Echinacoside reverte a remodelação do miocárdio e melhora a função cardíaca

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Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

Abstrato

A remodelação miocárdica é uma importante base patológica da IC, o estresse oxidativo mitocondrial é um promotor de hipertrofia miocárdica, fibrose e apoptose. ECH é o principal componente ativo de uma medicina tradicional chinesa Cistanches Herba, muitos estudos indicam que possui uma forte capacidade antioxidante em células nervosas e tumores, inibe o estresse oxidativo mitocondrial, protege a função mitocondrial, mas o mecanismo específico não é claro. SIRT1/FOXO3a/MnSOD é um importante eixo antioxidante, estudo descobriu que ECH se liga covalentemente a SIRT1 como um ligante e regula positivamente a expressão de SIRT1 em células cerebrais. Nossa hipótese é que a ECH pode reverter o remodelamento miocárdico e melhorar a função cardíaca da IC por meio da regulação do eixo de sinalização SIRT1/FOXO3a/MnSOD e da inibição do estresse oxidativo mitocondrial em cardiomiócitos. Aqui, primeiro induzimos um modelo celular de estresse oxidativo por ISO com células AC-16 e pré-tratamos com ECH, o nível de ROS mitocondrial, lesão oxidativa de mtDNA, MMP, proteína carbonilada, peroxidação lipídica, ROS intracelular e apoptose são detectadas, confirmam o efeito da ECH no estresse oxidativo mitocondrial e funcionam in vitro. Em seguida, estabelecemos um modelo de rato HF induzido por ISO e pré-tratamos com ECH. Índices de função cardíaca, remodelação miocárdica, estresse e função oxidativa mitocondrial, expressão do eixo de sinalização SIRT1/FOXO3a/MnSOD são medidos, os dados indicam que a ECH melhora a função cardíaca, inibe a hipertrofia miocárdica, fibrose e apoptose aumenta a expressão de SIRT1/FOXO3a/ Eixo de sinalização MnSOD, reduz os danos oxidativos mitocondriais, protege a função mitocondrial. Concluímos que a ECH reverte o remodelamento miocárdico e melhora a função cardíaca através da regulação positiva do eixo SIRT1/FOXO3a/MnSOD e da inibição do estresse oxidativo mitocondrial em ratos com IC.

PALAVRAS-CHAVE Sequinacosídeo, insuficiência cardíaca, estresse oxidativo mitocondrial, remodelação miocárdica

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1|INTRODUÇÃO

A insuficiência cardíaca (IC) é o desfecho final da maioria das doenças cardiovasculares com alta prevalência e mau prognóstico, e com a tendência agravante do envelhecimento da população, a hospitalização e a mortalidade por insuficiência cardíaca crônica (ICC) aumentaram acentuadamente em todo o mundo.1 Durante os últimos 20 anos, os tratamentos medicamentosos para IC progrediram muito, mas o efeito é muito limitado, portanto, novos medicamentos são urgentemente necessários. A remodelação miocárdica é uma importante base patológica da IC e é caracterizada por hipertrofia miocárdica, apoptose, fibrose intersticial, as células miocárdicas são desorganizadas e levam à redução da fração de ejeção (FEVE), aumento das dimensões diastólica e sistólica final do ventrículo esquerdo (LVIDd e LVIDs) e diminuição do encurtamento fracionado do ventrículo esquerdo (LVFS).2 Mas os mecanismos subjacentes ainda não foram totalmente compreendidos. Nos últimos anos, numerosos estudos confirmaram que o estresse oxidativo é um importante promotor de remodelação miocárdica.3-7

O estresse oxidativo é uma condição na qual espécies reativas de oxigênio (EROs) ou radicais livres são gerados excessivamente e levam a danos oxidativos dos componentes celulares, o que, por sua vez, causa disfunção celular. vazamento da cadeia respiratória de transporte de elétrons, e as mitocôndrias são a posição mais sensível aos efeitos de ROS.9 Estudos em IC identificaram aumento da geração de ROS a partir do complexo I da cadeia respiratória.8 O aumento da produção de ROS ataca os componentes mitocondriais em primeiro lugar e resulta em excesso de estresse oxidativo , manifesta-se como carbonilação de proteínas, peroxidação lipídica e danos no DNA,10 e disfunção das mitocôndrias, que consequentemente levam à formação excessiva de EROs,8 forma um círculo vicioso. Demonstrou-se que o estresse oxidativo sustentado pode causar hipertrofia miocárdica e fibrose miocárdica,11-13 e causar apoptose de células miocárdicas através da ativação de apoptose dependente de mitocôndrias como resultado da carbonilação de proteínas de membrana mitocondrial e perda do potencial de membrana mitocondrial.14 Assim , considera-se que a inibição do estresse oxidativo mitocondrial pode ser uma nova estratégia para prevenir o remodelamento miocárdico e até mesmo a IC.15-17

