Efeito do polissacarídeo Cistanche Deserticola na proliferação de linfócitos

Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Runlan, Li Xiaohong, Yang Meihua, Shi Yue

(Instituto de Plantas Medicinais, Peking Union Medical College, Academia Chinesa de Ciências Médicas, Pequim 100193)

ObjetivoTo estudar o efeito deCistanche deserticola polissacarídeo(CDPS) na proliferação de linfócitos em camundongos. 

MétodosO ensaio MTT foi utilizado para detectar a proliferação de linfócitos esplênicos em camundongos. A ciclofosfamida (Cy) foi usada para replicar modelos animais de animais imunocomprometidos, e os índices de baço e timo de animais normais e imunocomprometidos foram medidos. A atividade da interleucina-2 (IL-2) foi medida pelo ensaio de proliferação de timócitos. ResultadosCistanche deserticola polissacarídeopromoveu significativamente a proliferação de linfócitos ativados por mitógenos (ConA e LPS) e células normais não ativadas, e promoveu a secreção de IL-2 em linfócitos. A administração intraperitoneal mostrou queCistanche deserticola polissacarídeoaumentou significativamente o índice do baço de camundongos normais e imunocomprometidos, e também teve um efeito antagonista significativo na redução do índice do timo causada por Cy. ConclusãoCistanche deserticola polissacarídeopode promover significativamente a proliferação de linfócitos esplênicos em camundongos, o que pode estar relacionado à sua promoção da secreção de IL-2.

Deserto vivendo cistanche

[Palavras-chave]Cistanche deserticola polissacarídeo; índice do baço; índice do timo; Proliferação de linfócitos; Interleucina-2

Os polissacarídeos de plantas têm atraído atenção generalizada devido aos seus efeitos imunomoduladores generalizados e toxicidade relativamente baixa [1].Cistanche deserticola ma, conhecido como "Desert Ginseng", é o caule escamoso, seco e carnudo de Cistanche deserticola, uma planta do Orobaceae, que tem extensos efeitos farmacológicos.Sua decocção de água pode aumentar significativamente a porcentagem fagocítica e o índice fagocítico de macrófagos.Estudos posteriores mostraram que sua base material é o polissacarídeo total de Cistanche deserticola[3]. Zeng Qunli et ai. [4] descobriram que um único componente deCistanche deserticola polissacarídeotem um efeito proliferativo significativo em linfócitos tímicos de camundongos in vitro. O efeito deCistanche deserticola polissacarídeona proliferação de linfócitos foi observada in vivo e in vitro.

Fórmula molecular de Cistanche deserticola

1. Material e Métodos

1.1 Drogas e reagentes

O polissacarídeo de Cistanche deserticola é fornecido pelo Departamento de Plantas e Química do Instituto de Medicina e Plantação, Faculdade de Medicina. É extraído doExtrato de cistanche em pó, e o teor de polissacarídeos é de 87 por cento .

Extrato de cistanche em pó

Antes de usar experimentos in vivo, dissolva e dilua com soro fisiológico até a concentração necessária e ferva para esterilização. Antes do uso de experimentos in vitro, o meio de cultura RPMI-1640 foi dissolvido e diluído, e a esterilização de alta pressão foi realizada. Lipopolissacarídeo (LPS), concanavalina (ConA), dexametasona (DEX) e MTT são todos produtos da Sigma Corporation. Ciclofosfamida, uma joint venture sino-americana da Shanxi Taisheng Pharmaceutical Co., Ltd. Soro fetal bovino, meio de cultura RPMI1640 e tripsina são todos produtos da Gibco. Outros reagentes são reagentes analíticos domésticos.

1.2 Animais

Camundongos jovens BALB c (nível SPF) são fornecidos por Viton Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd. [SCXK (Pequim) 2002-2003]. Os animais de grau SPF são criados em uma sala e se alimentam e bebem livremente.

