziu o nível de expressão da proteína NF-κB e RAGE. A ECH inibiu efetivamente a produção de ânion superóxido e H2O2 nas células de Leydig. Os estudos in vivo revelaram que a ECH reduziu os níveis de colesterol, triglicerídeos, TNF- e IL-6. Além disso, as expressões de mRNA no hipotálamo dos ratos diabéticos melhoraram significativamente. É também digno de nota que a ECH reduziu a peroxidação lipídica e melhorou a resistência à insulina em ratos machos diabéticos. As atividades antioxidantes aumentaram tanto no plasma quanto nos testículos. Portanto, nossos estudos sugeriram que a ECH proporcionou proteção eficaz contra disfunção reprodutiva em ratos machos diabéticos induzidos por STZ.