Echinacoside (ECH), um glicosídeo feniletanoide natural, é o principal componente ativo do Cistanches Herba, que é a medicina tradicional chinesa. Nos últimos anos, a ECH tem sido extensivamente estudada no sistema nervoso e em tumores, e tem sido relatado que possui uma variedade de efeitos farmacológicos, como propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, antiapoptose e antitumorais.18,19In células nervosas, a ECH aumenta significativamente a capacidade antioxidante, reduz a produção de ROS, melhora o potencial de membrana mitocondrial (MMP) e aumenta a viabilidade celular,20 exibe efeitos protetores sobre a função mitocondrial e inibe o estresse oxidativo mitocondrial, protege contra lesão oxidativa e melhora a memória, eventualmente previne neurodegeneração.21,22 A ECH também aumenta a atividade da SOD e desempenha um papel protetor no tecido cerebral e no tecido da retina,19,23 mas o mecanismo específico para seu efeito antioxidante não é claro.

SIRT1 está intimamente relacionado ao estresse oxidativo, e o eixo de sinalização SIRT1/FOXO3a/MnSOD é o eixo antioxidante mais importante e é responsável pela supressão do estresse oxidativo mitocondrial, MnSOD distribui-se amplamente nas mitocôndrias e é o principal responsável pela limpeza de ROS mitocondriais, assim inibindo o estresse oxidativo, compostos que ativam esse eixo antioxidante podem inibir o estresse oxidativo.24,25 Estudos recentes mostraram que a ECH exerce seus efeitos farmacológicos por meio da regulação de múltiplas vias de sinalização, como p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads , e via de sinalização SIRT1.26-29 um novo estudo descobriu que ECH se liga covalentemente a SIRT1 como um ligante e regula positivamente a expressão de SIRT1 em células cerebrais.26 Isso sugere que a ECH pode inibir o estresse oxidativo mitocondrial em cardiomiócitos e reverter o miocárdio remodelação. No entanto, as pesquisas sobre os efeitos da ECH têm se concentrado no sistema nervoso ou tumoral, os efeitos e mecanismos da ECH no estresse oxidativo mitocondrial em cardiomiócitos e na remodelação miocárdica permanecem desconhecidos. Aqui, primeiro induzimos um modelo celular de estresse oxidativo por ISO e confirmamos o efeito da ECH no estresse oxidativo mitocondrial e na função in vitro. Em seguida, estabelecemos um modelo de rato com IC induzido por ISO e demonstramos que a ECH reverte o remodelamento miocárdico e melhora a função cardíaca através da regulação positiva do eixo de sinalização SIRT1/FOXO3a/MnSOD e inibindo o estresse oxidativo mitocondrial em ratos com IC. Os resultados visam fornecer evidências experimentais para o desenvolvimento de novos medicamentos para prevenir a insuficiência cardíaca.

2|MATERIAIS E MÉTODOS

2.1|Cultura de células e tratamento

As células AC16 são adquiridas da Bena Culture Collection. As células são mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, EUA) com 10 por cento de soro fetal bovino (10 por cento FBS; Gibco) em frascos T-75 (Corning Glassworks, Corning, NY, EUA). As condições são mantidas a 37 graus em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Uma vez que as células atingem 70 por cento -80 por cento de confluência, as células do grupo ISO (Sigma, EUA) são incubadas com um meio contendo 10uM ISO (Sigma, EUA) por 24h, as células do grupo ECH são pré-tratadas com 50uM ECH (MCE , EUA) por 30 minutos antes da exposição ISO. As células de controle (Ctrl) não são tratadas.

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2.2|Detecção do nível de ROS mitocondrial usando quimioluminescência de luminol

As mitocôndrias são isoladas e purificadas a partir de células AC-16 usando o Kit de Isolamento de Mitocôndrias (Sigma, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de proteína são determinadas pelo kit de ensaio de proteína BCA (Biotech). O nível de ROS mitocondrial é detectado por luminal (3-hidrazida aminoftálica 5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazinodiona) usando um kit Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, EUA), reage com ROS e provoca a emissão de fótons, que é um espectro de banda com pico em cerca de 460nm, e a Unidade de Luz Relativa (RLU) é detectada por instrumento de medição de quimioluminescência e convertida em RLU/ug proteína mitocondrial.