1.3 Aparelho

Marcador enzimático Multikan Ascent, um produto da Thermo Electron Company, EUA. Leici PHS-3B Precision pH Meter, Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd. Incubadora de dióxido de carbono Napco 5410, NAPCO, EUA. BCN-1360 Ultra Clean Workbench, Beijing Donglianhar Instrument Manufacturing Co., Ltd. XDS-1B Inverted Microscope, Chongqing Optoelectronic Instrument Co., Ltd.

1.4 Método

1.4.1 Efeito na proliferação de linfócitos [5]:

Preparação de rotina de linfócitos de baço de camundongos BALL c, usando RPMI-1640 para ajustar a concentração de células para 1 × 107 mL, inoculados em uma placa de cultura de 96 poços, com 100 suspensões de células adicionadas a cada poço μ 50. Foi co - cultivadas com diferentes concentrações deCistanche deserticola polissacarídeo(a concentração final deCistanche deserticola polissacarídeopara a proliferação de linfócitos não ativados foi de 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 mg/L na ordem; a concentração final deCistanche deserticola polissacarídeopara a proliferação de linfócitos T ativados por ConA foi de 3,9, 7,8, 15,6, 31,2 e 62,5 mg/L na ordem; e a concentração final deCistanche deserticola polissacarídeopara a proliferação de linfócitos B ativados por LPS foi de 1,56, 3,13, 6,25, 12,5 e 25 mg/L em ordem) e ConA ou LPS, meio RPMI-1640 foi usado como controle. O volume total de cada orifício é de 200 μL, ao adicionar mitógeno ConA e LPS (o controle é RPMI-1640 contendo as concentrações correspondentes de ConA ou LPS), as concentrações finais de ambos são 2,5 mg L e 10 mg L, respectivamente. Três orifícios paralelos foram feitos para vários tratamentos. Coloque a placa de cultura em uma incubadora de umidade saturada de 37 graus e 5 por cento de CO2 por 68 horas, adicione MTT e continue a cultura por 4 horas. Meça o valor A540 nm com um marcador de enzima usando o método MTT para detectar a proliferação. Ao comparar cada grupo, converta o valor A540nm em taxa de proliferação de linfócitos de acordo com a seguinte fórmula:taxa de proliferação de linfócitos=Uma amostra A controle × 100 por cento .

Efeitos do Cistanche - Melhorar a imunidade

1.4.2 Efeito sobre o peso dos órgãos imunes em camundongos normais [6,7]:

Camundongos BALB c jovens (machos, 4-semanas de idade, com peso corporal de 10-15 g) foram divididos aleatoriamente em um grupo de controle em branco (solução salina) e diferentes grupos de dosagem (125 mg (kg · peso corporal) e 250 mg (kg · pc)), com 11 ratos em cada grupo. A droga foi administrada por via intraperitoneal uma vez ao dia durante 7 dias consecutivos. Os camundongos foram mortos após deslocamento cervical. O baço e o timo foram retirados, a gordura e o tecido da fáscia foram removidos e o líquido da superfície foi seco com papel de filtro. Após a pesagem, o índice do baço=100 × Peso do baço (mg) Peso corporal (mg); Índice do timo=100 × Peso do timo (mg) Peso corporal (mg) Calcule o índice do baço e o índice do timo para cada 100 mg de peso corporal, respectivamente.

1.4.3 Efeito no peso do órgão imune em camundongos imunocomprometidos [7,8]:

Ratos jovens BALB c (machos, 6 semanas de idade, peso corporal 15-20 g) foram divididos aleatoriamente em 12 grupos de acordo com o peso corporal. Exceto para o grupo de controle normal (injeção intraperitoneal de um volume equivalente de soro fisiológico), os outros grupos foram injetados com Cy 50 mg (kg · pc) diariamente por via intraperitoneal, e a solução da droga teste foi administrada por via intraperitoneal [125 e 250Mg (kg · bw)], o grupo controle normal e o grupo modelo receberam o mesmo volume de soro fisiológico por 13 dias consecutivos, uma vez ao dia. As mudanças no peso dos animais foram observadas durante o experimento. 24 horas após a última administração, os índices do baço e do timo foram medidos e calculados usando o mesmo método de 1.4.2.

