Echinacoside retarda a senescência celular de células fibroblásticas humanas MRC-5

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

O ingrediente ativo do Cistanche: Como o echinacoside antienvelhecimento?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

Neste estudo, os efeitos do echinacoside, um dos feniletanoides isolados das hastes de Cistanches salsa, um fitoterápico tradicional chinês, em células MRC fibroblásticas de pulmão de embriões humanos-5, foram investigados. A atividade de proliferação celular foi avaliada com Alamar Blue, mostrando que o tratamento com echinacoside pode retardar a senescência. Os resultados da citometria de fluxo mostram que o echinacoside pode desencadear células na fase G1 para entrar na fase S e na fase G2, e pode melhorar a degradação de ROS. Os resultados do ensaio do cometa indicam que o echinacoside pode proteger as células de danos no DNA, elucidando parcialmente o mecanismo de seus efeitos. Todos os resultados acima sugerem que o echinacoside tem potencial atividade anti-senescência.

Cistanche deserticola tem muitos efeitos, clique aqui para saber mais

1. Introdução

As células normais cultivadas in vitro proliferam por um número limitado de duplicações de população (o 'limite de Hayflflick') e entram em um estágio de senescência replicativa. As células senescentes sofrem uma parada do crescimento celular na fase G1 e uma mudança na morfologia e metabolismo, incluindo aumento celular, aumento da biogênese dos lisossomos e expressão de atividade de -galactosidase mais alta em pH 6 (-galactosidase associada à senescência, SA- - -Gal ) (Hayflick e Moorhead 1961; Dimri 1995). O acúmulo de células senescentes prognostica o declínio relacionado à idade natecido/órgãofunções. Para acessar a maneira de retardar ou reverter o envelhecimento, os esforços para descobrir substâncias antienvelhecimento ativas nunca cessaram.Echinacosideé um dos feniletanoides isolados de caules deMolho de Cistanches, um fitoterápico tradicional chinês, que possui potenciais atividades biológicas, tanto como anti-soro quantoanti-fadigaagente (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). Também foi relatado que se comporta in vitro como um potentegratuitamenteradicalCarniceiro(Facino et al. 1995) e exibeneuroprotetorAtividadesin vitro e in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). O echinacoside pode ser um candidato a substância antienvelhecimento, e uma atividade antienvelhecimento pode ser uma de suas propriedades biológicas. Assim, tratamos uma linha celular fibroblástica de pulmão de embrião humano senescente MRC-5 com echinacoside, esperando que pudesse retardar ou reverter a senescência.

2. Investigações e resultados

Em primeiro lugar, adicionamos echinacoside ao meio de cultura para verificar sua influência no crescimento celular e nos ciclos celulares. Observou-se que a viabilidade das células com 48 h de exposição ao echinacoside aumentou evidentemente em relação ao controle, à medida que a concentração aumentou (Fig. 1A), indicando que o echinacoside ajudou na proliferação de células senescentes. O resultado da coloração de SA-Gal mostrou que o nível de SA-Gal diminuiu obviamente após o tratamento com echinacoside (dados não mostrados), sugerindo que uma parte das células senescentes foi revertida da senescência. Para confirmar se as células senescentes foram realmente impelidas a proliferar pelo echinacoside, citometria semelhante foi introduzida para verificar a alteração da fase do ciclo celular das células MRC senescentes-5 após o tratamento com echinacoside. Em nosso estudo, observamos que com o aumento da concentração de Echinacoside, a proporção de células no período G1 foi reduzida gradativamente. Pelo contrário, mais células foram levadas a entrar na fase S e na fase G2 (Fig. 1B). O acúmulo de focos de heterocromatina associados à senescência (SAHF) é outro biomarcador específico de células senescentes (Shay e Wright 2001). As células senescentes apresentaram focos de DNA pontuados que foram visualizados por coloração de Hoechst (Fig. 1C). Em contraste, as células MRC-5 tratadas com echinacoside pareciam ter menos SAHF.

O nível de espécies reativas de oxigênio (ROS) aumenta à medida que as células se aproximam do limite de Hayfflick (Hutter et al. 2002). O tratamento contínuo de células com níveis subletais de ROS não só aumenta o nível de produtos de dano oxidativo como a lipofuscina (Sitte et al. 2001), mas também causa uma parada permanente do crescimento acompanhada pela ativação do inibidor de p53-crescimento (Toussaint et al. 2000). Portanto, no nível celular, as EROs desempenham um papel fundamental na indução da senescência. O corante fluorescente FL DCFH-DA foi usado para medir o conteúdo de ROS com citometria. Foi demonstrado que em comparação com o controle, os teores de ROS diminuíram evidentemente em células incubadas com echinacoside (Fig. 2A). Esses resultados indicam queechinacosidepode atuar como um antioxidante, diminuindo a produção de ROS ou acelerando a remoção de ROS.