2.3|8-OHdG é usado para avaliar o dano oxidativo do DNA mitocondrial

O dano oxidativo do DNA mitocondrial é avaliado pela detecção do conteúdo de 8-Hidroxi-2-desoxiguanosina (8-OHG). As mitocôndrias purificadas nas células são isoladas usando um kit de isolamento de mitocôndrias como acima (Sigma). As concentrações de proteína são determinadas pelo kit de ensaio de proteína BCA (Biotech). Em seguida, eles são dissociados para determinar o nível de 8-OHdG usando um kit Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A absorbância da mudança de cor é medida em um espectrofotômetro no comprimento de onda de 450 nm. A concentração de 8-OHdG nas amostras é então determinada comparando a DO das amostras com a curva padrão e convertida em ng/ml.

2.4|Medição de MMP por JC-1

As mitocôndrias são isoladas e purificadas de AC-16 e a concentração de proteína é determinada como mencionado acima. Em seguida, as mitocôndrias são ressuspensas na concentração de 1mg/ml, a MMP é medida usando um kit de ensaio JC-1 de acordo com as instruções do fabricante. A intensidade de fluorescência é medida no comprimento de onda de excitação: 490 nm, fenda 5 nm, comprimento de onda de emissão: 590 nm, fenda 5 nm com um instrumento espectrofotômetro,30 os resultados são representados como FLU/ugP.

2.5|Detecção de células apoptóticas por citometria de fluxo em células AC-16

A citometria de fluxo é usada para avaliar a apoptose celular. Um kit de detecção de apoptose Anexina V-FITC/PI (CWBIO, China) é usado para detectar células apoptóticas e necróticas de acordo com as instruções do fornecedor. Apoptose em estágio inicial, apoptose ou necrose em estágio avançado, restos celulares e células viáveis ​​são identificadas como anexina V (mais)/PI (−), anexina V (mais)/PI (mais), anexina V (−)/PI ( mais ) e anexina V (−)/PI (−), respectivamente. As intensidades de fluorescência são analisadas usando um citômetro de fluxo (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Cada experimento é repetido 3 vezes.

2.6|Avaliado o ROS intracelular por citômetro de fluxo

Após o tratamento, as células são tripsinizadas, lavadas duas vezes com PBS. As células são então ressuspensas em PBS, coradas com DCFH-DA (Beyotime, China) na concentração final de 1 μM e incubadas por 1 h a 37 graus em uma incubadora com CO2 e, em seguida, testadas em um citômetro de fluxo a 488 nm de excitação . A intensidade de fluorescência representa o nível de ROS intracelular.

2.7|Testar o conteúdo de proteína carbonil nas mitocôndrias de células AC-16

Após o tratamento, as mitocôndrias purificadas são isoladas e sonicadas em gelo e são tratadas com sulfato de estreptomicina a 1 por cento para precipitar os ácidos nucleicos mitocondriais, a concentração de proteína é determinada. O teor de proteína carbonilada é testado usando um kit Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) baseado na derivatização do grupo carbonila com dinitrofenilhidrazina (DNPH), de acordo com as instruções do kit, a DO é medida por um leitor de microplacas e convertida em nmol/ mg de proteína comparando com a curva padrão.

2.8|Determinação do nível de peroxidação lipídica nas mitocôndrias de células AC-16

Após o tratamento, as células são coletadas e lisadas, as mitocôndrias são isoladas e purificadas e quebradas por ultrassom, a concentração de proteína é determinada pelo kit de ensaio de proteína BCA (Biotech), a peroxidação lipídica é determinada pelo nível de malondialdeído (MDA) através do ensaio TBARS , usando um kit (Nan jing Jian cheng, China) e o nível de MDA é medido seguindo o protocolo do fabricante. OD é detectado em 586 nm por um leitor de microplacas e convertido em μmol/g de proteína por comparação com a curva padrão.

2.9|Animais e tratamento

Ratos machos jovens Sprague-Dawley pesando 120-140g são adquiridos do Centro Animal Laboratorial da Universidade Xi'an Jiao tong (Shaanxi, China). A investigação está em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (publicação do NIH no.85-23, revisado em 1996), e os protocolos experimentais foram aprovados pelas autoridades locais ( Comitê de Ética Biomédica do Departamento Médico da Universidade Xi 'a Jiao Tong). O modelo de rato de HF é estabelecido como descrito anteriormente por nós.31 Resumidamente, o isoproterenol (1{10}} mg/kg) é administrado uma vez ao dia por injeção intraperitoneal por 2 semanas (definido como grupo HF), ECH é administrado com 20 ug/g uma vez ao dia por injeção intraperitoneal 30 minutos antes do tratamento com ISO (definido como grupo ECH), e a administração dura 2 semanas. Os animais de controle são administrados com 0,9 por cento de NaCl (definido como grupo Ctrl). As medições de ecocardiografia são realizadas para avaliar a função cardíaca.