1.4.4 Impacto na atividade de IL-2:

① Indução de IL-2 [9]: Adicionar 50 a cada poço em uma placa de célula 96-poço μ L Diferentes concentrações deCistanche deserticola polissacarídeo(concentrações finais em ordem: 3,91, 7,82, 15,63, 31,25, 62,5, 125 mg/L, adicionar 50 mg/L no poço de controle μ L meio de cultura) e 50 μ L ConA (concentração final 5 mg/L), adicionar 1 a mais por poço × 106 células do baço. Incubar em uma incubadora de umidade saturada de 37 graus e 5 por cento de CO2 por 24 horas, centrifugar por 20 minutos a 2500 r min e pegar o sobrenadante da célula e armazená-lo em - 20 graus para o modo de espera. ② Detecção de atividade IL-2 [9,10]: O método básico é baseado na literatura [9], e os ajustes apropriados são feitos de acordo com a literatura [10]. Preparação convencional de suspensão de timócitos de camundongo BALB c, placa de cultura celular de 96 poços, 1 inoculação por poço × 106 timócitos, adicionando 50 células por poço μ L ConA (concentração final 2,5 mg/L) e, em seguida, adicionar o IL preparado{{34 }} sobrenadante 50 μ L (adicionar 50 ao orifício de controle em branco μ L solução de cultura), incubar juntos por 54 horas, adicionar MTT, continuar incubando por 4 horas, centrifugar por 10 a 15 minutos a 1000 r min, descartar o sobrenadante, e adicione DMSO 100 por poço μ L, agite com um micro oscilador por 8 min e meça o valor A540 nm com um marcador de enzima.

1.5 Análise Estatística

Os dados foram expressos em média e desvio padrão (x ± s). O software Microsoft Excel foi usado para reunir os dados e um teste t foi realizado. P<0.05 and P<0.01 were significant differences, both of which were statistically significant.

2.Resultados

2.1 Efeito na proliferação de linfócitos

Como pode ser visto na Tabela 1, adicionandoCistanche deserticola polissacarídeoao meio de cultura de linfócitos de baço de camundongo cultivados in vitro em uma concentração acima de 25 mg/L pode estimular significativamente a proliferação de linfócitos, indicando queCistanche deserticola polissacarídeoem si tem um efeito mitótico. Ao mesmo tempo,pode ser visto na Tabela 2 e na Tabela 3 que o CDPS tem um efeito promotor significativo na proliferação de linfócitos T induzidos por ConA ou linfócitos B induzidos por LPS.

Tab.1 A influência deCistanche deserticola polissacarídeosobre a proliferação de linfócitos não ativados (x ±s, n =3)

Nota: em comparação com o grupo de controle,＊P <0.05. 

Tab.2 A influência deCistanche deserticola polissacarídeosobre a proliferação de linfócitos T induzida por ConA (x ±s, n =3)

Nota: em comparação com o grupo ConA,＊P <0.05, ＊＊P <0.01.

Tab.3 A influência deCistanche deserticola polissacarídeosobre a proliferação de Blinfócitos induzida por LPS (x ±s, n =3)

Nota: em comparação com o grupo LPS,＊P <0.05 , ＊＊P <0.01. 

2.2 Efeito sobre o peso dos órgãos imunes em camundongos normais

Como pode ser visto na Tabela 4,Cistanche deserticola polissacarídeopode aumentar significativamente o índice do baço de ratos jovens BALB c normais, mas não tem efeito sobre a glândula timo.

2.3 Efeito no peso do órgão imune em camundongos imunocomprometidos

Da Tabela 5,pode-se observar que os índices de baço e timo de camundongos no grupo imunossupressor Cy são menores do que os do grupo controle, eCistanche deserticola polissacarídeo(125, 250 mg/kg) pode melhorar significativamente os índices do baço e do timo.