As espécies reativas de oxigênio acumuladas (ROS) causam o notável comprometimento de macromoléculas nas células, incluindo proteínas, DNA e telômeros (Kovtun et al. 2007). Danos oxidativos no DNA desencadeiam a parada do crescimento G1 dependente de p53-, seguindo a expressão de p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen et al. 1998) e senescência celular em fibroblastos humanos normais. Usamos um ensaio cometa para medir o dano ao DNA e seu reparo. O tamanho dos fragmentos de DNA e o número de quebras determinam a migração e o padrão do cometa observado. O conteúdo de DNA da cauda (produto do comprimento da cauda e do conteúdo de DNA da cauda) aumenta com o dano. Nossos resultados mostram que o pré-tratamento com echinacoside pode promover parcialmente o reparo de danos no DNA, pelo menos proteger as células das lesões no DNA causadas por H2O2 (Fig. 2B). Com base nesses fatos, concluímos que o echinacoside possui atividade anti-senescência pelo menos em células MRC-5. Os resultados do nosso estudo mostram que o echinacoside pode reduzir o acúmulo de ROS, proteger as células de danos no DNA, promover as células MRC-5 da fase G1 para as fases S e G2 e, assim, melhorar a proliferação das células. De um modo geral, os efeitos do echinacoside nas células MRC-5 podem ser divididos em dois aspectos: promover a proliferação celular e reduzir o acúmulo de ROS. Embora o mecanismo preciso da senescência celular ainda seja desconhecido e a rede de regulação do ciclo celular permaneça controversa, demonstramos que o echinacoside pode proteger as células do dano oxidativo. Por isso, especulamos queechinacosidepode ser um bom candidato para regular a senescência, embora o mecanismo subjacente preciso permaneça uma questão em aberto e mais estudos estejam em andamento.

3. Experimental

3.1. Cultura de células e tratamento

A linha celular fibroblástica de pulmão de embrião humano MRC{{0}} (Instituto de Bioquímica e Biologia Celular, SIBS, CAS) foi mantida em meio essencial mínimo modificado (Gibco/BRL) e suplementada com 10% de soro fetal bovino. As células MRC-5 sofrem senescência replicativa após múltiplas passagens celulares, avaliadas pela desaceleração do metabolismo e cessação da divisão em 7 dias. Todas as culturas foram semeadas a uma densidade celular de 104/cm2, salvo indicação em contrário, e foram deixadas a proliferar, sem perturbações, durante 7 dias. Várias concentrações de echinacoside foram adicionadas 48 h antes do exame com solvente como controle, salvo indicação em contrário. A concentração de DMSO nas culturas foi inferior a 0,3 por cento (v/v). Para o tratamento com H2O2, as células foram induzidas com 250 M de H2O2 por 12 h.

3.2. Ensaio de taxa de sobrevivência

As células foram cultivadas e tratadas com echinacoside em placas de 96 poços. Antes da detecção, 10 por cento de Alamar BlueTM foi adicionado ao meio e incubado por 4 h. A absorbância foi medida com um espectrofotômetro.

3.3. Análise de citometria de fluxo

A citometria de fluxo foi introduzida para medir o conteúdo de DNA e os níveis de ROS intracelular usando iodeto de propídio e DCFH-DA, respectivamente. As células foram plaqueadas a uma densidade de 105 células/10 ml de solução celular em placas de 100 mm de diâmetro e suplementadas com echinacoside por 48 h após a semeadura das células. Após 48 h de tratamento, as células foram colhidas e lavadas em PBS após centrifugação, depois ressuspensas em solução de PBS com 0,1 por cento de RNase e 50 g/ml de iodeto de propídio ou meio de cultura contendo 10 M DCFH-DA por 30 min. Os conteúdos de DNA ou ROS foram então determinados por classificação de células ativadas por fluorescência FL em um sistema de citometria de fluxo Beckman Coulter. Os dados foram analisados ​​pelo software MultiCycle.

3.4. Coloração Hoechst

As células foram cultivadas e tratadas com echinacoside por 48 h em uma placa de 96 poços. O meio foi removido, as células foram lavadas com PBS, depois fixadas com 4% de formaldeído em PBS por 20 min, seguidas de lavagem com PBS uma vez e coradas com corante Hoechst por 10 min. As fotos foram capturadas.

3.5. Eletroforese em gel de célula única (ensaio cometa)

O ensaio do cometa foi conduzido conforme relatado (Olive e Banath 2006). Imagens individuais de cometas foram analisadas com o software CometScore. Agradecimento: Este trabalho foi financiado pelo Programa Nacional de Pesquisa Básica (Projeto 973) da China (nº 2007CB507406), a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 30572341) e o Fundo de Ciências Médicas Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008 ).