2.10|Medidas ecocardiográficas

Os animais são anestesiados por uma injeção intraperitoneal de 300 mg/kg de hidrato de cloral. O sistema de ultrassom SONOS-2500 com transdutor de ultrassom de 7,5 MHz (HP, EUA) é usado para fazer exames ecocardiográficos. A fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE), o encurtamento fracionado do ventrículo esquerdo (LVFS), as dimensões diastólicas finais do ventrículo esquerdo (DVId), as dimensões sistólicas finais do ventrículo esquerdo (LVIDs), a frequência cardíaca (FC), a espessura do septo interventricular na diástole (IVSTd ), a espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo na diástole (PVED) são medidas conforme descrito anteriormente por nós.32

FIGURA 1 50μmol ECH inibe efetivamente o estresse oxidativo mitocondrial de células AC-16 induzido por 10μmol/L ISO e protege a função mitocondrial e reduz a apoptose.

2.11|A razão entre o peso do coração e o peso corporal (PC/PC) é medida

O rato é pesado antes da anestesia, o coração fresco é isolado e lava o sangue com 0.1mol/L PBS, vasos cortados e outros tecidos redundantes e o coração é pesado, então HW/BW(mg/100g) é calculado.

2.12|Coloração histológica

Os corações dos ratos são dissecados e fixados em paraformaldeído a 4 por cento, embebidos em parafina e seccionados em fatias de 5 μm de espessura. A coloração com hematoxilina-eosina (HE) é usada para observar as alterações patológicas e o tricrômio de Masson é usado para avaliar as fibras colágenas do tecido do miocárdio de ratos. A fração de volume de colágeno cardíaco (CVF) e a área da seção transversal dos cardiomiócitos são medidas com o Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, EUA).

2.13|Coloração do TÚNEL

O tecido miocárdico do ventrículo esquerdo é coletado e o ensaio TUNEL é realizado conforme descrito anteriormente por nós32

2.14|Microscopia eletrônica de transmissão

O tecido cardíaco fresco é fixado em glutaraldeído a 2,5 por cento a 4 graus, o tecido é então cortado em 1 mm3 de volume e fixado novamente em glutaraldeído a 2,5 por cento a 4 graus por 2h, depois é lavado com 0,1mol/L PBS, fixado em ácido ósmico a 1%, desidratado com acetona, embebido em resina epóxi, são feitas fatias ultrafinas com uma espessura de cerca de 800nm, coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo e observadas em microscópio eletrônico de transmissão (H{ {13}}, Hitachi Limited, Japão). Para quantificar o efeito protetor da ECH na morfologia mitocondrial, a circunferência mitocondrial média, área transversal mitocondrial média, porcentagem de degeneração e porcentagem de vacuolização nas mitocôndrias são analisadas estatisticamente com Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, EUA).

2,15|PCR quantitativo

O RNA total é preparado a partir de tecido ventricular esquerdo com reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, EUA). O cDNA é sintetizado usando o TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Japão). As sequências de primers específicas de colágeno I usadas para PCR em tempo real são as seguintes: direta: 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3', reversa: 5'-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3'. GAPDH direto 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', reverso 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. A PCR quantitativa em tempo real (qPCR) é realizada com SYBRPremix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takara, Japão). O nível relativo de mRNA é calculado normalizando para GAPDH, de acordo com o método 2-ΔΔCT.

2.16|Análise de Western blot da expressão da proteína SIRT1, FOXO3a, MnSOD

A proteína total do tecido ventricular esquerdo é extraída em gelo usando tampão RIPA frio (BioRad, EUA) com Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich). A concentração é determinada pelo método BCA. Os procedimentos de Western blot são descritos anteriormente.33 Resumidamente, a amostra de proteína é fracionada em géis de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio a 15%, transferida para membranas de PVDF (BioRad, EUA), bloqueada por leite desnatado a 5% e incubada com anticorpo MYH de camundongo (diluído 1:200, Santa Cruz, EUA). Em seguida, incubado com um anticorpo de camundongo de cabra conjugado com peroxidase de rábano (diluído 1:2,{10}}, Santa Cruz, EUA). O nível relativo de proteína é calculado normalizando o valor médio do raio para -actina. As bandas de proteína são detectadas por um sistema de quimioluminescência (ChemiDoc XRS, BioRad).