2.4 Efeito na atividade de IL-2

Como pode ser visto na Tabela 6,quando a dose deCistanche deserticola polissacarídeoatinge 7,82 mg/L, pode aumentar significativamente a liberação de IL-2 das células do baço de camundongos.

Tab.4 O efeito deCistanche deserticola polissacarídeosobre o peso de órgãos imunes em camundongos normais (x ±s, n =11)

Nota: em comparação com o grupo de controle,＊＊P <0.01.

Tab.5 O efeito deCistanche deserticola polissacarídeosobre o peso de órgãos imunes em camundongos imunodeprimidos ( x ±s, n =12)

Nota: em comparação com o grupo de controle,## P <0.01;compared with the model group , ＊＊P <0.01.

Tab.6 A influência deCistanche deserticola polissacarídeosobre a produção de IL-2 por linfócitos esplênicos em camundongos( x ±s, n =3)

Nota: em comparação com o grupo de controle,＊＊P <0.01. 

3. Discussão

A proliferação de linfócitos esplênicos induzida por ConA e LPS em camundongos é um experimento in vitro para detectar a função de linfócitos T e B e é um importante indicador da capacidade imune específica. Estudos têm mostrado que quando a concentração final deCistanche deserticola polissacarídeoestá acima de 25 mg/L, pode promover significativamente a proliferação de linfócitos, indicando que tem um certo efeito mitótico. Na presença de mitógeno (ConA ou LPS), uma dose menor deCistanche deserticola polissacarídeopode melhorar a imunidade do corpo, exibir atividade proliferativa significativa. Sabemos que ConA e LPS induzem principalmente a proliferação de linfócitos T ou linfócitos B, respectivamente. Estudos têm mostradobenefícios para a saúde do pó cistanche: Cistanche deserticola polissacarídeopode promover tanto a proliferação de linfócitos T quanto a proliferação de linfócitos B, mas seu efeito proliferativo nos linfócitos B é significativamente mais forte do que nos linfócitos T.

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O timo e o baço são os principais órgãos imunológicos dos animais. As células imunes no baço são principalmente linfócitos B maduros, enquanto o timo é principalmente linfócitos T imaturos. Os índices do timo e do baço podem refletir o desenvolvimento dos órgãos imunes e o estado funcional das células imunes. A injeção intraperitoneal do polissacarídeo Cistanche deserticola pode aumentar significativamente o índice do baço de camundongos normais e imunossuprimidos e tem um efeito antagonista significativo na atrofia tímica induzida por Cy em camundongos.Cistanche deserticola polissacarídeonão tem efeito significativo sobre o índice tímico em animais normais, o que é consistente com os resultados de experimentos in vitro nos quaisCistanche deserticola polissacarídeopromove a proliferação de linfócitos B em vez de linfócitos T.

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A IL-2 é uma citocina produzida pelos linfócitos T desde a fase G1 do ciclo celular até a fase S. É um importante fator de crescimento de células T que atua como um fator de crescimento autócrino. Além disso, IL-2 pode promover proliferação de células B e síntese de anticorpos [11,12].Cistanche deserticola polissacarídeopromove a liberação de IL-2 dos linfócitos, o que obviamente está relacionado comCistanche deserticola polissacarídeopromovendo a proliferação de linfócitos esplênicos.

Pesquisas médicas mostram que Cistanche contém polissacarídeos,Equinacosídeos e Acteosídeos, que podem ativar linfócitos e immprov imunidade de body; os componentes funcionais dos glicosídeos feniletanóides cistanche têm um efeito significativo na recuperação celular após danos causados ​​por raios gama de 60 Co, e também podem melhorar a função imunológica contra danos causados ​​pela radiação.Tomar suplemento de Cistanche deserticola diariamente pode alcançar o efeito de melhorar a imunidade.

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referência

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