2.17|Mensuração do Estresse Oxidativo Mitocondrial em Miocárdio de Ratos.

Mitocôndrias purificadas de miocárdio de rato são isoladas usando o Kit de Isolamento de Mitocôndrias (Sigma, EUA) de acordo com as instruções do fabricante, ROS mitocondrial, MMP, dano oxidativo do mtDNA, conteúdo de proteína carbonilada e nível de peroxidação lipídica nas mitocôndrias são todos detectados usando os mesmos métodos que experimentos celulares descritos acima. É importante notar que as ROS no tecido do miocárdio são detectadas com sondas fluorescentes DCFH-DA, a intensidade da fluorescência é detectada com o instrumento de medição de marcação enzimática, os resultados são representados como RLU/ug de proteína mitocondrial.

2,18|Análise estatística

Todos os dados são apresentados como média ± SEM. One-way ANOVA é usado para comparar diferenças entre vários grupos, seguido pelo teste post hoc de Tukey para significância. Todas as estatísticas são determinadas usando o software SPSS15.0 (SPSS Inc, IL, EUA). Um valor de probabilidade de P < 0,05="" é="" considerado="">

3|RESULTADOS

3.1|50 μM ECH inibe efetivamente o dano oxidativo mitocondrial e a apoptose em células AC-16

As células não tratadas são definidas como um grupo Ctrl. Em primeiro lugar, como mostra a Figura 1A, a ECH inibe as ROS mitocondriais induzidas por ISO. As células tratadas com ISO mostram um aumento significativo de ROS mitocondrial em comparação com Ctrl e esse aumento é significativamente atenuado pelo pré-tratamento com 50 μM ECH. Em segundo lugar, a ECH pode inibir o dano oxidativo do mtDNA induzido pela ISO. 8-Acredita-se que o OHdG seja uma das lesões de DNA mais abundantes resultantes do estresse oxidativo e seja um biomarcador de dano e reparo oxidativo do DNA. Como mostra a Figura 1B, o conteúdo de 8-OHdG em mitocôndrias purificadas de células AC-16 é detectado, os resultados mostram que o nível de 8-OHdG em mitocôndrias de células tratadas com ISO aumentou drasticamente, mas a mudança foi revertida por 50 μM ECH. Em terceiro lugar, a ECH é eficaz para proteger a MMP, que é prejudicada pela ISO. A intensidade de fluorescência é significativamente diminuída em células tratadas com ISO em comparação com células Ctrl, enquanto o pré-tratamento com 50 μM ECH atenua notavelmente a redução de MMP, como mostra a Figura 1C. Em quarto lugar, a ECH protege contra o dano oxidativo da proteína mitocondrial nas células AC-16. Como mostra a Figura 1D, o teor de proteína carbonil nas mitocôndrias das células de tratamento ISO é significativamente aumentado e a ECH atenua o efeito. Em quinto lugar, a ECH também inibe a peroxidação lipídica mitocondrial em células AC{14}} induzida por ISO. Como mostra a Figura 1E, o nível de peróxidos lipídicos nas mitocôndrias das células ISO é obviamente maior do que nas células Ctrl, enquanto esse aumento é significativamente reduzido pelo pré-tratamento de 50μM ECH. Em última análise, a ECH inibe o acúmulo de ROS intracelulares. Como mostra a Figura 1F, o nível de ROS intracelular em células ISO é marcadamente aumentado e é proeminentemente diminuído em células pré-tratadas com ECH. A Figura 1G mostra que a taxa de apoptose de células AC{21}} é significativamente aumentada após 24h de incubação com 10μM ISO, em comparação com as células Ctrl, enquanto as células de pré-tratamento com 50 μM ECH reduzem significativamente a apoptose induzida por ISO.

FIGURA 2 A hipertrofia cardíaca de ratos HF induzida por ISO é aliviada e a função cardíaca é significativamente melhorada pelo tratamento com ECH.

3.2|A ECH reverte o remodelamento miocárdico e melhora a função cardíaca de ratos com IC induzida por ISO

Conforme mostrado na Figura 2A, os corações em ratos HF apresentam hipertrofia óbvia e são revertidos pelo tratamento com ECH. Como mostram as Figuras 2B-D e L, ECH reduz o HW/BW. Os resultados da ecocardiografia mostram que a FEVE e a FEVE estão significativamente reduzidas no grupo IC, enquanto as LVID, LVIDs e IVSTd estão significativamente aumentadas no grupo IC. No entanto, a ECH diminui significativamente o LVIDd, LVIDs, IVSTd e melhora a FEVE e LVFS, não há diferença significativa na FC entre os três grupos, a LVPWTd está aumentada na IC, mas não há diferença entre ECH e Ctrl, ou entre ECH e HF, todos conforme A Figura 2E-K mostra. Os resultados da coloração HE indicam que a hipertrofia miocárdica, desordem arranjada ou necrose degenerativa, infiltração de células inflamatórias e hiperemia e edema intersticial em ratos HF, e ECH alivia significativamente esses danos, hipertrofia miocárdica e desordem arranjada são aliviados, o necrose degenerativa e infiltrado inflamatório são reduzidos, conforme mostrado na Figura 3A. A área de secção transversal do cardiomiócito é medida, aumenta significativamente após ISO e diminui no grupo tratado com ECH, como mostra a Figura 3E. As avaliações da deposição de colágeno pela coloração de Masson revelam que o conteúdo de colágeno ventricular esquerdo em ratos com IC é obviamente aumentado e aparentemente diminuído após o tratamento com ECH, o que obviamente diminui a CVF. A análise de PCR em tempo real revela que os transcritos de procolágeno tipo Ⅰ são regulados positivamente em ratos ISO e regulados negativamente em ratos ECH, esses resultados são consistentes entre si, como mostram as Figuras 3B e FG, os dados indicam que a ECH reduz efetivamente a deposição de colágeno . O número de células TUNEL-positivas em cardiomiócitos é significativamente aumentado em ratos HF em comparação com Ctrl, ECH reduz marcadamente a apoptose de células miocárdicas, e a Figura 3C-D mostra a imagem representativa de células TUNEL-positivas em campos de baixa e alta potência respectivamente, e a Figura 3H mostra a taxa de apoptose das células miocárdicas. Esses resultados indicam que a ECH reverte efetivamente a hipertrofia miocárdica, fibrose intersticial miocárdica e apoptose, e melhora a função cardíaca em ratos com IC induzida por ISO.

FIGURA 3 Os resultados da coloração histológica demonstram que a ECH reverte a remodelação ventricular esquerda de ratos com IC induzida por ISO.

3.3|ECH protege a ultraestrutura miocárdica em ratos com IC

Os resultados das micrografias eletrônicas de transmissão mostram que o dano à ultraestrutura miocárdica pode ser atenuado pela ECH, como mostra a Figura 4A-B. As miofibrilas estão dispostas verticalmente, a estrutura do sarcômero é óbvia, os miofilamentos estão dispostos ordenadamente e a linha Z é clara. As mitocôndrias estão bem organizadas e a estrutura é clara em ratos Ctrl. No entanto, as miofibrilas estão desorganizadas, rompidas e dissolvidas, a estrutura do sarcômero é difusa, ausência da linha Z, a zona de contração miocárdica é visível, o número e o volume das mitocôndrias estão aumentados, as mitocôndrias têm formas e tamanhos diferentes, dispostas em desordem, a estrutura não é clara, inchaço e fragmentação da crista, colapso ou aglomeração e dissolvido em vacúolo em ratos HF. A ECH obviamente atenua essas alterações, a maioria das fibras musculares cardíacas estão bem organizadas e os filamentos miocárdicos são claros, a linha Z existe, embora alguma dissolução dos filamentos seja aparente, a estrutura do sarcômero é clara, a densidade das mitocôndrias é diminuída, as formas e os tamanhos são aliviados, organizados de forma mais organizada, o inchaço das mitocôndrias e a fragmentação da crista, o colapso ou aglomeração e a vacuolização são evidentemente reduzidos pela ECH em comparação com a HF. O inchaço das mitocôndrias e a fragmentação da crista, o colapso ou aglomeração e a vacuolização parcial são identificados como degeneração mitocondrial. Os resultados demonstram que a ECH protege efetivamente a ultraestrutura miocárdica, e especialmente protege a morfologia mitocondrial em ratos com IC, como mostra a Figura 4C-F.

FIGURA 4 ECH protege a ultraestrutura de cardiomiócitos e morfologia mitocondrial de ratos HF induzida por ISO.

3.4|ECH regula a expressão de proteínas de SIRT1, FOXO3a e MnSOD

A análise de Western Blot demonstra que o nível de expressão proteica de SIRT1, FOXO3a e MnSOD são significativamente regulados negativamente em ratos HF, no entanto, ECH obviamente regula positivamente a expressão proteica diminuída. As bandas de proteínas representativas dos resultados de immunoblotting e análise estatística são mostradas na Figura 5. A parte dos dados indica que ECH aumenta a expressão proteica de SIRT1, FOXO3a e MnSOD.

3.5|A ECH inibe o estresse oxidativo mitocondrial no tecido miocárdico do ventrículo esquerdo

Nesta parte, ROS mitocondrial, MMP, dano oxidativo do DNA mitocondrial, conteúdo de proteína carbonil e nível de peroxidação lipídica nas mitocôndrias no tecido miocárdico do ventrículo esquerdo de ratos são todos medidos, e os resultados são consistentes com experimentos celulares, ou seja, A ECH diminui a ROS mitocondrial, protege a MMP, alivia o grau de dano do mtDNA, reduz o teor de proteína carbonilada e a peroxidação lipídica nas mitocôndrias, como mostra a Figura 6.

FIGURA 5 ECH regula positivamente o nível de expressão proteica de SIRT1, FOXO3a e MnSOD que é regulado negativamente em ratos HF.

4|DISCUSSÃO

Este estudo demonstra que a ECH exerce funções efetivas na prevenção do remodelamento miocárdico e melhora da função cardíaca através da regulação positiva do eixo de sinalização SIRT1/FOXO3a/MnSOD e inibição do estresse oxidativo mitocondrial.

As mitocôndrias são o principal local de geração de ROS como subproduto da fosforilação oxidativa, por sua proximidade com ROS, acredita-se que proteínas mitocondriais, lipídios e mtDNA sejam alvos primários de dano oxidativo após emissão excessiva de ROS mitocondriais,34,35 esse dano estimula ainda mais a produção de ROS, o círculo vicioso continua, ROS e estresse oxidativo podem levar à hipertrofia miocárdica, apoptose, fibrose intersticial e IC através da ativação de múltiplas vias de sinalização. estresse são eficazes para a prevenção da remodelação miocárdica. ECH é um glicosídeo feniletanoide natural, um componente da erva tradicional chinesa Cistanche tubulosa. é amplamente estudado e provou possuir tipos de atividades farmacológicas nos últimos anos, como antitumoral, antiapoptose, antienvelhecimento, ação neuroprotetora e assim por diante. Estudos provaram que as ações farmacológicas da ECH dependem principalmente de sua propriedade de atividade antioxidante e anti-inflamatória,18,21 e a ECH diminui as EROs mitocondriais e protege a função mitocondrial contra danos oxidativos nas células nervosas.20,22 Aqui, primeiro demonstramos que A ECH diminui as EROs mitocondriais dos cardiomiócitos, melhorando a MMP, reduzindo o dano oxidativo do mtDNA, proteínas e lipídios, inibindo efetivamente o dano oxidativo mitocondrial e reduzindo a apoptose in vitro e in vivo, revertendo o remodelamento miocárdico e melhorando a função cardíaca. Isso significa que a ECH é um potencial novo fármaco para a prevenção do remodelamento miocárdico e da IC.

Em condições normais, a ERO mitocondrial é eliminada principalmente pela MnSOD, que se distribui nas mitocôndrias e protege contra o dano oxidativo mitocondrial. A Ang II diminui significativamente a expressão de MnSOD de cardiomiócitos e induz hipertrofia miocárdica, entretanto, o resveratrol poderia aumentar a expressão de MnSOD e inibir a hipertrofia miocárdica induzida por Ang II.36 Na IC, a atividade de MnSOD é significativamente diminuída e a geração de ROS mitocondrial é elevada .37,38 Em camundongos nocaute do gene MnSOD específico para o coração, as EROs mitocondriais não puderam ser eliminadas e as EROs estão aumentadas nos cardiomiócitos, o que levou à disfunção mitocondrial e aumento cardíaco progressivo, eventualmente levando à insuficiência cardíaca.39 No presente estudo, confirmamos que a expressão de MnSOD é significativamente diminuída, o que é atenuado pelo tratamento com ECH e, assim, a ERO mitocondrial é reduzida e o estresse oxidativo mitocondrial é inibido. Isso significa que a ECH protege os cardiomiócitos contra o dano oxidativo através da regulação positiva da expressão de MnSOD, exploramos ainda mais os mecanismos moleculares subjacentes a esses efeitos.

A expressão de MnSOD é regulada por FOXO3a, que é um fator de transcrição e se liga na região promotora do gene de MnSOD e leva à promoção da transcrição do gene.40 SIRT1 é um molecular upstream de FOXO3a e pode ativar FOXO3a por desacetilação. O eixo de sinalização SIRT1/FOXO3a/MnSOD desempenha papéis centrais na proteção contra o estresse oxidativo em tipos de células, a ativação do eixo de sinalização pelo estradiol inibe o estresse oxidativo e exerce a proteção cardíaca24; A ativação do eixo de sinalização pelo resveratrol inibe a morte celular induzida pelo estresse oxidativo40; Caso contrário, a angiotensina II inibe a via SIRT1/FoxO3a/MnSOD e induz estresse oxidativo mitocondrial, dano mtDNA em osteoblastos,41 adenilil ciclase tipo 5 aumenta o estresse oxidativo pela inibição da expressão de MnSOD via Sirt1/FoxO3a Pathway.42 O presente estudo conclui que a a expressão de SIRT1, FoxO3a e MnSOD estão significativamente reduzidas em ratos HF e ROS mitocondrial é elevada e o estresse oxidativo é aumentado, no entanto, as alterações são revertidas pela ECH. Novas pesquisas indicam que ECH se liga diretamente a SIRT1 como ligante e forma um complexo com 9 ligações covalentes e regula positivamente a expressão de SIRT1 em células nervosas.26 Consistente com este estudo, o presente estudo demonstra que ECH também regula positivamente a expressão de SIRT1 SIRT1 em cardiomiócitos, então regula a expressão gênica de MnSOD através de FoxO3a e inibe ROS mitocondriais e estresse oxidativo.

A isquemia crônica de longo prazo pode causar hibernação miocárdica, essas células miocárdicas hibernantes geralmente apresentam perda de filamentos contráteis, há excesso de grânulos de glicogênio no citosol, retículo sarcoplasmático e perda de túbulos transversos,43 além disso, há anormalidades no tamanho e forma mitocondrial , hipertrofia miocárdica reativa e fibrose intersticial, que são secundárias à perda de miócitos.44 Também observamos as alterações acima em ratos com IC em nosso estudo, enquanto a ECH alivia significativamente essas alterações, pois o último estudo relatou que a recuperação da função cardíaca após estresse isquêmico pode ser um característica de hibernação miocárdica,45 o nível de glicogênio miocárdico também é medido, os resultados indicam que não há diferença significativa entre os três grupos, conforme mostrado na Figura 7J.

O estudo anterior também detectou hibernação miocárdica em um modelo porco de insuficiência cardíaca não isquêmica ao estimular a parede livre do VE com alta frequência,46 porque a obstrução microvascular desempenha um papel importante na hibernação miocárdica e na disfunção contrátil resultante, e isso é acentuadamente melhorado quando a a obstrução microvascular é revertida por um fármaco.47 Atualmente, alguns estudos concluem que a terapia de revascularização é eficaz na hibernação do miocárdio,43 usando HE e coloração de Masson, observamos que a densidade capilar e arteriolar miocárdica são obviamente reduzidas em ratos com IC e são aliviadas significativamente por ECH, como mostrado na Figura 7A-H. Estudos anteriores demonstraram que outros compostos naturais, como o beta-glucano de cevada, exercem efeitos cardioprotetores ao aumentar a expressão de MnSOD,48,49, e o aumento de MnSOD está relacionado ao aumento da densidade capilar miocárdica e expressão de VEGF. Realizamos RT-PCR para detectar a expressão de VEGF, os dados são consistentes com o achado de coloração histológica, o que significa que a ECH pode promover angiogênese e aumentar a densidade capilar miocárdica via regulação da expressão de VEGF, conforme mostrado na Figura 7I. O presente estudo descobriu que a ECH pode proteger e aumentar os capilares e arteriolares miocárdicos através da regulação positiva da via SIRTI/FOXO3a/MnSOD e da expressão de VEGF, suprimindo assim o miocárdio em hibernação e contribuindo para melhorar a função cardíaca.

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É importante notar que a apoptose de cardiomiócitos é bem conhecida por ser uma importante alteração patológica na insuficiência cardíaca, e o presente estudo de fato confirma que uma grande quantidade de células apoptóticas em ratos com IC e ECH reduz significativamente a apoptose via regulação da via SIRTI/FOXO3a/MnSOD e inibição estresse oxidativo mitocondrial, como mencionado acima.

Acima de tudo, a ECH reverte a remodelação miocárdica e melhora a função cardíaca por meio da regulação positiva do eixo de sinalização SIRT1/FoxO3a/MnSOD, inibindo assim o estresse oxidativo mitocondrial e reduzindo a hibernação do miocárdio. Assim, sugere-se que a ECH seja uma droga potencial para a prevenção ou tratamento da remodelação miocárdica e IC.